人铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人铜锌超氧化物歧化酶（hCu，Zn-SOD）原核表达载体并诱导其表达，纯化及鉴定目的蛋白，为其临床应用奠定基础。方法根据已报道的hCu，Zn-SOD基因序列，采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞（PBMC）中获得SOD cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中，重组质粒经酶切，PCR及测序鉴定正确后，将目的片段插入原核表达载体PET20b（＋）中并转化大肠杆菌DE3，通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经镍固定金属亲和层析纯化。采用邻苯三酚自身氧化法测定SOD生物学活性。结果序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465bp与GenBank（X02317）中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示表达的目的蛋白分子质量约为19kD并与商品化的人SOD单抗呈特异性反应。经Ni^2＋-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力达1300U／ml。结论在大肠杆菌中获得了人SOD的高效表达，为研究其生物学功能和广泛应用奠定了基础。     

人锰超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中的表达

目的：研究人锰超氧化物歧化酶(hMn—SOD)基因在不同大肠杆菌中的表达水平。方法：以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT—PCR扩增出hMn—SOD cDNA,构建重组质粒pSE380—MnSOD并分别转化至3种大肠杆菌DH5α、TOP10和BL21。采用SDS—PAGE和改良的连苯三酚法分别检测SOD酶蛋白及其活性。结果：hMn—SOD基因在3种大肠杆菌中都可以表达,表达量分别为菌体总蛋白质的11．9％、15．8％和30．2％。表达产物具有SOD酶活性,酶比活性分别为90．15U／mg、114．06U／mg和216．13U／mg。结论：hMn—SOD基因在不同大肠杆菌中的表达水平明显不同,在BL21中表达量较高。     

人铜锌超氧化物歧化酶真核表达载体的构建及在酿酒酵母中的分泌表达

目的:探讨酿酒酵母中人铜锌超氧化物歧化酶(hCu/Zn-SOD)的分泌表达.方法:采用RT-PCR技术从人胃总RNA中分离扩增hCu/Zn-SOD的cDNA,与酿酒酵母交配因子(MF)α信号肽编码序列融合,将融合基因插人大肠杆菌-酵母细胞穿梭型质粒pYES2.0,构建真核分泌表达质粒pYES-MS,将其转化入酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl中,用半乳糖进行诱导表达,采用SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹分析及电泳谱活性染色测定表达产物分泌情况及其活性.结果:该工程菌可高效表达一相对分子质量约为21 000的蛋白并与兔抗人Cu/Zn-SOD多抗有特异的免疫反应,同时在培养基上清中检测到此表达蛋白的分泌,具有特异性SOD酶活性.结论:作者成功构建了pYES-MS/INV菌株,该菌株大量表达有天然酶活性的hCu/Zn-SOD,并有部分hCu/Zn-SOD分泌到酵母细胞外,为开发hCu/Zn-SOD的基因工程产品奠定了良好的基础.     

重组人sCD40L功能性片段在大肠杆菌中的表达

目的 克隆sCD40L功能性片段(E107-L261)基因并在大肠杆菌体系进行表达。方法 从CD40L胞外段全长基因通过PCR方法扩增出sCD40L功能性片段(E107-L261)的基因，并在其N端融合6个组氨酸(His)；经PCR、酶以及DNA测序证实；将融合得到的sCD401L基因插入pET30a表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果 构建了pET30a-sCl340L原核表达载体；将转化菌BL21(DE3)诱导表达后经SDS-PAGE电泳以及Western Blotting鉴定显示在18kd处有sCD40L功能性片段(E107-L261)的高效表达。结论 sC1340L功能性片段基因的克隆及其表达为进一步研制其同源三聚体形式的功能性重组蛋白奠定了基础。     

重组人白血病抑制因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达并制备重组人源白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)。方法:构建p ET-30a-rh LIF表达载体并转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)之中,IPTG诱导使无标签的目的蛋白呈可溶性表达,继而利用三步柱层析纯化目的蛋白。最后对所获目的蛋白活性进行测定,并对其N端和C端的完整性分别应用Edman测序法以及质谱法进行鉴定。结果:通过三步柱层析以及中间的内毒素去除步骤可使无标签rh LIF获得纯化,检测结果提示所获目的蛋白内毒素水平<1 EU/μg,其活性同市售商品化LIF产品一致,Edman测序结果提示少部分目的蛋白N端存在甲硫氨酸修饰,质谱检测结果表明所获目的蛋白C端完整性较好。结论:建立了一种新的重组人源白血病抑制因子表达和纯化的方法,本方法不需利用标签蛋白,并可有效降低所获蛋白中内毒素水平,所获rh LIF蛋白可用于干细胞培养以及相关生物学研究。     

铜锌超氧化物歧化酶在肝癌中的定量研究

采用ＡＢＣ免疫组化法和图象分析仪检测了１７例肝细胞癌和１１例癌旁肝中ＣｕＺｎＳＯＤ的分布及含量，结果发现ＣｕＺｎＳＯＤ在癌旁肝、高分化肝癌和低分化肝癌中递次减少。肝癌和癌旁肝差异有非常显著性（Ｐ＜０．０１），但组间有一定重叠。文中对所用检测手段及肝癌和癌旁肝中ＣｕＺｎＳＯＤ的意义进行了讨论。     

重组人白细胞介素—3在大肠杆菌中表达及纯化研究

将化学合成的人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）基因与表达质粒ＰＫＫ２２３－３重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０５，重组菌在摇瓶中发酵并诱导表达，表达产量达菌体蛋白质总量的５３％么上。发酵菌经超声破碎后得到包本，经洗涤处理使包含体纯度达９０％以上。     

重组人IL-8在大肠杆菌中的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人IL-8（rhIL-8）大肠杆菌表达及纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB101，经3-吲哚丙烯酸诱导，在发酵罐中进行表达，比较不同诱导剂浓度、温度、pH值及时间，以获得最佳表达工艺参数。离心收集菌体，超声破壁，收集包涵体和胞浆，其中包涵体经变性、复性处理，与包浆部分合并，经肝素亲和层析柱、阳离子交换柱和凝胶层析柱分离纯化，比较不同的洗脱条件，得到纯品，并对重组蛋白的纯度和生物学活性进行鉴定。结果用大肠杆菌HB101在发酵罐中表达rhIL-8，在30℃、pH为7．0的条件下加入50mmol／L 3-吲哚丙烯酸，诱导28h，得到约为100mg／ml的高表达，其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在，经三步层析纯化后，得到高纯度的rhIL-8（纯度〉95％），经中性粒细胞趋化实验证实，所获IL-8具有良好的趋化白细胞迁移的作用。结论建立高效表达rhIL-8的原核表达和纯化工艺，所获的纯化IL-8具有良好的生物学活性。     

人IL-16在大肠杆菌中的融和表达

目的 将人IL－16 cDNA克隆至原核融合表达载体Pinpoint^TM Xa-3上，并进行表达研究。方法 含IL－16 cDNA的质粒IL－16／PGEM－3ZF（＋）和Pinpoint^TM Xa－3原核融合表达载体经酶切消化、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作，获得重组质粒Pinpoint^TM－IL－16，将质粒Pinpoint^TMXa-IL-16转化至大肠杆菌JM109，用IPTG诱导表达JM109工程菌，Western blotting检测表达产物。结果 IL－16 cDNA成功克隆至融合表达载体Pinpoint^TM Xa-3,Western blotting检测经诱导含有Pinpoint^TM Xa－IL－16质粒的JM109细菌，有IL－16融合蛋白的表达。结论 成功地表达了IL－16融合蛋白。     

重组人乙酰胆碱酯酶在大肠杆菌中的表达

根据基因数据库中人乙酰胆碱酯酶编码序列设计合成引物，以18周龄引产胎儿大脑组织中提取的总RNA作为模板，利用RT-PCR技术，扩增出AchE cDNA片段，该片段全长1877bp，将所得片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌JM109中，经PvuⅡ酶切鉴定，筛选阳性克隆株，其质粒测序结果与基因数据库中的人乙酰胆碱酯酶cDNA序列一致。利用Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ切下1644bp的基因片段，将其插入原核表达载体pET-28b( )的T7噬菌体启动子下游构建原核表达载体pET-28b( )-AchE，并在大肠杆菌BL21中获得表达，该蛋白分子量为59KD，以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％。     

白血病铜锌超氧化物歧化酶的初步研究

应用放射免疫法测定了早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞,白血病病人外周血白细胞,红细胞及血浆中的铜锌超氧化物歧化酶(SOD-1)含量。HL-60细胞SOD-1含量明显高于正常对照多形核粒细胞(PMN)。粒细胞白血病20例,白血病细胞SOD-1含量较正常PMN阴显升高;完全缓解(CR)9例,PMN SOD-1含量较发病组明显降低,与正常PMN比较差异不显著。淋巴细胞白血病10例,白血病细胞SOD-1含量与正常对照单个核细胞差异不显著;CR5例,MNC中SOD-1含量较发病组明显降低。急性白血病初诊时红细胞SOD-1含量下降,化疗期逐渐升高,CR后恢复正常;慢性白血病红细胞SOD-1含量与     

重组人锰超氧化物歧化酶高密度发酵培养条件研究

目的:研究发酵罐中采用乳糖诱导高效表达重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的条件。方法:通过摇瓶和发酵罐培养研究了培养基、乳糖浓度、诱导时机、表达时间、溶氧条件、补料碳源种类对rhMn-SOD表达的影响。结果:乳糖诱导浓度为0.25%,溶氧浓度为40%～60%,用葡萄糖作为补料碳源进行高密度发酵,菌体密度A600达到28.98,菌体湿重达到60g/L,Mn-SOD活性达到18222.22U/g,比活为1057.5U/mg,实现了rhMn-SOD的高效表达。结论:对培养基配方和发酵条件进行了优化,为rhMn-SOD大规模生产奠定了基础。     

超氧化物歧化酶在慢性光化性皮炎中的表达

目的:探讨超氧化物歧化酶(SOD)在慢性光化皮炎(CAD)中的作用。方法:采用化学比色法检测血清SOD值。结果:85例CAD患者血清与20例正常人做对比,t=-7.20,P<0.01,差异有显著性。结论:SOD在CAD患者中清除氧自由基能力下降。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

重组人肝细胞生长因子重链在大肠杆菌中的表达研究

目的 观察经过转录前加工、修饰后克隆至表达载体pBV220中的人肝细胞生长因子α链cDNA在肠杆菌的表达情况,优化表达条件,以建立hHGFα原核高效表达体系,并进一步研究hHGF-α蛋白的生物学功能。方法与结果 将重组表达质粒pBV220-hHGF-α转化大肠杆菌DH5a、Plyss,通过升温诱导法,即将温度由30℃升高到42℃,诱导外源基因表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测hHGF-α蛋白表达,电泳图谱显示一特异的分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带。SDS-PAGE光密度扫描对外源基因表达产物进行初步产量,表达产物分别占细菌可溶性蛋白总量的25%、30%。进一步行West-ern-blot对表达产物进行定性,外源基因表达蛋白与特异的hHGF-α抗体呈阳性反应。结论 成功地建立了hHGF-α链原核高效表达工程菌系。     

人醛缩酶A在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 用基因工程生产人醛缩酶A(ALDOA),为后续酶学研究奠定基础。方法 用Snapgene设计一对5′分别附加Nde I和Xho I位点的引物,PCR扩增ALDOA cDNA,cDNA与质粒pET-28a经Nde I+Xho I酶切后用琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA连接酶连接cDNA和pET-28a,连接产物转化大肠杆菌Top10,于卡那霉素的LB平板(LBK板)筛选抗性菌落。于LBK培养基培养抗性菌落,抽提质粒,酶切和测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选抗性菌落,于LBK培养基培养抗性菌落,0.2mmol/LIPTG,16℃诱导24h。超声破碎细胞,离心取上清,用Ni²⁺-NTA试剂盒纯化ALDOA。超滤浓缩纯化的ALDOA,用pH7.0磷酸缓冲液交换洗脱液,降低ALDOA溶液中的咪唑浓度。BCA法测定重组ALDOA浓度并保存。结果 大肠杆菌表达质粒pET-28a-ALDOA构建成功,重组菌pET-28a-ALDOA-BL21(DE3)经0.2mmol/LIPTG诱导后,ALDOA获得可溶性表达,产量达600mg/L。结论 ...     

重组人骨形态发生蛋白—2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2)，方法：hBMP-2原核表达载体pYR(pBV220-hBMP-2)转化E.coli BL21,SDS-PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析DEAE和分子筛S－300纯化重组蛋白，自然缓降复性法对其复性。结果：SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带，而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时，其表达效率较高，在此状态下，温度诱导表达4h，目的蛋白表达量最高，以后随着时间的延长，表达量销下降，重组蛋白经纯化后植入小鼠肌肉，组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生以及软骨与骨形成，结论：重组hBMP-2具有良好异位成骨活性。