牙龈卟啉单胞菌感染对牙龈上皮细胞中基质金属蛋白酶13表达的影响

 目的 通过体外建立牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）感染牙龈上皮细胞模型,探讨P. gingivalis W83、ATCC 33277感染牙龈上皮细胞后基质金属蛋白酶13（MMP-13）表达的变化。方法 将P. gingivalis W83、ATCC 33277作用于牙龈上皮细胞6、12、24和48 h,采用ELISA检测上清液中MMP-13蛋白浓度变化,实时PCR 检测MMP-13 mRNA相对含量变化。结果 P. gingivalis感染牙龈上皮细胞后,MMP-13蛋白和mRNA表达的总体趋势随时间的延长表达水平逐渐增高。P. gingivalis感染牙龈上皮细胞6和12 h后, P. gingivalis ATCC 33277感染组和W83感染组MMP-13蛋白表达水平与对照组相比无明显差异,而MMP-13 mRNA的相对表达量高于对照组（P＜0.05）;感染24和48 h后,P. gingivalis ATCC 33277感染组和W83感染组MMP-13蛋白和mRNA的相对表达量均明显高于对照组（P＜0.05）,且P. gingivalis W83感染组MMP-13明显高于P. gingivalis ATCC 33277感染组（P＜0.05）。结论 P. gingivalis能够促进牙龈上皮细胞分泌MMP-13,造成牙周组织破坏。P. gingivalis W83降解细胞外基质的能力高于P. gingivalis ATCC 33277,更利于细菌向深部组织扩散。     

牙龈卟啉单胞菌促进动脉粥样硬化的机制研究

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)加速载脂蛋白E基因敲除(ApoE^-/-)小鼠动脉粥样硬化(AS)形成的分子生物学机制。 方法 ApoE^-/-小鼠分为对照组和P. gingivalis感染组,每周通过尾静脉注射磷酸盐缓冲液或P. gingivalis活菌1次,共10次。末次注射后24 h,检测血液中炎症细胞因子水平; 测量主动脉粥样斑块面积,分析主动脉血管壁的炎症因子、Toll样受体-2(TLR-2)和TLR-4表达水平以及核因子-κB(NF-κB)的活化水平。 结果 与对照组比较,P. gingivalis感染组主动脉粥样斑块面积增加; P. gingivalis感染后,血液中肿瘤坏死因子(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)的水平显著增加; 免疫组织化学显示,P. gingivalis感染后主动脉组织TNF-α和MCP-1表达水平显著增加; 免疫印迹显示,P. gingivalis感染导致主动脉组织TLR-2和TLR-4表达增加; EMSA显示,P. gingivalis感染后血管壁NF-κB信号活性增加。 结论 P. gingivalis通过TLRs/NF-κB信号通路,促进血管壁局部和全身炎症反应,加速ApoE^-/-小鼠AS形成。     

羧甲基壳聚糖银对牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用

目的：研究羧甲基壳聚糖银 (CMCT-Ag⁺) 对牙龈卟啉单胞菌 (Pg) 的抑制作用,为研制高效无毒的抗牙周病药物提供实验依据。方法：将壳聚糖经碱化、氯乙酸修饰和离子交换制成 CMCT-Ag⁺。采用琼脂扩散和固体平板二倍稀释法观察抑菌环直径和菌 斑数,测定 CMCT-Ag⁺ 对 Pg的抑制作用。结果：获得了粉红色的 CMCT-Ag⁺ 粉末,收率为 89.4%,取代度为 0.98,银离子含量为10.21%。在抑菌环实验中,当CMCT-Ag⁺的浓度大于 0.3125 g•L^-1 时,其抑菌环直径随浓度的增加而增大,其中 40 g•L^-1CMCT-Ag⁺ 抑菌环直径可达 9.5 mm,与 0.005 g•L^-1 替硝唑相当;当 CMCT-Ag⁺ 浓度大于 40 g•L-1 时,抑菌环直径明显下降,表明 CMCT-Ag⁺ 的抑菌范围为大于 0.3125 g•L^-1。在菌斑实验中,当 CMCT-Ag⁺ 浓度大于 0.3125 g•L^-1 时,培养基表面 Pg 的生长明显受到抑制;而当浓度大于 1.25 g•L^-1 时,培养基表面无 Pg 生长,表明 CMCT-Ag⁺ 最低抑菌浓度为1.25 g•L^-1。结论：CMCT-Ag⁺ 对 Pg 的生长有明显抑制作用,可用于进一步研制治疗牙周炎药物。     

牙龈卟啉单胞菌牙龈素在牙周炎发病信号通路的研究进展

牙周炎是口腔临床实践中最为常见的疾病之一。革兰阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌与牙周炎密切相关,牙龈卟啉单胞菌表面的牙龈素（gingipains）和脂多糖被认为是其最重要的毒力因子,是近年来牙周炎机制研究热点,引起研究者的广泛关注。本文结合近年来的研究进展,就牙龈卟啉单胞菌牙龈素引起牙周炎症的机制和所涉及的信号通路作一综述。     

牙龈卟啉单胞菌与非口腔疾病关系的研究进展

牙龈卟啉单胞菌是常见的牙周致病菌。近来,大量证据表明牙龈卟啉单胞菌不仅是口腔中常见致病菌,而且与非口腔疾病密切相关,包括炎症性肠炎、癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病、类风湿关节炎、糖尿病、早产及非酒精性肝炎等。本文就近年来关于牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌与非口腔疾病关系的研究进展进行综述,有助于判别牙龈卟啉单胞菌是否可作为这些非口腔疾病的辅助诊断标记和潜在治疗靶标,进而有利于开发相关疾病的治疗策略。     

牙龈卟啉单胞菌特异性单克隆抗体的制备

目的 制备特异性识别牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)。方法 ①采用杂交瘤的方法制备m Ab,用P.g重组血凝素2(recombinant Hemagglutinin 2,r HA2)免疫BALB/c小鼠,间接ELISA筛选特异性识别P.g的杂交瘤细胞株;②间接ELISA检测mAb的效价及识别P.g的特异性、敏感性。结果 筛选到5株特异性识别P.g的m Abs,C10、F3、F3-2、G3和G3-2。其中,C10、G3和G3-2免疫球蛋白亚类为IgG2a型;F3和F3-2免疫球蛋白亚类为IgG1型。mAb C10、G3、F3和F3-2识别P.g的效价均1∶128 000;mAb G3-2识别P.g的效价1∶16 000;5株mAb识别r HA2的效价均1∶128 000。5株mAb均特异性识别5×105cfu/mL的P.g ATCC33277。结论 制备了5株特异性识别P.g的mAb,可用于各种免疫学技术,为开发P.g检测工具提供了条件,对牙周病的诊断和治疗有一定的意义。     

蜂胶对牙龈卟啉单胞菌及牙龈成纤维细胞的影响

目的了解蜂胶对牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingival，Pg）生长的抑制作用及对人牙龈成纤维细胞的毒性作用。方法采用液体稀释法测定蜂胶对Pg的最小杀菌浓度（MBC），用MTT法测定不同浓度蜂胶作用24h后牙龈成纤维细胞的细胞相对增殖率（RGR），了解蜂胶作用24h后细胞连续7d的增殖回复情况。结果蜂胶对取的MBC为1．56g／L，相当于0．125～0．25mg／L的奥硝唑。蜂胶浓度为MBC时RGR达到70％以上；4g／L蜂胶组的RGR为52．1％，作用细胞24h后，连续7d细胞数持续增加，吸光度逐渐接近阴性对照组。结论蜂胶对Pg的生长有显著抑制作用，且细胞毒性较小，毒性作用可逆。     

巨噬细胞极化及牙龈卟啉单胞菌对其极化调控的研究进展

牙龈卟啉单胞菌(Pg)是慢性牙周炎的重要病原菌,其毒力部分来自细菌细胞壁及产物,如脂多糖、菌毛、荚膜多糖和牙龈蛋白酶。这些化学成分在诱导宿主先天和后天的免疫反应中起重要的作用,如诱导巨噬细胞的极化和炎性细胞因子的释放。极化的巨噬细胞对炎症的进展、组织的破坏和炎症的抑制、损伤组织的修复与重建等具有重要作用。该文就巨噬细胞的极化特点以及Pg对巨噬细胞极化的影响进行综述,为牙周病的防治寻找新的途径。     

常用抗厌氧菌药物对牙龈卟啉单胞菌的体外抗菌活性研究

目的 研究口腔临床常用抗菌药物对牙周炎主要病原菌牙龈卟啉单胞菌（Pg)的抗菌活性。方法 用从成人牙周炎患者龈下菌斑中分离的、通过PCR鉴定的106株Pg临床分离株,采用琼脂稀释法测定了甲硝唑、克林霉素和替硝唑对三种不同浓度Pg菌液的最小抑菌浓度（MIC）。结果 上述药物对Pg的MIC范围依次是≤0.25-8mg/L,≤0.06-8mg/L和≤0.06-4mg/L,MIC90依次为8mg/L,8mg/L,4mg/L.10^5CPU/ml,10^6CFU/ml和10^8CPU/ml三种菌液浓度对实验结果无明显影响。结论 Pg对这三种药都非常敏感,敏感性大小依次为替硝唑、克林霉素和甲硝唑。     

牙龈卟啉单胞菌定植对钛表面氧化膜特性的影响

目的:研究牙龈卟啉单胞菌定植对钛表面氧化膜特性的影响?方法:将纯钛试件浸泡于牙龈卟啉单胞菌菌悬液中进行共培养,采用扫描电镜观察钛表面牙龈卟啉单胞菌生物膜的微结构?以牙龈卟啉单胞菌菌悬液为实验组,生理盐水为对照组,收集7?14?21 d的试件和浸泡液,采用X射线光电子能谱(XPS)分析浸泡后纯钛的表面特性,采用电感耦合-等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测不同时间点浸泡液中的钛离子释放量?结果:扫描电镜观察到牙龈卟啉单胞菌在钛表面定植形成致密的生物膜?XPS广谱分析显示,钛表面的钛和氧元素含量随细菌作用时间延长逐步降低;XPS高像素谱分析显示,钛表面的二氧化钛含量随细菌作用时间延长逐步降低?ICP-OES检测发现随着细菌作用时间的延长,钛离子释放量增加,且第1周释放量最多?结论:牙龈卟啉单胞菌能在钛表面定植形成致密生物膜,引发钛表面氧化膜破坏和钛离子释放,该效应随细菌作用时间延长而加剧?     

牙龈卟啉单胞菌临床分离株的生化反应检测与分析

目的 以模式菌株作为对照,对口腔中牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）临床菌株进行生化反应检测,初步探讨其糖代谢性质。方法 利用API 20A和ATB Rapid ID 32A生化反应检测系统,以模式菌株W83和ATCC 33277为对照,对5株P.gingivalis临床分离菌株SJD2、SJD4、SJD5、SJD11、SJD12进行生化代谢反应检测和分析。结果 5株P.gingivalis临床菌株均具有β-半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性;具有水解多种氨基酸残基的能力,并能水解游离的色氨酸和精氨酸;各菌株的生化反应存在异质性。API 20A与ATB Rapid ID 32A生化反应板条的检测结果存在一定差异。结论 P.gingivalis可以多肽或氨基酸作为主要碳源或氮源,但存在部分糖代谢的能力;各菌株的生化代谢反应存在差异。ATB Rapid ID 32A可能更适合应用于龈下菌斑中革兰阴性厌氧菌的生化反应检测和鉴定。     

牙龈卟啉单胞菌FtsZ降解试验模型-clpP基因缺失株的构建

目的 建立牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZ （FtsZPg）体内降解试验模型,即构建蛋白酶编码基因clpP缺失的E.coli MG1655.方法 将一段两端含靶基因同源臂的PCR产物电转入L-阿拉伯糖诱导后表达λ噬菌体重组蛋白、具有较强重组能力、含质粒pKD46的菌株E.coli MG1655感受态细胞,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因.结果 利用氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,得到E.coli MG1655的ClpP蛋白酶基因敲除突变株.通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序最终鉴定阳性clpP基因缺失株.结论 本试验成功构建了E.coli MG1655 clpP敲除株;该敲除株有望在探讨重要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZPg与蛋白酶clpP的关系中发挥一定作用.     

贵阳腐霉类胰蛋白酶纯化的初步研究

目的对贵阳腐霉(Pythium guiyangense)类胰蛋白酶(trypsin-like protease,Pr2)进行初步的分离、纯化。方法将该菌诱导24h后获得的粗酶液,经过PEG20000的包埋浓缩、透析,和两次SephadexG-100凝胶层析后,进行SDS-PAGE电泳检测和分子量测定。结果纯化的Pr2蛋白酶经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示为单一条带,分子量为31.5kDa。结论本研究初步纯化了贵阳腐霉Pr2蛋白酶,测得分子量为31.5kDa,为针对贵阳腐霉Pr2蛋白酶的进一步研究有重要意义。     

牙龈卟啉单胞菌感染兔动脉粥样硬化模型的建立

目的建立牙龈卟啉单胞菌(P.g)感染致无症状菌血症的兔髂动脉粥样硬化模型。方法P.g标准菌株ATCC33277体外培养。12只新西兰大白兔适应性喂养1周后,经兔髂动脉球囊损伤术,建立单侧动脉粥样硬化模型。于术后1周,标准菌株P.g按每只1×107CFU/100μL经耳静脉接种于动脉粥样硬化兔,同时给予或不给予高脂饮食。12周后取材,观察兔髂动脉的内膜组织病理学改变,检测动脉粥样斑块上P.gDNA存在情况。结果兔单侧髂动脉经球囊剥脱术均形成了稳定的内膜增生灶和动脉狭窄。小剂量P.g静脉注射后,所有动物均未见临床感染标志和死亡发生,可模拟无症状菌血症模型;在兔静脉血和动脉斑块上均可检测到P.gDNA的存在。结论兔髂动脉球囊剥脱术后,给予或不给予高脂饮食,通过小剂量P.g静脉注射,可建立伴无症状菌血症的兔动脉粥样硬化模型。     

抑制消减杂交技术分析牙龈卟啉单胞菌基因差异初探

目的:对比牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)低毒力株标准参考菌ATCC 33277与高毒力株W83之间的差异核苷酸序列,查找高毒力株W83缺失基因。方法:抑制消减杂交技术对比牙龈卟啉单胞菌低毒力株标准参考菌ATCC 33277与高毒力株W83的基因差异。以低毒力株ATCC 33277为tester,高毒力株W83株为driver,将提取的基因组DNA用内切酶RsaⅠ酶切,连接特殊设计的adaptor进行两次消减杂交和PCR扩增,并与TA克隆载体连接,转化到JM109中,建立差异消减文库,经PCR筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析。结果:经SSH筛选鉴定得到62个片段大小为125～632bp的阳性克隆基因片段。结论:这些差异基因为研究牙周病的发生和发展提供重要线索。     

丝线结扎及局部涂抹牙龈卟啉单胞菌对小鼠牙槽骨骨吸收的影响

目的： 比较丝线结扎和涂抹牙龈卟啉单胞菌诱导小鼠牙周炎模型的牙槽骨骨吸收程度、激活破骨细胞及去除诱因后成骨的过程。方法： 48只C57BL6小鼠随机分配,采用分口设计,根据涂抹2%（质量分数）羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose, CMC）或109个菌落形成单位（colony-forming units, CFU）的牙龈卟啉单胞菌以及是否丝线结扎分为4组（n= 24）,分别为对照组（右上第二磨牙单纯涂抹CMC）、丝线结扎组（围绕左上第二磨牙结扎9-0丝线）、涂菌组（右上第二磨牙单纯涂抹牙龈卟啉单胞菌）和丝线结扎+涂菌组（结扎左上第二磨牙并涂抹牙龈卟啉单胞菌）,测量釉牙骨质界至牙槽骨嵴顶（cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC）的距离,监测牙槽骨的吸收。48只C57BL6小鼠设计和分组同上,牙槽骨骨面的破骨细胞采用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色并计数。36只C57BL6小鼠随机分配,其中30只小鼠在左侧上颌第二磨牙结扎9-0丝线,观察3周,有12只小鼠在丝线结扎1周后拆除丝线,继续观察2周,分别在丝线结扎1、2、3周以及丝线拆除1周和2周共5个时间点（n=6）各处死6只小鼠,检测CEJ-ABC距离;未行丝线结扎的小鼠CEJ-ABC距离（n=6）为基线水平。采用单因素方差分析（ANOVA）法对所有数据进行统计学分析。结果： 丝线结扎组的小鼠牙周炎,在3、6、9和12周后的CEJ-ABC距离分别为（0.16±0.04） mm、（0.16±0.02） mm、（0.18±0.03） mm、（0.17±0.02） mm,与对照组［（0.09±0.03） mm、（0.10±0.01） mm、（0.12±0.04） mm、（0.12±0.01） mm］和涂菌组［（0.09±0.03） mm、（0.12±0.01） mm、（0.12±0.02） mm、（0.10±0.01） mm］相比差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组［（0.09±0.03） mm］相比,丝线结扎组第3周的CEJ ABC距离为（0.16±0.04） mm,比涂菌组［（0.09±0.03） mm］诱导的牙槽骨骨吸收更迅速,丝线结扎和涂抹牙龈卟啉单胞菌结合并未进一步增加牙槽骨的吸收破坏。在丝线结扎1 d后,牙槽骨表面的破骨细胞即被激活,与对照组［（2±2）个］相比在第3天达到高峰［（12±4）个,P<0.01］。丝线结扎诱导的小鼠牙周炎,在丝线去除2周后CEJ-ABC距离为（0.07±0.02） mm,与去除丝线前［（0.13±0.01） mm］相比显著降低,提示有显著的牙槽骨再生（P<0.01）。结论： 丝线结扎术是一种迅速且有效的诱导小鼠牙周炎牙槽骨骨吸收的方式,其诱导的破骨细胞活化在丝线结扎后24 h内发生,3 d达到高峰,去除实验性牙周炎的诱导因素即去除结扎的丝线有助于牙槽骨骨再生。     

牙龈卟啉单胞菌临床菌株的分离、鉴定及生长特性分析

目的 对口腔中牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）进行分离和鉴定,初步分析P. gingivalis的生长特性。方法 采集慢性牙周炎患者和牙周健康者临床龈下菌斑标本并行厌氧培养,采用PCR和16S rDNA序列分析方法鉴定P. gingivalis,分析检出率;观察P. gingivalis临床菌株的菌落特征和生长特点,分析生物学特征。结果 从35名采样对象的146个龈下菌斑标本中分离获得6株P. gingivalis临床菌株,分别命名为L2、L3、L4、L5、L11、和L12;牙周健康者龈下菌斑中P. gingivalis的检出率为27.4%,慢性牙周炎患者的牙周健康部位的龈下菌斑中P. gingivalis检出率为86.7%,探诊深度为4~6 mm的牙周袋龈下菌斑中P. gingivalis检出率为95.6%,探诊深度>6 mm的牙周袋龈下菌斑中P. gingivalis检出率为96.0%。L2、L5、L11和L12在BHI平板上培养1周后均形成特征性黑色菌落,而L3和L4在培养1周后形成灰色菌落,10 d后形成特征性黑色菌落;L2、L4、L5和L12在传代30 h后进入对数期生长期,L3和L11则在传代60 h后进入对数生长期。结论 P. gingivalis是慢性牙周炎患者的优势致病菌之一,其在慢性牙周炎患者健康位点的检出率显著高于牙周健康者,且随着牙周探诊深度的加深,检出率呈现逐渐升高的趋势。P. gingivalis各临床菌株的生长存在差异,提示其生物学特征和致病性可能不同。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导不同细胞分泌炎性细胞因子的差异性

目的：探讨牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）脂多糖（LPS），诱导人口腔上皮细胞KB和人牙龈成纤维细胞HGF-1及人单核-巨噬样细胞THP-1，分泌炎性细胞因子的能力及其差异。方法：采用酚水法提取PgATCC33277株的脂多糖（Pg—LPS）。采用鲎试验和红外光谱对提取的Pg—LPS进行鉴定。采用ELISA试剂盒，定量检测不同浓度和时间Pg—LPS作用的上述3种细胞培养物上清中TNF—α、IL-1β、IL-6和IL-8变化水平。实验中采用商品化大肠杆菌O111：B4脂多糖（E—LPS）为对照。结果：Pg—LPS和E—LPS凝固鲎试剂所需最低浓度均为15ng／ml，其红外光谱也极为相似。在Pg—LPS或E—LPS作用下，HGF-1细胞分泌的TNF—α和IL-1β水平呈单峰形增高（P〈0．01），但THP-1细胞为持续性升高（P〈0．01）。Pg—LPS或E—LPS具有促HGF-1和THP-1细胞持续性增强IL-6分泌的作用（P〈0．01）。Pg—LPS和E—LPS均可诱导THP-1细胞增强IL-8的分泌（P〈0．01），但对HGF-1细胞仅Pg—LPS有促IL-8分泌的效应（P〈0．01）。Pg—LPS和E—LPS均不能诱导KB细胞分泌上述细胞因子。结论：Pg—LPS有很强的促靶细胞分泌多种炎性细胞因子的生物学活性，从而引发初始的局部炎症反应。Pg—LPS致炎作用与E—LPS相似，但诱导不同炎性细胞因子的模式颇有差异。KB细胞不能作为LPS致炎作用的效应靶细胞。     

牙龈卟啉菌381对纯钛及钛75合金种植体表面失泽的腐蚀

目的：研究牙龈卟啉菌３８１对纯钛及钛７５合金种植体表面失泽腐蚀。方法将纯钛（ＴＡ２）、钛７５合金机加成１０ｍｍ＊１０ｍｍ＊１ｍｍ板片，数量分别为３０片和６０片，取钛７５合金试件３０片与纯钛试件分别进行化学钝化处理，将每组试件３０片随机分空白对照组、培养基对照组、实验组各１０片，厌氧环境中将牙龈卟啉菌３８１接种到改良ＧＡＭ培养基上，将试件贴附表面，每周转换传递１次，共１０ｗｋ．０．５ｍＬ．Ｌ＾－１Ｄ