上调SHI-1细胞金属蛋白酶组织抑制剂-2的表达对细胞侵袭力的影响

目的研究上调SHI-1细胞金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-2的表达对SHI-1细胞侵袭力的影响。方法实时定量PCR检测SHI-1细胞的TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2的mRNA表达,Western blot检测蛋白表达。构建TIMP-2逆转录病毒载体,转染SHI-1细胞,有限稀释法挑选出单克隆细胞S1、S2、S3。跨膜侵袭实验观察细胞侵袭力。建立裸鼠白血病模型,留取各脏器病理切片,观察人白血病细胞在各脏器中的浸润;RT-PCR检测裸鼠各脏器中人白血病细胞MLL/AF6融合基因表达。结果 SHI-1细胞TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2的mRNA表达和蛋白表达以及它的体外侵袭率均高于其他细胞株（均P〈0.05）。单克隆细胞S1、S2、S3体外侵袭率增加了1.5~2.5倍（P〈0.05）。S1、S2和S3组裸鼠较SHI-1组发病时间提前、生存期缩短（P〈0.05）。各组裸鼠多脏器病理切片均出现明显的白血病细胞浸润。各组裸鼠体内多脏器均扩增出MLL/AF6融合基因,且S1、S2和S3组裸鼠脏器累及多于SHI-1组（P〈0.05）。结论 SHI-1细胞在mRNA和蛋白水平高表达MMP-2、MT1-MMP、TIMP-2;上调TIMP-2增强了SHI-1细胞体内外的侵袭力。     

miR-181靶向TIMP3调控胆囊癌细胞迁移及侵袭的实验研究

目的 研究miR-181靶向金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)调控胆囊癌细胞迁移及侵袭的作用.方法 培养胆囊癌GBC-SD细胞,转染miR-181 mimic、阴性对照(NC)mimic、TIMP3 siRNA、NC siRNA、表达 TIMP3的重组质粒、空白质粒,荧光定量PCR检测miR-181的表达量,Western blot检测TIMP3的表达量,Transwell检测细胞迁移和侵袭活力,生物信息学分析及荧光素酶报告基因实验验证miR-181靶向TIMP3;皮下注射转染miR-181 mimic或NC mimic的GBC-SD细胞后建立荷瘤鼠模型,检测移植瘤质量及miR-181、TIMP3表达量.结果 细胞实验显示:转染miR-181 mimic促进细胞迁移及侵袭、抑制细胞中TIMP3的表达及双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力;转染TIMP3 siRNA促进细胞迁移及侵袭;转染表达TIMP3的重组质粒后,miR-181 mimic促进细胞迁移、侵袭的作用减弱.动物实验显示:转染miR-181 mimic使移植瘤的质量减轻、移植瘤中TIMP3的表达增加.结论 miR-181具有促进胆囊癌细胞迁移和侵袭的作用,靶向抑制TIMP3是介导该作用的分子机制之一.     

靶向调控miR-21-5p上调TIMP3抑制膀胱癌SCSP-571细胞ECM和EMT的机制研究

目的 探讨靶向调控miR-21-5p上调金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP3)抑制膀胱癌细胞外基质降解(ECM)和上皮间质转化(EMT)的作用效果与机制。 方法 96孔板培养膀胱癌SCSP-571细胞，分对照组、空载质粒组、miR-21-5p沉默组、TIMP3沉默组、miR-21-5p+TIMP3沉默组。对照组常规培养，空载质粒组加空载质粒共培养，miR-21-5p沉默组加入miR-21-5p inhibitor；TIMP3沉默组加入TIMP3-shRNA慢病毒感染质粒；miR-21-5p+TIMP3沉默组同时加入miR-21-5p inhibitor和TIMP3-shRNA慢病毒感染质粒。培养72 h，采用荧光定量PCR实验测定各组miR-21-5p和TIMP3的mRNA表达，WB实验测定各组ECM和EMT标志物的表达，Transwell小室实验测定各组细胞迁移能力和侵袭能力。 结果 与对照组相比，miR-21-5p沉默组E钙粘蛋白和TIMP3蛋白表达水平升高，同时N钙粘蛋白、纤维蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9蛋白表达水平，细胞迁移与侵袭能力降低；TIMP3沉默组E钙粘蛋白和TIMP3蛋白表达水平降低，同时N钙粘蛋白、纤维蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9蛋白表达水平，细胞迁移与侵袭能力升高，差异有统计学意义(均P＜0.05)。miR-21-5p+TIMP3沉默组的各项指标介于miR-21-5p沉默组与TIMP3沉默组之间，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论 靶向调控miR-21-5p能够起到抑制膀胱癌细胞侵袭与转移的效果，作用机制可能与提高了TIMP3表达，从而抑制了MMPs介导的ECM与EMT有关。      

MiR-26b通过下调COX-2表达抑制神经胶质瘤的增殖、侵袭和迁移

目的：观察不同级别神经胶质瘤中miR-26b和环氧化酶(COX)-2的表达情况,研究miR-26b对于神经胶质瘤 细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法：运用Western印迹和实时定量荧光PCR(qRT-PCR)检测不同级别神经胶质瘤中 miR-26b和COX-2的表达情况;使用miR-26b mimic转染人神经胶质瘤细胞U87,上调miR-26b的表达;qRT-PCR检测miR- 26b mimic转染后miR-26b和COX-2 mRNA的表达变化情况;双荧光素酶报告基因系统检测miR-26b对COX-2转录活性的 影响;使用Transwell侵袭实验检测miR-26b对人神经胶质瘤细胞U87侵袭能力的影响;使用划痕实验检测miR-26b对人 神经胶质瘤细胞U87迁移能力的影响;使用CCK-8(cell counting kit-8)检测miR-26对人神经胶质瘤细胞U87增殖能力的影 响;裸鼠体内成瘤实验检测过表达miR-26b后胶质瘤细胞成瘤能力的变化。结果：随着神经胶质瘤肿瘤级别的增加, miR-26b表达明显降低(P<0.05),而COX-2明显增加,差异有统计学意义(P<0.001);双荧光素酶实验证实miR-26b可以 直接靶向调控COX-2的蛋白表达水平;使用miR-26b mimic明显上调miR-26b的表达(P<0.05);上调miR-26b可以显著降 低COX-2的表达(P<0.05);上调miR-26b可以抑制神经胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力(P<0.05)。实验组和对照组相 比肿瘤的质量和体积都变小。结论：随着神经胶质瘤肿瘤级别的增加,miR-26b表达逐渐降低,而COX-2表达逐渐增 加。miR-26b可通过抑制COX-2表达从而抑制神经胶质瘤的增殖、侵袭和迁移。     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的实验研究

目的 探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)shRNA真核表达载体(pGenesil-1-MT1-MMP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响.方法 构建质粒表达载体pGenesil-1-MT1-MMP和pGenesil-1-HK;实验分为3组:空白对照组,阴性对照组(加入pGenesil-1-HK),RNA干扰(RNAi)组(加入pGenesil-1-MT1-MMP).用脂质体瞬时转染VSMC,48 h后通过荧光显微镜观察转染效果,流式细胞仪检测转染效率.于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA表达水平,用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质表达水平.结果 瞬时转染VSMC 48 h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85.5%,转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后,RNAi组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调(P<0.05).结论 靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC,并能有效下调MT1-MMP基因mRNA和蛋白的表达.     

HIF-1α siRNA对非小细胞肺癌A549细胞TIMP1、MMP1表达的影响

目的 探讨HIF-1α基因沉默对非小细胞肺癌(NSCLC) A549细胞基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)、基质金属蛋白酶抑制剂1(matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP1)表达的影响。 方法 将siRNA-HIF-1α质粒载体稳定转染至A549细胞中,于缺氧环境下培养。应用MMT法和Transwell试验分别检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力。应用qRT-PCR和蛋白免疫印迹分别检测转染细胞内TIMP1、MMP1 mRNA和蛋白表达水平。 结果 与Control组相比,A549组HIF-1α mRNA和蛋白表达显著增加(均P<0.05)。与Blank组和si-NC组相比,si-HIF-1α组HIF-1α mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组在转染24、48和72 h后细胞增殖率均显著降低(均P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组A549细胞在转染24 h后的迁移和侵袭数量均显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组细胞内MMP1表达水平显著降低,而TIMP1表达水平显著增加(均P<0.05)。 结论 在缺氧状态下,HIF-1α siRNA靶向沉默HIF-1α在A549细胞内的表达,并可以通过下调MMP1表达和上调TIMP1的表达而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。      

膜型基质金属蛋白酶-1在肝癌组织中的表达及意义

[目的]比较膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type-1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP)在大肝癌(瘤体直径＞3 cm)及小肝癌(单肿瘤结节且瘤体直径≤3 ca)组织中的表达差异,并探讨其在肝癌肿瘤细胞浸润、转移过程中的作用.[方法]应用半定量RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA在22例大肝癌及12例小肝癌组织中的表达;应用免疫组化方法检测MT1-MMP蛋白在53例大肝癌及40例小肝癌组织中的表达,并分析MT1-MMP蛋白表达水平与肝癌浸润、转移之间的关系.[结果]MT1-MMP蛋白在大、小肝癌组织中的表达差异显著(P=-0.007),但其mRNA水平的差异无统计学意义(P=0.693);MT1-MMP蛋白表达水平与肝癌浸润及转移之间均呈正相关关系(P=0.021;P=-0.001).[结论]调控MT1-MMP蛋白在肝癌组织中异常表达的关键环节可能是在转录后水平进行,大肝癌肿瘤细胞的侵袭能力较小肝癌强与其高表达MT1-MMP蛋白有关.     

低表达miR-27a对胶质瘤细胞侵袭和凋亡的影响

目的 探讨下调miR-27a表达后对U87胶质瘤细胞的影响。方法 常规培养U87细胞系,分别用慢病毒干扰质粒miR-27a-3p、miR-27a-5p转染U87细胞（Lt-I）,同时设立无义序列转染组（Lt-NC组）和空白对照组。通过嘌呤霉素处理后筛选出稳定感染的U87胶质瘤细胞。采用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后miR-27a-3p、miR-27a-5p在U87细胞系中的表达水平,划痕实验、Transwell侵袭试验检测胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力,Western blot法分析转染后的侵袭和凋亡的变化,流式细胞术分析转染前后细胞凋亡的变化,磁共振成像（MRI）和裸鼠皮下胶质瘤模型分析裸鼠肿瘤的形态、直径等特征及随时间的变化规律。结果 相对于未感染慢病毒的空白U87胶质瘤细胞,稳定感染Lt-I的U87胶质瘤细胞miR-27a表达明显下调,同时迁移、侵袭能力降低,而感染Lt-NC组（阴性对照组）则未见此改变。Western blot法检测结果显示,低表达miR-27a细胞侵袭能力降低,同时也促进细胞凋亡。流式细胞术结果显示,敲减miR-27a后,细胞凋亡率增高。磁共振成像（MRI）和裸鼠皮下胶质瘤模型显示,实验组裸鼠肿瘤的生长明显受到抑制。结论 敲减miR-27a可抑制人脑胶质瘤细胞系U87细胞的迁移、侵袭,促进其凋亡,同时抑制其成瘤能力,这可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

姜黄素通过miR-181a调控KLF6表达抑制骨肉瘤细胞的生长

目的：探讨姜黄素通过微小RNA-181a(miR-181a)调控锌指蛋白Kruppel样因子6(KLF6)表达对骨肉瘤细胞生长的影响。方法：体外培养骨肉瘤细胞系U2OS细胞,将U2OS细胞分为对照组（不作处理）、姜黄素组（终浓度分别为5, 10, 20μmol/L姜黄素）、miR-181a阴性对照（miR-NC）组、miR-181a模拟物（miR-181a mimics）组、姜黄素（20μmol/L）+NC组、姜黄素（20μmol/L）+miR-181a mimics组,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法与平板克隆形成实验检测各组U2OS细胞增殖情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-181a与KLF6 mRNA表达情况;蛋白印迹分析法检测各组U2OS细胞KLF6、细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Cyclin D1表达变化;双荧光素酶报告实验验证miR-181a与KLF6的靶向关系。结果：与对照组相比,随着姜黄素浓度升高,U2OS细胞存活率、细胞平板克隆形成率、Cyclin D1、Cyclin B1蛋白、miR-181a表达水平逐渐降低,KLF6表达水平逐渐升高,...     

镁钙合金浸提液对人结肠黏膜上皮细胞中基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶抑制因子3表达的影响

目的研究不同浓度镁钙合金浸提液对人结肠黏膜上皮细胞NCM460中基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶抑制因子3(TIMP3)表达的影响。方法用镁钙合金制成不同浓度(体积分数10%、50%和100%)的浸提液,并将NCM460细胞制成5×10~6L~(-1)的细胞悬液,分为空白对照组及实验1、2、3组,空白对照组每孔加入含体积分数10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔高糖培养基2 000μL,实验1、2、3组每孔分别加入体积分数10%、50%及100%的镁钙合金浸提液2 000μL,分别培养1、3、5 d,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测NCM460细胞中MMP9和TIMP3 mRNA的表达,免疫印迹法检测NCM460细胞中MMP9和TIMP3蛋白表达。结果培养1 d后,实验1、2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA、TIMP3 mRNA表达水平均显著低于空白对照组(P<0.05);培养3、5 d后,实验1组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平仍显著低于空白对照组(P<0.05),实验2、3组NCM460细胞中MMP9mRNA表达水平均显著高于空白对照组和实验1组(P<0.05);培养5 d后,实验3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平显著高于实验2组(P<0.05)。培养3、5 d后,实验1、2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著高于培养1 d后;培养5 d后,实验1组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平与培养3 d后比较差异无统计学意义(P>0.05),实验2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著高于培养3 d后(P<0.05)。培养1 d后,实验2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著高于实验1组(P<0.05)。培养3 d后,实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),实验2组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著低于实验1、3组(P<0.05)。培养5 d后,实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。实验1组NCM460细胞中培养3、5 d后的TIMP3 mRNA表达水平均显著高于培养1 d后(P<0.05),培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养3 d后(P<0.05)。实验2组NCM460细胞中培养3 d后的TIMP3mRNA表达水平显著低于培养1 d后(P<0.05),培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养1、3 d后(P<0.05)。实验3组NCM460细胞中培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养1、3 d后(P<0.05)。培养5 d后,实验1组NCM460细胞中MMP9蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);实验2、3组NCM460细胞中MMP9蛋白表达水平均显著高于空白对照组和实验1组(P<0.05);实验3组NCM460细胞中MMP9蛋白表达水平与实验2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养5 d后,实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05);实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3蛋白表达水平两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论高浓度的镁钙合金浸提液对NCM460细胞中的MMP9及TIMP3基因表达有一定的影响,容易导致早期炎症反应的发生,其机制可能与浸提液中的钙离子浓度有关。     

MicroRNA-25表达下调对神经胶质瘤U87细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨microRNA-25（miR-25）表达下调对神经胶质瘤U87 细胞增殖与凋亡的影响,以及miR-25 与B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2 基因（Bcl-2）在胶质瘤细胞增殖与凋亡过程中的调节作用。方法通过慢病毒介导反义miR-25 寡聚核苷酸转染U87 细胞;分为3 组,实验组（转染anti-miR-25）、对照组（转染negative control）和空白组（空白PBS）;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-25 和Bcl-2 的mRNA 表达水平;CCK-8 法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果实验组miR-25 和Bcl-2 的mRNA 表达量与空白组和对照组比较,差异具有统计学意义（P <0.05）,实验组降低;实验组相对于空白组和对照组,细胞增殖活性降低,细胞周期延缓,细胞凋亡率升高。结论在胶质瘤U87 细胞,miR-25 表达下调通过作用于Bcl-2 靶基因,延缓细胞周期,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

MicroRNA-34a inhibits human brain glioma cell growth by down-regulation of notch1

The effects of microRNA-34a (miR-34a)-regulated Notch1 gene on the proliferation and apoptosis of the human glioma cell line U87 were investigated in this study. The U87 cells were divided into miR-34a mimics, negative control, mock transfection and blank control groups in terms of different treatments. In miR-34a mimics group, human U87 glioma cells were transfected with miR-34a mimics by using lipofectamine 2000. The cells transfected with nonsense microRNA were set up as negative control group. Those treated with lipofectamine 2000 only were designated to the mock tranfection group. In the blank control group, the cells were cultured routinely and no treatment was given. The expression of miR-34a and Notch1 was detected by using real-time RT-PCR. Western blotting was employed to monitor the change in Notch1 protein. Cell proliferation and apoptosis were measured by CCK-8 and flow cytometry. The results showed that the proliferative ability of U87 cells was significantly reduced and the apoptotic cells increased in miR-34a mimics group relative to control groups. The expression of miR-34a was significantly up-regulated in mimics group as compared with control groups (P<0.05). Furthermore, Notch1 protein levels were significantly decreased in miR-34a mimics group when compared with control groups (P<0.05), but the mRNA expression of Notch1 showed no significant difference among these groups. It was concluded that miR-34a may suppress the proliferation and induce apoptosis of U87 cells by decreasing the expression of target gene Notch1, suggesting that miR-34a may become a promising gene therapeutic target for brain glioma.     

MiR-148a-3p靶基因的预测与验证

目的:预测和验证miR-148a-3p的靶基因.方法:利用生物信息学方法预测miR-148a-3p的靶基因;在神经胶质瘤细胞U87/U251中建立miR-148a过表达及抑制表达稳定细胞系.利用qPCR实验验证miR-148a-3p与靶基因的靶向关系;利用Western Blot实验检测靶蛋白表达水平.结果:生物信息学方法预测结果显示dynein light chain LC8-type 2(DYNLL2)为miR-148a-3p靶基因之一;qPCR实验结果显示DYNLL2在神经胶质细胞HA1800与神经胶质瘤细胞U87/U251中的表达有差异,在神经胶质瘤细胞miR-148a过表达及抑制表达的细胞中表达有差异;Western Blot实验结果显示DYNLL2的蛋白表达水平在神经胶质细胞HA1800与胶质瘤细胞U87/U251中有差异.结论:miR-148a-3p与DYNLL2有确切的靶向关系,DYNLL2在神经胶质细胞与胶质瘤细胞中均有表达,与正常胶质细胞相比,DYNLL2在神经胶质瘤细胞中表达下调,包括基因水平和蛋白水平,miR-148a-3p能够负向调控DYNLL2的表达.     

外源性FHIT基因对人胶质瘤细胞U87增殖与凋亡的影响

目的探讨外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对胶质瘤细胞系U87增殖和凋亡作用的影响。方法通过脂质体介导将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B-FHIT和空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B分别转染胶质瘤细胞系U87。实验细胞分U87-FHIT组(转染FHIT基因的U87细胞)、U87-vector组(转染空载体质粒的U87细胞)和空白对照组(亲本U87细胞)。Western blot和免疫荧光染色检测外源性FHIT蛋白的表达;MTT法及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果U87-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于U87-vector组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外源性FHIT基因表达能诱导U87细胞凋亡,抑制其生长,具有抗胶质瘤作用。     

阿托伐他汀抑制脑胶质瘤细胞的增殖和促进凋亡：基于上调miR-146a表达与抑制PI3K/Akt信号通路

目的 探究阿托伐他汀（AVT）对人脑胶质瘤细胞生物学行为的影响及其对miR-146a/PI3K/Akt信号通路的作用。方法 将人脑胶质瘤细胞U251分为4组：对照组（Conrtrol）、AVT组、AVT+转染miR-146a无关片段组（AVT+miR-146a NC）、AVT+转染miR-146a干扰组（AVT+miR-146a inhibitor）。Control组不加任何药物,AVT组加入8.0 μmol/L 的AVT,AVT+miR-146a NC组转染miR-146a NC后加入8.0 μmol/L 的AVT,AVT+miR-146a inhibitor组转染miR-146a inhibitor后加入8.0 μmol/L 的AVT。RT-PCR检测miR-146a表达,MTT检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移情况,Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。结果 药物干预48 h,与Control组相比,AVT组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）,细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均明显降低（P<0.01）。与AVT组相比,AVT+miR-146a inhibitor组细胞miR-146a表达、细胞凋亡率均明显降低（P<0.01）,细胞增殖率、侵袭指数、迁移指数、p-PI3K 和p-Akt蛋白表达均明显升高（P<0.01）,AVT+miR-146a NC组上述指标无显著性差异（P>0.05）。结论 AVT能够抑制人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡,其机制与上调miR-146a表达,抑制PI3K/Akt信号通路相关。     

miR-638通过靶向调控Notch 4促进神经胶质瘤细胞的侵袭能力

目的 研究微小RNA-638(miR-638)在恶性胶质瘤中的表达,探讨miR-638在胶质瘤细胞侵袭过程中的作用及可能机制.方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测正常神经组织、胶质瘤组织、正常胶质细胞株、胶质瘤细胞株中miR-638的表达水平;Transwell实验检测分别转染miR-638模拟物和miR-638抑制物后U251细胞侵袭水平的改变;生物信息学预测和验证miR-638对Notch 4的靶向调控关系;构建Notch 4真核表达重组质粒(pCMV-Notch 4 cDNA)过表达U251细胞中的Notch 4表达水平,并检测U251细胞侵袭水平的改变.结果 miR-638在胶质瘤组织和细胞株中表达上调,而Notch 4在胶质瘤细胞中表达下调,两者表达呈负相关性;过表达miR-638使U251细胞的侵袭细胞数上升(P<0.01),而抑制miR-638表达后U251细胞的侵袭细胞数减少(P<0.01);miR-638在U251细胞中能直接靶向抑制Notch 4的表达,提升Notch 4在U251细胞中的表达能使侵袭细胞数减少(P<0.01).结论 miR-638在胶质瘤中高表达,其可能通过靶向抑制Notch 4的表达促进胶质瘤细胞的侵袭能力.     

MiR-181a靶向RASSF1A促进骨肉瘤细胞的生长和转移

目的：探讨miR-181a是否靶向调控抑癌基因RAS相关区域家族1A(Ras-association domain family 1,isoform A,RASSF1A),从而促进骨肉瘤细胞的生长和转移。方法：采用real-time PCR检测30例人骨肉瘤组织及其癌旁正常骨组织中miR-181a的表达,并分析miR-181a表达水平与骨肉瘤患者临床病理特征的相关性。在骨肉瘤细胞MG-63中瞬时转染miR-181a模拟物和miR-181a抑制剂,分别采用MTT和transwell检测miR-181a对骨肉瘤细胞生长和转移的作用。随后,预测并通过双荧光素酶报告基因验证miR-181a与RASSF1A基因3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)的特异性结合作用。结果：与癌旁正常骨组织比较,miR-181a在骨肉瘤组织中高表达(P<0.001),但其表达水平与骨肉瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤病理分期等无明显相关性(P>0.05)。MTT及transwell结果显示过表达miR-181a促进了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著高于阴性对照组(P<0.05);而抑制miR-181a的表达降低了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著低于阴性对照组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-181a可靶向结合RASSF1A基因3'-UTR,从而调控RASSF1A的表达。结论：miR-181a可特异性结合RASSF1A基因3'-UTR,下调RASSF1A基因的表达,从而促进人骨肉瘤细胞MG-63的生长和转移。     

慢病毒介导的miR-27a下调对U87胶质瘤细胞的影响

目的:探讨下调miR-27a对U87胶质瘤细胞的影响?方法:分别用慢病毒干扰质粒miRZip-27a anti-miR-27a microRNA construct或慢病毒空质粒pGreenPuro Scramble Hairpin Control-Construct与慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞,获得慢病毒颗粒命名为Lt-I和Lt-NC?然后分别用慢病毒Lt-I和Lt-NC感染U87胶质瘤细胞,通过流式细胞仪筛选出稳定感染的U87胶质瘤细胞?通过定量PCR法分别检测稳定感染的U87细胞和未感染的空白U87细胞miR-27a,CCK-8法检测胶质瘤细胞增殖情况,Transwell侵袭试验检测胶质瘤细胞的侵袭能力?结果:相对于未感染慢病毒的空白U87胶质瘤细胞,稳定感染Lt-I的U87胶质瘤细胞miR-27a表达明显下调?细胞增殖减缓?侵袭能力降低,而感染Lt-NC组(阴性对照组)则未见此改变?结论:miR-27a的下调能有效抑制U87胶质瘤细胞的增殖,降低U87胶质瘤细胞的侵袭能力?     

沉默ZEB1基因对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的影响

目的：探讨沉默锌指E盒结合同源框1（ZEB1）基因对胶质瘤U87细胞间质标志物表达和细胞迁移的作用,阐明ZEB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。方法：将构建的ZEB1短发夹RNA（shRNA）干扰质粒（shZEB1#1和shZEB1#2）和对照质粒（shCtrl）转染至胶质瘤U87细胞,Western blotting法检测干扰效果。将胶质瘤U87细胞分为对照组（转染shCtrl的胶质瘤U87细胞）、EMT组[转染shCtrl的胶质瘤U87细胞用转化生长因子β1（TGF-β1）诱导EMT]和ZEB1基因沉默组（转染shZEB1的胶质瘤U87细胞用TGF-β1诱导EMT）。Western blotting法检测各组细胞中间质标志物（N-钙黏蛋白和波形蛋白）及基质金属蛋白酶9（MMP-9）的蛋白表达水平,划痕愈合实验检测各组细胞的迁移率。结果： Western blotting法检测,转染shZEB1#1和shZEB1#2的胶质瘤U87细胞中ZEB1蛋白表达水平较转染shCtrl的细胞明显降低（P<0.05或P<0.01）,shZEB1#2对ZEB1表达的抑制效果更明显,表明ZEB1已稳定转染到U87细胞。与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞中N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）;与EMT组比较,ZEB1基因沉默组N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。EMT组细胞迁移率明显高于对照组（P<0.01）,而ZEB1基因沉默组细胞迁移率明显低于EMT组（P<0.01）。结论：沉默ZEB1基因表达可抑制胶质瘤U87细胞EMT,并降低细胞迁移能力,提示ZEB1可作为侵袭性胶质瘤治疗的重要靶标。