人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的 构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库.方法 ①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446 cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库.②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段.结果 成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%).结论 SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用.     

家猪百日胚胎胸腺的基因表达谱

目的：构建家猪100d胚胎胸腺基因表达谱，为研究胸腺的发育和分化机制奠定基础，方法：随机挑取家猪100d胸腺cDNA库(FTY)的11712个克隆，进行单向全自动大规模测序，去污染后共获得。7071个高质量的表达序列标签(EST)用于基因表达分析，结果：对7071个高质量EST的聚类分析结果获得959个多拷贝基因和3074个单拷贝基因．与非冗余的核酸数据库、Swiss-Prot数据库及人、牛和鼠的Unigene数据库进行BLAST，发现806个多拷贝基因和1669个单拷贝基因(共计5442个ESTs)与已知序列有同源性，1629个EST没有发现同源序列被认为是新基因．根据功能将已知基因归为7类，其中基因表达相关基因占36．99%，胸腺特异的防御功能相关基因有一定程度表达(占7．55％)，这与人婴儿胸腺基因表达谱相类似而不同于成年人胸腺组织，将109个既发现有ORF又具有Poly A的多拷贝新基因与人类基因组框架序列进行BLAST，发现其中58个有同源序列。结论：EST技术是发现新基因的有效手段之一；此期家猪胸腺仍处于发育阶段。     

人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用表达上调基因的鉴定

目的 探讨人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用后基因表达的变化。方法 人外周血单个核细胞（PBMC）与猪内皮细胞系PIEC共培养18h，对照组为未共培养的PBMC和PIEC。合成两组细胞的cDNA进行抑制消减杂交（SSH）。共培养中上调的cDNA用pGEM-T Easy载体进行T／A克隆，然后测序。用BLAST程序进行同源性分析。结果 经过SSH和克隆，获得一包含300克隆的消减文库。从文库中随机挑取24个克隆进行测序，并在GenBank中进行同源性比较，其中4个为已知的人的基因片段，8个为猪的表达序列标记（EST），9个片段与人的基因有高度的同源性。3个片段未检索到相匹配的同源性序列。结论 人外周血单个核细胞与猪内皮细胞相互作用的后有许多基因的表达上调。     

肝癌细胞凋亡相关基因分析

目的 克隆肝癌细胞凋亡相关基因。分析已知基因同源的cDNA序列，探讨三氧化二砷（As2O3)诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。方法 用As2O3诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡，应用抑制性消减杂效技术克隆凋亡细胞中的差异表达cDNA，测序并与Genebank中的已知基因序列进行同源性比较。结果 克隆到18个与已知基因高度同源的cDNA序列，包括与抗氧化损伤，线粒体跨膜运输，细胞骨架系统相关的基因，细胞凋亡相关核蛋白PHLDA1基因，核糖体蛋白L37基因，溶酶体ATP酶基因以及与Ibd1,SMT3,DKFZP434J154pro-tein等基因高度同源的序列。结论 As2O3诱导的肝癌细胞凋亡后，大量基因表达上调，这些基因大多与As2O3处理肝癌细胞后的应激反应和细胞凋亡有关，提示细胞凋亡是一个有多基因参与调控的复杂过程。     

微小RNA抑制胚胎细胞MAD2基因的表达

目的:探讨微小RNA(microRNA)抑制胚胎细胞MAD2基因表达的机理.方法:用定量real-time PCR比较microRNA转染前后的胚胎细胞内源性基因MAD2 mRNA表达水平,同时用western blot比较转染前后Mad2蛋白的表达水平.结果:对照组的MAD2基因mRNA拷贝数/GAPAH mRNA拷贝数为0.1780±0.0688,而转染microRNA重组质粒后,实验组的mRNA比值分别为0.1778±0.0689和0.1778±0.0670,经统计分析,两实验组细胞的内源性MAD2基因mRNA水平与对照组无显著性差异;而其中一实验组的蛋白水平在转染后有明显降低.结论:microRNA主要在翻译水平调节哺乳动物细胞内基因的表达,为研究基因表达的调控机制奠定了良好的基础.     

有无上皮细胞共培养条件下前列腺增生间质细胞的基因差异表达

目的 研究前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下的基因差异表达.方法 利用前列腺间质与上皮细胞共培养模型及DDRT-PCR技术,对单独培养的前列腺增生间质细胞和与上皮细胞共培养的前列腺增生间质细胞的mRNA进行差异表达分析,获得差异表达片段(ESTs);并对这些ESTs进行斑点杂交印迹分析及克隆测序,将所测阳性克隆的cDNA序列与网上公用核苷酸数据库中的已知序列进行同源性比较.结果 得到差异表达片段44个;经同源性分析,有29个ESTs与已知基因有较高同源性,15个ESTs为新的cDNA片段.结论 前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下,存在差异表达基因,这些基因可能在前列腺间质细胞与上皮细胞的相互调控中发挥作用.     

微小RNA对胚胎细胞BUB1基因的表达抑制

目的:探讨微小RNA对胚胎细胞BUB1基因表达的调控.方法:用定量real-time PCR比较microRNA转染前后的胚胎细胞内源性基因BUB1 mRNA表达水平,同时用western blot比较转染前后Bub1蛋白的表达水平.结果:对照组的BUB1基因mRNA拷贝数/GAPAH mRNA拷贝数为0.1960±0.0688,而转染microRNA重组质粒后,实验组的mRNA比值分别为0.1968±0.0689和0.1962±0.0670,经统计分析,两实验组细胞的内源性BUB1基因mRNA水平与对照组无显著性差异;而蛋白水平在转染后均有明显降低.结论:microRNA主要在翻译水平调节哺乳动物细胞内基因的表达,为研究基因表达的调控机制奠定了良好的基础.     

BALB/c小鼠胚胎皮肤无瘢痕愈合相关基因的筛选与克隆

目的在已构建成年小鼠和小鼠胚胎皮肤差异表达的c DNA文库基础上,通过双向抑制性消减杂交筛选BALB/c小鼠胚胎皮肤无瘢痕愈合相关基因。方法应用双向抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)技术,筛选BALB/c小鼠胚胎皮肤与BALB/c成年小鼠皮肤c DNA片段。结果获得16个在鼠胚皮肤中特异表达的无瘢痕愈合相关基因的c DNA片段,7个在成鼠皮肤中特异表达的无瘢痕愈合相关基因的c DNA片段。其中有2个新发现与无瘢痕愈合相关基因未见文献报道。结论研究证实确有部分基因在鼠胚皮肤和成鼠皮肤中分别特异表达,这种差异表达极有可能是哺乳动物胚胎皮肤无瘢痕愈合的分子生物学基础。     

小鼠胸腺增龄相关性基因的差异表达及其克隆

目的 小鼠胸腺增龄相关性基因差异表达研究及其克隆。方法 利用DDRT－PCR技术对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行分析,获得差异表达片段（ESTs)。进一步作Northern印迹分析并进行核苷酸测序。选取其中一个EST为探针,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆基因。结果 对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行DDRT－PCR分析,发现小鼠胸腺基因存在增龄相关性的表达差异,某些基因在1或10月龄胸腺内有选择性表达,某些基因仅有表达量的变化。共获得108个差异表达的ESTs,其中31个呈Northern印迹阳性,全部测序。经同源性分析,有14个ESTs与已知基因有较高的同源性,17个ESTs为新的cDNA片段。选取其中1个在1月龄鼠胸腺水平表达的EST,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆到1个与小鼠的LAF1转酮醇酶高度同源的1480bp片段。结论 小鼠胸腺内存在增龄性基因表达差异。据此差异所获得的胸腺差异表达基因可能参与胸腺衰老与萎缩过程。     

高甘油三酯血症大鼠高血凝相关基因的筛选

目的：筛选实验性高甘油三酯血症诱发大鼠高血凝的相关基因。方法：采用抑制性消减杂交技术构建大鼠高血凝cDNA消减文库，并用半定量RT-PCR初步鉴定差异表达基因。结果：成功构建了大鼠高血凝cDNA消减文库，20个阳性克隆的序列测定和同源比较表明这些克隆代表了19个基因，其中8个为已知基因但首次发现与高血凝相关，11个为新的ESTs，已被GenBank收录。半定量RT-PCR证明3个ESTs(HC002、HC057和HC067)为表达上调基因。结论：所构建的消减文库消减效率高，为进一步筛选、克隆大鼠高血凝相关的新基因奠定了基础，HC002、HC057和HC067可能与高甘油三酯血症诱发的高血凝相关。     

人脐静脉内皮细胞脂多糖刺激后上调基因表达谱的分析

目的 对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)受脂多糖(LPS)刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析。方法 以受LPS刺激HUVEC为实验方，末刺激别HUVEC为驱使方，进行抑制消减杂交(SSH)建立消减cDNA文库，经菌落原位斑点杂交筛选文库后将阳性克隆测序和同源性分析，并用RT-PCR验证新的cDNA序列。结果 共获得25条上调表达的基因，分别与炎症反应、细胞骨架重构、细胞生长和凋亡、胞内信号转导相关，并克隆到3条新基因表达序列标签(EST)，RT-PCR验证了这些新EST序列只在LPS刺激的内皮细胞中表达。结论 抑制消减杂交有效地克隆了人脐静脉内皮细胞LPS刺激后上调表达基因，有助于阐明LPS直接激活血管内皮细胞的分子机制。     

小鼠小肠上皮内淋巴细胞与脾T淋巴细胞间基因表达差异分析

目的：比较小鼠小肠上皮内淋巴细胞（intestine intraepithelial lymphocyte，iIEL）与脾脏T淋巴细胞的基因表达差异，建立两者的cDNA差异减除文库，分析iIEL优势表达的基因。方法：采用Percoll密度梯度法分离iIEL，尼龙毛柱法分离脾脏T淋巴细胞。应用改良后的差减杂交法，连接特异的衔接子，通过减除杂交从iIEL中去除与脾T淋巴细胞相同的表达基因后，经抑制性PCR扩增，并与质粒载体连接，得到二者的cDNA减除文库。用Northern印迹分析法从中筛选iIEL优势表达的EST。结果：从iIEL特异的cDNA减除文库中筛选出50条有明显差异的EST，进行测序，并取得登录号。对所得EST用基本局域联配搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行比对，分析得出14个iIEL优势表达的基因。这些基因分析与病原体的模式识别、细胞因子相关信号转导以及蛋白酶抑制剂有关。结论：iIEL是肠道天然免疫的重要组成部分，能识别细菌的保守抗原。细胞因子是影响其行为的重要方式，而某些信号转导途径通常可能因为高表达蛋白酶抑制剂而受抑。     

成年大鼠小脑差异表达基因的克隆

目的 分析成年大鼠小脑基因与新生大鼠小脑基因的差异表达并获取新的表达序列标签。方法 成年大鼠小脑来源的cDNA为受检者（tester）,新生大鼠小脑的cDNA为驱动者（driver）,进行差减杂交,经克隆、获得成年大鼠小脑差减杂交为。结果 共挑选出54个阳性克隆质粒,测序得到56个不同基因片段序列,其中有16个是大鼠中首次测得的表达序列标签,并被GenBank收录（BG946773～BG946788）。结论 用差减杂交法建立差异表达基因文库可快速筛选未知表达序列标签。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

Straw-top玻璃化与程序化冷冻小鼠8-细胞胚胎效果的比较

目的比较慢速程序化法与玻璃化法冷冻小鼠8-细胞胚胎的效果。方法将小鼠卵母细胞行体外受精后培养至8-细胞,分别采用慢速程序化法与玻璃化法进行冷冻,解冻后比较两组胚胎存活率及囊胚形成率。结果慢速程序化冷冻法解冻后的胚胎存活率为79.6%,囊胚形成率为70.7%;玻璃化冷冻法解冻后的胚胎存活率为94.9%,囊胚形成率为89.9%,胚胎存活率与囊胚形成率均显著高于前者（均P〈0.01）。结论在进行小鼠8-细胞胚胎冷冻时,玻璃化法冷冻效果较慢速程序化法效果好。     

用抑制性消减杂交方法筛选人肾癌相关基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌差异表达基因文库并进行差异表达基因筛选.方法 以肾癌细胞株RLC-310和肾近曲小管细胞株HK-2互为实验组和对照组,提取mRNA,应用抑制性消减杂交技术进行正反两向消减杂交,获得人肾癌细胞差异表达基因文库,结合反向Northern斑点印迹杂交,筛选差异基因克隆,并进行测序分析.结果 正向和反向文库共包含1200多个阳性克隆,经斑点杂交筛选后,对213个差异克隆进行测序并经BLAST分析,得到144个差异表达基因,与肾癌相关的高表达基因67个,低表达基因77个,其中新EST 14个,未知功能基因21个;对测序基因进行聚类分析发现与细胞生长、黏附、凋亡等肿瘤细胞生物学行为相关.结论 该文库质量可靠,所筛选出的差异基因和新的基因为进一步筛选肾癌特异性相关基因,绘制肾癌差异基因表达谱,最终阐明肾癌发生、发展、转移机制提供了实验材料和研究靶点.     

传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库,筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法:采用抑制消减杂交技术,以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料,分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取64个白色克隆进行酶切鉴定. 结果:扩增消减cDNA文库获得760个克隆,随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200～600 bp的插入片段. 结论:构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础.     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。