蛋白激酶CK2抑制剂的研究进展

蛋白激酶CK2又称酪蛋白激酶2,是一种高度保守的第二信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,广泛分布于真核细胞的胞质及胞核中。全酶由两个催化亚基（α/α′）和两个调节亚基（β）所组成。在细胞内CK2具有基础酶活性,可使300多个底物磷酸化,在细胞生长、增殖、凋亡和癌变等过程中发挥重要的作用,参与多种疾病的发生和发展进程。因此,CK2已成为一个有前景的治疗靶点。不同作用模式的CK2抑制剂相继诞生,有ATP竞争性和非ATP竞争性抑制剂,而后者又包括底物靶向抑制剂、CK2α亚基外部靶向抑制剂、CK2β亚基靶向抑制剂及阻断亚基相互作用的抑制剂等。     

蛋白激酶CK2在信号转导中的作用及其与肿瘤发生的关系

蛋白激酶CK2是一种在真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,可横向介导多条信号途径,以级联和垂直的方式发挥作用,调节细胞的生长和凋亡。其精细调控一旦失衡,可诱发肿瘤;而其特异性抑制剂和以其为靶向的基因治疗可抑制肿瘤。以CK2调节为中心的致瘤机制研究和以CK2为靶点的肿瘤药物开发具有重要的临床应用价值。     

蛋白激酶CK2β siRNA对肺腺癌细胞A549生长的抑制作用

目的：探讨蛋白激酶CK213特异性干扰RNA对肺腺癌细胞系A549增殖的影响。方法：构建蛋白激酶CK2psiRNA表达质粒pGPU6-CSNK2B，以与人编码序列无同源性的通用阴性对照表达质粒pGPU6一NC作对照，分别用脂质体转染法转染A549细胞。采用RT-PCR、Western Blot、免疫细胞化学技术检测转染后（K2pmRNA和蛋白表达，同位素参入法检测CK2活性，细胞计数法检测转染后A549的细胞生长曲线和倍增时间，流式细胞术检测转染后对A549细胞周期的影响。结果：重组质粒稳定转染A549细胞后，转染pGPU6一CSNK2B组CK213mRNA、细胞胞浆蛋白表达和CK2激酶活性均较转染pGPU6一NC组和未转染组细胞明显下降（P〈0．05），各组间细胞胞核蛋白CK213表达无明显差异（P〉0．05）；CK2活性的抑制率与CK213蛋白表达抑制率大致平行；转染pGPU6一CSNK2B组细胞生长相对缓慢，细胞的倍增时间为56h，而未转染组细胞的倍增时间为39h；流式细胞结果显示转染pGPU6-CSNK2B组A549细胞增殖指数明显降低（P〈0．05），细胞阻滞于G0／G1期。结论：蛋白激酶CK2B特异性siRNA表达质粒可以阻抑A549细胞CK2t3的表达，抑制细胞增殖和CK2激酶活性，为CK2 siRNA作为抗肿瘤药物的开发和CK2药靶的研究奠定了基础。     

AG1112对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用

目的观察Tyrphostin中的AG1112对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制.方法利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和β亚基,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶,在不同条件下测定CK2的活性.CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP或[γ-32P]GTP的 [32P]放射活度来检测.结果重组人CK2是一种Ca2+、c AMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶,与天然CK2的性质一致.AG1112对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用,IC50为6.0 μmol·     

c-Jun调节细胞对微管抑制剂长春碱的敏感性

丝裂原激活的蛋白激酶在细胞凋亡的调节中发挥重要作用,尤其是c JunN端蛋白激酶(JNK)作为一种凋亡信号转导的关键递质参与某些类型的应激诱导性细胞凋亡;JNK的主要底物c Jun的清除或抑制被认为会影响该凋亡途径。Obey等采用三种成纤维细胞系:野生型(c jun / )、c Jun不表达型(c     

Tyrphostin AG34对重组人蛋白激酶CK2全酶的影响

目的 :观察TyrphostinAG34对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。 方法 :利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和 β亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶 ,在不同条件下测定CK2的活性。CK2活性通过测定转移到CK2底物上的 [γ 32 P]ATP或 [γ 32 P]GTP的 [32 P]放射活度来检测。结果 :重组人CK2是一种Ca2 + 、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然CK2的性质一致。AG34对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用 ,IC50 为 1.0 μmol·L 1,抑制作用远大于CK2已知抑制剂 5 ,6 -二氯 1 β 呋喃糖苯并咪唑 (DRB)和N (2 氨乙基 ) 5 氯萘 1 硫胺 (A3)。AG34对重组人CK2的动力学研究表明 :它与GTP呈现以竞争性为主的混合型抑制作用 ,与酪蛋白呈非竞争性抑制作用。结论 :AG34不仅是酪氨酸蛋白激酶的抑制剂 ,而且是一种十分有效的蛋白激酶CK2的抑制剂 .重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点。     

酪氨酸蛋白激酶抑制剂Tyrphostin AG114对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用(英文)

目的　为了观察TyrphostinAG114对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机理。方法　利用基因工程克隆 ,表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和 β亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶 ,在不同条件下测定CK2的活性。CK2活性通过测定转移到CK2底物上的 [γ 32 P]ATP或 [γ 32 P]GTP的 [32 P]放射活度来检测。结果　重组人CK2是一种Ca2 +、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然CK2的性质一致。AG114对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用 ,IC50 为 2 0 .8μmol·L- 1,抑制强度介于已知CK2抑制剂 5 ,6 二氯 1 β 呋喃糖苯并咪唑 (DRB)和N (2 氨乙基 ) 5 氯萘 1 硫胺 (A3)之间。AG114对重组人CK2的动力学研究表明 :它与GTP呈混合竞争性抑制作用 ,与酪蛋白呈非竞争性抑制作用。结论　AG114不仅是酪氨酸蛋白激酶的抑制剂 ,而且是一种十分有效的蛋白激酶CK2的抑制剂。重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便地筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点     

AG1112对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用

目的　观察Tyrphostin中的AG1112对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。方法　利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和 β亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶 ,在不同条件下测定CK2的活性。CK2活性通过测定转移到CK2底物上的 [γ 3 2 P]ATP或 [γ 3 2 P]GTP的 [3 2 P]放射活度来检测。结果　重组人CK2是一种Ca2 + 、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然CK2的性质一致。AG1112对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用 ,IC50 为 6 0 μmol·L-1,抑制作用大于CK2已知抑制剂DRB和A3。AG1112对重组人CK2的动力学研究表明 :它与GTP和酪蛋白分别呈混合性和非竞争性抑制作用。结论　由于AG1112对重组人CK2显示出很强的抑制作用 ,因此重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点     

α-synuclein促进凋亡的机制研究

目的：α-synuclein是一种功能未知的突触前膜蛋白，是多种神经退行性疾病胞浆中的纤维聚积体中的主要成份。虽然经过大量的研究，α-synuclein在这些疾病中发挥的作用仍未充分阐明，但是许多研究均报道过α-synuclein的过量表达对细胞具有一定的毒性，因此本研究的主要目的是研究α-synuclein对NF-xB信号途径所介导的细胞凋亡的调节作用。NF-xB是在细胞中广泛表达的转录因子，能够调节多种抗凋亡基因如BCl-2的表达，而GSK3β是与神经细胞凋亡紧密相关的多功能激酶，通过磷酸化包括NF-xB等各种转录因子的多种靶蛋白而调节细胞的凋亡。方法与结果：本研究通过分子克隆技术构建人源α-synuclein的载体并建立稳定过表达株，我们的研究发现：过表达α-synuclein的细胞稳定株细胞存活率与对照组相比显著性降低，而通过报告基因检测发现过表达的α-synuclein能够显著抑制NF-xB介导的基因的表达，并且这种抑制作用呈现剂量依赖性，随着α-synuclein转染量的增加而呈现更加明显的抑制作用；而通过Western Blot检测发现，过表达的α-synuclein能够促进GSK3β的表达，而抑制抗凋亡基因BCl-2的表达。结论：α-synuclein对细胞的毒性可能通过促进GSK3β的表达抑制NF-xB途径，由此通过抑制由NF-xB介导的抗凋亡基因BCl-2表达而发挥作用。     

在非刺激条件下TRPC6的814位点丝氨酸磷酸化

TRPC（瞬时受体电位阳离子通道）是与钙离子内流有关的非选择性阳离子通道。其通过磷酸化实现对通路和活性的调节。其中，TRPC6在肾脏中主要定位于足细胞上，对足细胞内钙离子浓度的调节发挥重要作用。TRPC6可以由Fyn激酶（Src家族中的一种酪氨酸激酶）磷酸化。实验证实Fyn激酶磷酸化TRPC6后可以使TRPC6活性增加，这一现象可以被TRPC6的Thr69位的蛋白激酶G和Ser448位的蛋白激酶C抑制。已有研究指出，TRPC6在非刺激条件下的人胚胎肾细胞系（HEK293）中可以发生基本磷酸化，但其磷酸化的位点还未确定。为了研究这一磷酸化的机制，本实验运用了MS（质量光谱法）/MS结合代谢标记的方法，证实了在未受刺激细胞中TRPC6的814位点丝氨酸(Ser 814)发生磷酸化。实验发现，当Ser 814突变为丙氨酸时会造成未受刺激细胞TRPC6的32P基本磷酸化减少50%，证实Ser 814是未受刺激细胞磷酸化的主要位点。但与野生型的TRPC6相比，Ser 814的突变体的TRPC6的活性、表达水平以及通道运输均无明显变化。TRPC6的序列分析显示Ser814与酪氨酸激酶Ⅱ（CK2）有共同的磷酸化位点，并且CK2识别的序列往往是酸性氨基酸密集的区域，可以催化-2到+7位点的酸性残基发生磷酸化，而TRPC6中Ser814与谷氨酸以及天冬氨酸构成酸性环境，适合CK2识别。另外，CK2可以抑制结构活性，因此推测，在本研究中CK2可能是Ser 814磷酸化潜在的激酶。然而实验结果表明CK2与TRPC6的磷酸化无关，不能改变TRPC6的活性，即CK2不是参与其磷酸化作用的激酶。总之，本次研究鉴定了在TRPC6上的一种新的基础磷酸化位点（Ser814），并证实CK2与这一位点的磷酸化无关。     

木犀草素对蛋白激酶CK2的抑制作用

目的观察体外以及细胞内木犀草素对蛋白激酶CK2活性的抑制效果及进行酶动力学分析以确定其抑制作用类型。方法将利用基因工程技术获得的重组人CK2α′及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶。通过测定药物作用后转移到CK2底物上的[γ3-2P]ATP的32P的放射性活度,探讨木犀草素对重组人CK2全酶以及HL-60细胞内CK2活性的抑制作用,并采用L ineweaver-Burk作图法分析其酶动力学机制。结果木犀草素能显著抑制重组人CK2活性(IC50=0.86μmol.L-1)以及HL-60细胞内的CK2活性,其对细胞内CK2的作用效果要强于阳性对照TBB。酶动力学分析表明,木犀草素与ATP呈竞争性抑制CK2的活性(Ki=0.19μmol.L-1),与酪蛋白则呈混合性抑制CK2的活性(Ki=0.11μmol.L-1)。结论木犀草素是一种有效的蛋白激酶CK2的抑制剂。     

Tyrphostin AG34对重组人蛋白激酶CK2全酶的影响

目的:观察TyrphostinAG34对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。方法:利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和β亚基,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶,在不同条件下测定CK2的活性。CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-³²P]ATP或[γ-³²P]GTP的[³²P]放射活度来检测。结果:重组人CK2是一种Ca²⁺、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶,与天然CK2的性质一致。AG34对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用,IC₅₀为1.0 μmol·L^-1,抑制作用远大于CK2已知抑制剂5 ,6 -二氯-1-β-呋喃糖苯并咪唑(DRB)和N-(2-氨乙基)-5-氯萘-1-硫胺(A3)。AG34对重组人CK2的动力学研究表明:它与GTP呈现以竞争性为主的混合型抑制作用,与酪蛋白呈非竞争性抑制作用。结论:AG34不仅是酪氨酸蛋白激酶的抑制剂,而且是一种十分有效的蛋白激酶CK2的抑制剂.重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点。     

Tyrphostin AG1478对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析

目的:观察Tyrphostin AG1478[4-(3-氯苯胺基)-6,7-二甲氧喹唑啉]对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制.方法:在体外等摩尔数混合重组蛋白激酶CK2α和β亚基构成CK2全酶,在不同条件下测定CK2的活性.CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-~(32)P]ATP或[γ-~(32)P]GTP的~(32)P放射活度来检测.结果:重组人CK2是一种Ca~(2 )、[KG*2]cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶,与天然CK2的性质一致.AG1478对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用,IC_(50)为25.9μmol/L,抑制作用接近于已知的CK2抑制剂N-(2-氨乙基)-5-氯萘-1-硫胺(A3),稍小于5,6-二氯-1-β-呋喃糖苯并咪唑(DRB).AG1478对重组人CK2的动力学研究表明:它与GTP和酪蛋白均呈竞争性抑制作用,是一种双底物抑制剂.结论:AG1478不仅是高效特异的表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶的抑制剂,而且也是一种新型有效的蛋白激酶CK2抑制剂.重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便的筛选和开发有效CK2抑制剂的分子靶点.     

和厚朴酚对SP2/0骨髓瘤细胞的作用观察及其机制的初步探讨

目的观察不同浓度和厚朴酚对于骨髓瘤细胞SP2/0的增殖抑制及促凋亡作用并对其作用机制进行初步探讨。方法利用MTT法检测不同浓度和厚朴酚对SP2/0细胞作用24、48、72h后的增殖抑制作用;常规Giemsa染色和DAPI荧光染色以及透射电镜观察细胞凋亡的形态学变化、琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA梯带;利用AnnexinⅤ/PI双染及流式细胞术检测药物干预后24、48h细胞的凋亡率及细胞周期;western blotting检测胞核中核因子KBp65、胞浆中IkBα蛋白水平,ELISA法检测核因子kBp65的转录活性。结果和厚朴酚在2μg/ml至40μg/ml的浓度范围内显著能抑制SP2/0细胞生长增殖及诱导SP2/0细胞凋亡,呈明显剂量、时间依赖性（P〈0.05）;和厚朴酚作用后,G0/G1期细胞数目增多,G2/M、S期细胞明显减少;胞核中核因子kB蛋白减少、胞浆中IkBα蛋白的表达增加,核因子kB的转录活性降低。结论和厚朴酚对SP2/0骨髓瘤细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制与抑制核因子kB转录活性有关。体外研究显示,和厚朴酚是一种有效的抗骨髓瘤药物。     

拮抗转化生长因子β活性对糖尿病肾病的防治作用

转化生长因子（transforming growth factor,TGF）是de Larco与Todaro在小鼠肉瘤病毒转化的细胞条件培养基中鉴定出来,包括TGF-α、TGF-β两个成分.大量研究证实TGF-β与糖尿病肾病（DN）发生、发展关系密切,而拮抗TGF-β活性对治疗DN有何意义也成为研究热点.TGF-β参与生长发育、创伤修复和病理过程,调节多种细胞功能：调节细胞生长、细胞分化、细胞死亡及凋亡,诱导细胞外基质（ECM）蛋白合成等.     

葡萄糖酸锌对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡和细胞超微结构的影响

目的观察心肌缺血再灌注损伤过程中心电图变化,肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）活性,细胞凋亡和心肌细胞超微结构的变化,分析葡萄糖酸锌对心肌的保护作用及其可能机制。方法建立大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型。用心电监测心律失常发生率、比色法测定血清中CK,LDH、流式细胞仪检测细胞凋亡和电镜观察心肌细胞超微结构。结果与模型组相比,葡萄糖酸锌三个不同剂量组大鼠心律失常发生率、血清中CK和LDH活性、细胞凋亡指数降低（P〈0.01）,心肌细胞超微结构损伤明显减轻。结论葡萄糖酸锌对缺血再灌注损伤心肌具有保护作用,可能与其抑制细胞凋亡和减轻心肌细胞超微结构病理改变有关。     

蛋白激酶CK2α与食管癌发生发展及临床病理因素的相关性研究

目的 探讨蛋白激酶CK2α在食管癌发生发展中的作用及其与食管癌的临床分期、病理类型之间的关系.方法 采用免疫组织化学法检测该院收治的120例食管癌患者癌组织及癌旁组织中蛋白激酶CK2α蛋白的表达水平,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot技术对其中的19例患者的术后标本的蛋白和mRNA进行检测.比较癌组织和癌旁组织中的蛋白激酶CK2α蛋白和mRNA表达差异.结果 食管癌组织中的CK2α中阳性与强阳性表达率分别高于癌旁组织(P＜0.05).CK2α阳性表达情况在不同T分期、淋巴结转移间差异无统计学意义(P＞0.05),CK2α阳性表达分布在不同临床TNM分期间差异有统计学意义(P＞0.05).CK2α蛋白、CK2αmRNA在食管癌组织的表达均显著的高于癌旁组织(P＜0.05).结论 蛋白激酶CK2α与食管癌的发展有着一定的关系,可以作为临床上对食管癌病变程度的一种分子判定标准.     

小檗碱通过破坏线粒体功能选择性诱导淋巴瘤细胞的凋亡

目的研究小檗碱(BBR)对T淋巴瘤细胞凋亡的影响及机制。方法正常T淋巴细胞、T淋巴瘤细胞、Jurkat细胞用BBR 0,10,20和40μmol·L^-1处理24 h,多柔比星(Dox)40μmol·L^-1为阳性对照;Jurkat p0细胞用BBR 0和40μmol·L^-1处理24 h。流式细胞术检测细胞凋亡率,Seahorse XF24细胞代谢分析仪和H2DCFDA活性氧探针检测细胞氧消耗率(OCR)和活性氧(ROS)水平。CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞ATP水平,试剂盒测线粒体呼吸链复合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ和Ⅴ的活性。Western印迹法检测细胞内胱天蛋白酶3、Bcl-2、Bax、NF-κB抑制蛋白激酶α/β(IKKα/β)、磷酸化IKKα/β(p-IKKα/β)、NF-κB抑制因子α(IκBα)、p-IκBα和P65蛋白表达水平。结果BBR 40 mmol·L^-1明显增加T淋巴瘤细胞和Jurkat细胞凋亡率(P<0.01),胱天蛋白酶3和Bax蛋白表达水平显著上调(P<0.01),Bcl-2表达显著下调(P<0.01),但对正常T淋巴细胞的凋亡并无影响;BBR 40 mmol·L^-1明显降低Jurkat细胞的OCR及线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性(P<0.01),增加ROS水平(P<0.01),降低ATP水平(P<0.01),但不影响线粒体缺陷型淋巴瘤Jurkat p0细胞呼吸链和凋亡;BBR 40μmol·L-1明显下调Jurkat细胞中NF-κB通路相关蛋白p-IKKα/β/IKKα/β、p-IκBα/IκBβ和核内P65表达(P<0.01)。结论BBR通过破坏线粒体功能选择性诱导淋巴瘤T细胞的凋亡,可能与抑制NF-κB通路有关。     

哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡对白细胞介素2受体α亚基的影响

目的探讨哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡与白细胞介素2受体α亚基(IL-2Rα)的关联。方法 MTT法检测哇巴因对Jurkat细胞生长的影响;Western blot法检测IL-2Rα的表达;ELISA法检测细胞培养液中可溶性IL-2Rα(sIL-2Rα)的改变。结果低浓度(30、50nM)哇巴因能够诱导Jurkat细胞凋亡,下调Jurkat细胞表面的IL-2Rα及sIL-2Rα表达。结论 IL-2Rα参与了哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡的调节。     

蛋白激酶C在表没食子儿茶素没食子酸酯诱导LoVo细胞凋亡中的作用

目的　探讨蛋白激酶C在表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)诱导大肠癌LoVo细胞凋亡中的调控作用。方法　在有或没有蛋白激酶C激活剂PMA预处理LoVo细胞的情况下 ,用流式细胞术、Westernblot分析以及蛋白激酶C检测试剂盒检测EGCG处理LoVo细胞前后其细胞内多种蛋白激酶C同工酶表达水平和细胞内蛋白激酶C总活性的变化。结果　PMA(10 0nmol·L-1)预处理LoVo细胞 3h ,可部分地抑制EGCG诱导的LoVo细胞凋亡。流式细胞术和Westernblot分析显示EGCG处理LoVo细胞后可引起该细胞内多种蛋白激酶C同工酶包括cPKCα、βⅠ、βⅡ、nPKCε和aPKCξ表达水平下调 ,并呈时间效应关系 ;而细胞内蛋白激酶C总活性无明显变化。结论　蛋白激酶C参与了EGCG诱导LoVo细胞凋亡的调控作用 ,主要是通过下调多种蛋白激酶C同工酶表达水平而不是通过影响细胞内蛋白激酶C总活性而发挥作用