丙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ScFv)。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV核心蛋白特异性人源单链可变区抗体片段阳性克隆，并对其进行免疫学及核苷酸序列测定。结果 筛选得到的ScFv片段具有抗HCV核心蛋白的特异性，基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征。结论 利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV核心蛋白的特异性人源单可变区抗体的编码基因。     

人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的筛选与鉴定

目的　通过大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞抗原对人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体原始库的反复筛选 ,鉴定抗体库的特性并检测其与人大肠癌相关抗原的结合活性。方法　PCR鉴定阳性重组菌xL1 B1ue中人大肠癌相关抗体Fab段的插入率 ,构建人大肠癌Fab段原始库 ,提取 3例用于构建原始抗体库的致敏大肠癌组织抗原 ,13例非致敏大肠癌组织抗原及 3种体外培养的大肠癌细胞株Lovo、HT 2 9、LS 174T的抗原各自等体积混合 ,利用 3组混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选 ,将筛选后的三个三级库等体积混和后通过ELISA法鉴定其与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的结合活性 ,取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究。结果　N片段及κ链的插入率分别为 40 %和 70 % ,Fd片段及κ链均插入质粒Pcomb3的重组率为 2 8% ,Fab段基因库库容为 2 .1× 10 6,3组大肠癌混合抗原分别对原始抗体库进行 3轮筛选后 ,抗体库均得到了不同程度的富集 ,ELISA显示富集后的Fab段抗体库对大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞均有较特异性的结合活性。结论　利用噬菌体抗体库技术筛选出了相关抗大肠癌Fab段抗体 ,且筛选后的抗体片段与人大肠癌相关抗原有较特异性的结合活性     

可溶性HCV非结构蛋白NS3人源单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

目的 获得可溶性的抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体(ScFv),为得到纯度高、活力强的NS3 ScFv和进一步HCV的治疗奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV非结构蛋白NS3为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的HCVNS3人单链抗体ScFv片段克隆,并对其进行DNA序列及免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化琥珀突变非抑制型大肠杆菌HB2151;IPTG诱导表达HCV NS3可溶性单链抗体;ELISA和dot blot检测其抗原结合特异性。结果 克隆了HCV NS3的单链可变区抗体基因,经DNA酶切和序列分析表明,该抗体基因由747个碱基组成。ELISA和dot blot结果表明,在大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达的可溶性HCV NS3的单链可变区抗体,具有结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的特异性和免疫活性。结论 克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表达了可溶性的ScFv-NS3。     

抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达

目的 筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组B抗原（r-AgB)的人源单链可变区抗体（SCfv)。为细粒棘球蚴B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组纯化的细粒棘球蚴B抗原为固相抗原，经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗r-AgB的ScFv基因片段的阳性克隆，提取质粒，经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后，亚克隆到pCANTAB5E载体上，转化大肠杆菌XL1-Blue，经IPTG诱导，表达可溶性ScFv。结果 筛选得到的ScFv片段基因为768bp，经SDS-PAGE鉴定，在大肠杆菌XL1-Blue中表达的ScFv分子质量约28ku，经过ELISA和Western-Blot检测，该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性，结论 细粒棘球蚴重组B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功，为今后包虫病人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

人源性抗-HBc单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性单链噬菌体抗体库，为筛选人源性抗—HBc单链抗体奠定基础。方法 利用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体(抗—HBc)阳性患者淋巴细胞中提取总RNA，逆转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因，重组于噬菌粒载体叶pHEN1，转化抑制型大肠埃希菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。结果 成功地构建了人源性抗—HBc单链噬菌体库，库容量达10^6。结论 利用RT—PCR和噬菌体表面展示技术可以成功构建人源性单链抗体库，并达到建库标准，可进一步从中筛选人源性单链抗体。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白人源基因工程单链抗体的表达

目的在大肠杆菌XL1-Blue中表达可溶性的抗HCV非结构蛋白NS3的人源单链可变区抗体（single-chainvariablefragmentantibody,ScFv）。方法以重组的HCVNS3为抗原,利用噬菌体抗体库技术筛选含有抗-HCVNS3ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经SfiI/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG）诱导表达HCVNS3可溶性单链可变区抗体。ELISA和斑点吸印杂交检测其与不同来源的抗原的结合活性。结果筛选到的HCVNS3的单链抗体基因,经限制性内切酶酶切和序列分析表明,该抗体基因由750bp组成,ELISA和斑点吸印杂交结果表明,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的HCVNS3的单链抗体,可与不同来源的NS3抗原结合。结论大肠杆菌XL1-Blue表达的NS3-ScFv具有结合不同来源的HCVNS3的活性和特异性。     

抗肝癌单链抗体体外亲和力成熟的改造及意义

目的从体外模拟抗体的体内成熟过程,以获得高亲和力抗肝癌单链抗体。方法采用错配聚合酶链反应(PCR)法随机突变抗肝癌单链抗体重链和轻链可变区,构建抗肝癌噬菌体抗体次级突变库,利用噬菌体展示技术从中筛选出高亲和力单链抗体突变株。结果抗肝癌噬菌体抗体次级突变库容为4．5× 10~7,经过3轮富集筛选和酶联免疫吸附法鉴定获得2株突变株M90、M116,不仅保留原始克隆的特异性,而且相对亲和力指数分别为原始克隆的1．7倍和2倍。结论错配PCR结合噬菌体展示技术是提高单链抗体亲和力的一种有效且简便的手段。     

抗人肺癌噬菌体展示可溶性ScFv的筛选与鉴定及其序列测定

目的制备抗人肺癌单链抗体（single chain Fv ferment antibody,ScFv）,并对抗体生物学特性进行初步研究。方法以人肺腺癌细胞系A：为抗原,对5F一11杂交瘤细胞噬菌体抗体库进行富集和筛选。以人肺腺癌细胞系A2和正常人淋巴细胞为抗原,进行酶联免疫吸附试验,从富集后的噬菌体抗体库中筛选出只与A2细胞结合的阳性克隆。筛选的噬菌体克隆转染大肠埃希菌HB2151,得到可溶性单链抗体分泌克隆。可溶性抗体分泌克隆测序。应用ELISA、竞争性ELISA、SDS．PAGE及蛋白质印迹法对其中的2A7．1克隆进行初步鉴定。结果以肺腺癌细胞A2为抗原进行了4轮富集。进一步筛选得到18个仅识别A：细胞而与人淋巴细胞无反应的融合抗体分泌克隆。转染大肠埃希菌HB2151后筛选到能与Az细胞特异结合的可溶性抗体分泌克隆2A7．1。竞争性ELISA结果显示,5F-11能强烈抑制2A7-1与A2细胞的结合。SDS-PAGE蛋白质印迹法显示得到大小约为30X10。的单链抗体。结论通过噬菌体抗体技术成功分离到了鼠单抗5F-11的可溶性ScFv分泌克隆,为进一步的抗体应用研究奠定了基础。     

变形链球菌重组表面蛋白(rA-P)人源单链抗体的筛选及其活性检测

目的从PDNA5噬菌体抗体库中筛选变形链球菌重组表面蛋白的人源噬菌体单链抗体,将其表达制备非融合单链抗体,并探讨其生物学特性。方法用变形链球菌重组表面蛋白rA-P包被免疫试管,对pDAN5噬菌体抗体库进行5轮亲和免疫筛选制备抗rA-P蛋白的噬菌体单链抗体,并将其感染大肠杆菌HB2151,用IPTG诱导表达非融合性单链抗体,非融合性单链抗体包涵体复性后用Western blot检测其生物活性。结果筛选得到13株抗rA-P蛋白的噬菌体单链抗体;用HB2151表达的非融合性单链抗体分子量为30kD,表达量达菌体蛋白的30%,Western blot检测显示,复性后的非融合性单链抗体能与rA-P蛋白发生特异性抗原抗体反应,证明表达的非融合性单链抗体有生物活性。结论成功地利用噬菌体抗体库技术筛选、表达制备有生物活性的抗变链菌表面蛋白的人源单链抗体。     

人源抗丙型肝炎病毒包膜蛋白E2单链抗体的研究

目的 研制抗丙型肝炎病毒包膜蛋白E2（HCVE2）的人源噬菌体单链抗体，并探讨其临床价值。方法 以重组的HCVE2为固相抗原，利用亲和筛选的原理，从噬菌体抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ELISA）和DNA序列分析。获得HCVE2的人源单链抗体；用该抗体对10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组织化学鉴定。结果 ELISA结果表明，制备的HCVE2人源单链抗体（吸光度值A450为1.88)能与HCVE2抗原特异性结合，免疫组织化学结果表明，该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织HCVE2抗原，与正常肝组织及乙型肝炎病毒（HBV）抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好，特异性强，且制备方法简便，周期短，为HCVE2病原的检测提供了新的有效的试剂。     

抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬菌体抗体库的初建

目的 建立抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬体抗体库,为进一步获得功能性抗体可变区基因,制备单链抗体和单链抗体－辣根过氧化物酶融合蛋白,用于甲状腺自身免疫性疾病的治疗和检测打下基础,方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗甲状腺刺激性免疫球蛋白的杂交瘤细胞中扩增出轻重链可变区基因,与噬粒表达载体ｐ３ＳＣＭＨ连接,转化大肠杆菌,以甲状腺刺激性免疫球蛋白阳性患者血清ＩｇＧ为抗原对表达的噬菌体抗体进行筛选,结     

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体

目的从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。方法用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。结果第三轮淘筛后洗脱下来的噬菌体,较第一轮增加80倍,含有抗体轻链基因和重链基因的克隆,也由淘筛前的17%增至100%,经ELISA证实,筛选到的抗HBsAg噬菌体抗体对HBsAg具有良好的结合活性,而与牛血清白蛋白和HAVAg等无关抗原均不反应。结论HBsAg对抗体库的淘筛,富集了表面呈现抗HBsAg的单克隆抗体的噬菌体。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构蛋白（ＮＳ）３的人单链抗体（ＳｃＦｖ）,以解决鼠单抗蝗免疫原性问题,为ＨＣＶ的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的ＨＣＶＮＳ３为包被抗原,从噬菌体单链楞变区抗体库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的ＨＣＶＮＳ３人单链抗体（ＳｃＦｖ片段）阳性克隆,并对其进行免疫体及序列测定。结果 筛选出来的ＳｃＦｖ片段     

Expression and identification of recombinant soluble single—chain variable fragment of monoclonal antibody MC3

AIM: To generate soluble single chain variable fragments (ScFv) of monoclonal antibody MC3 recognizing colorectal and gastric carcinomas. METHODS: mRNA was isolated from the hybridoma cell line producing MC3 and the DNAs encoding variable domains of heavy and light chains (VH and VL) of the antibody were amplified separately by RT-PCR and assembled into ScFv DNA with a linker DNA. The ScFv DNA was ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into E.coli TG1.The transformed cells were infected with M13KO7 helper phage to yield recombinant phages. After two rounds of panning with gastric carcinoma cell line AGS highly expressing MC3-binding antigen, the phage clones displaying ScFv fragments of the antibody were selected by ELISA. 4 phage clones showing strong signal in ELISA were used to infect E.coli HB2151 to express soluble ScFvs. The soluble ScFvs were identified by Dot blot and Western blot, and their antigen-binding activity was assayed by ELISA. The VH and VL DNAs of the ScFv DNA derived from phage clone 19 were sequenced. RESULTS: The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp, 320 bp and 750 bp respectively. After two rounds of panning to the recombinant phages, 18 antigen-positive phage clones were selected from 30 preselected phage clones by ELISA. All the soluble ScFvs derived from the 4 out of the 18 antigen-positive phage clones were about M(r)32000 and concentrated in periplasmatic space under the given culture condition. The soluble ScFvs could bind the antigen, and they shared the same binding site with MC3. The sequences of the VH and VL DNAs of the MC3 ScFv showed that the variable antibody genes belonged to the IgG1 subgroup,kappa-type. CONCLUSION: The soluble ScFv of MC3 is successfully produced, which not only provides a possible novel targeting vehicle for in vivo and in vitro study on associated cancers, but also offers the antibody a stable genetic source.     

单抗MGb1的噬菌体呈现型ScFv片段的制备

目的 制备胃癌单抗ＭＧｂ１的噬菌体呈现型单链可变区片段（ＳｃＦｖ）,为获得用于胃癌体内诊疗研究的靶向载体分子奠定基础。方法 从杂交瘤细胞分离ｍＲＮＡ,扩增抗体重,轻链可变区（ＶＨ和ＶＬ）ｃＤＮＡ,经ｌｉｎｋｅｒＤＮＡ连接形成ＳｃＦｖ ＤＮＡ。将ＳｃＦｖＤＮＡ与ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ的连接产物转化于大肠杆菌ＴＧ１,经Ｍ１３ＫＯ７感染后,获得重组噬菌体抗体ＳｃＦｖ。经亲和筛选和ＥＬＩＳＡ检测获得呈现ＭＧｂ     

乙型肝炎病毒表面抗原人源单链可变区抗体基因的克隆与鉴定

目的 筛选,鉴定抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗ＨＢＶ的基因治疗研究奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以氯化铯超速离心法纯化的ＨＢｓＡｇ蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”淘洗过程,获得抗原结合活性较强的ＨＢｓＡｇ人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫     

Construction and selection of the natural immune Fab antibody phage display library from patients with colorectal cancer

AIM:To construct the natural immune Fab antibody phagedisplay libraries of colorectal cancer and to select antibodiesrelated with colorectal cancer.METHODS:Extract total RNA from tissue of local cancermetastasis lymph nodes of petients with colorectal cancer.RT-PCR was used to amplify the heavy chain Fd and lightchain k and the amplification products were insertedsuccessively into the vector pComb3 to construct the humanlibraries of Fab antibodies.They were then panned by phagedisplay technology.By means of Dot immunoblotting andEUSA,the libradse were identified and the Fab phageantibodies binding with antigens of colorectal cancer wereselected.RWSULTS:The amplified fragments of Fd and k gained byRT-PCR were about 650bp.Fd and k PCR products weresubsequently inserted into the vector pComb3,resulting in arecombination rate of 40% and the volume of Fab phagedisplay library reached 1.48×10~6.The libraries wereenriched about 120-fold by 3 cycles of adsorption-elution-multiplication(penning).Dot immunoblotting showed Fabexpressions on the phage libraries and ELISA showed 5clones of Fab phage antibodies which had binding activitieswith antigens of colomctal cancer.CONCLUSION:The nstuml immune Fab antibody phagedisplay libraries of colorectal cancer were constructed.Theycould he used to select the relstive antibodies of colorectalcancer.     

Identification of tumor associated single-chain Fv by panning and screening antibody phage library using tumor cells

AIM：To study the feasibillity of panning and screening phage-displaying recombinant single-chain variable fragment (ScFv)of anti-tumor monoclonal antibodies for fixed whole cells as the carriers of mAb -binding antigens.METHODS:The recombinant phage displaying libraries for anti-colorectal tumor mAb MC3Ab,MC5Ab and anti-gastric tumormAb mGD1was constructed.Panning and screening were carried out by means of modified fixation of colorectal and gastric tumor cells expressed the mAb-binding antigens.Concordance of binding specificity to tumor cells between phage clones and parent antibodies was analyzed.The phage of positive clones was identified with competitive ELISA,and infected by E.coliHB2151to express soluble ScFv.RESULTS:The ratio of positive clones to MC3-ScF-MC5-ScFv and MGD1-ScFv were 60%,24%and30%,mC3-ScFvandMGD1-ScFvwere60%,24%and 30%.MC3-ScFvhadMr32000confirmed by western blot.The specificity to antigen had no difference between 4positive recombinant phage antibodies and MC3Ab.CONCLUSION:The modified process of fixing whole tumor cells is efficient,convenient and feasible to pan and screen the phage-displaying ScFv of anti-tumor monoclonal antibodies.