蛋白激酶C对腹膜间皮细胞己糖激酶活性的调控

目的研究蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）对腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelium cell,PMC）己糖激酶（hexokinase,HK）活性的调节作用,以及HK活性与PMC对葡萄糖摄取的相关性。方法大网膜取自雄性SD大鼠,胰蛋白酶-EDTA消化法用于PMC的原代培养及传代,细胞角蛋白抗体的间接免疫荧光染色用于PMC的鉴定;6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法检测HK活性,观察PKC激活剂——佛波酯（PMA、PDD）及经典型PKC（classical PKC,cPKC）抑制剂——Goe6976对HK活性的影响;比色法检测培养液内葡萄糖的消耗量作为细胞对葡萄糖净利用指标。结果原代培养的PMC24h贴壁,5～8d融合,形成铺路石样外观,细胞角蛋白在胞浆阳性表达。PMA对HK活性的诱导呈时间和剂量依赖性,并增加了PMC对葡萄糖的净利用。0．01、0．1及1μmol／L的PMA作用24h后,HK活性分别提高30．7％、59．9％及99．1％（P〈0．05）。1μmol／L的PMA作用于PMC,6h后HK活性开始上调,24h时达到高峰（分别为21．3％和100．4％,P〈0．05）,培养液内的葡萄糖基本消耗一半（2mmol／L,P〈0．05）。0．1μmol／LPDD对HK活性的诱导与1μmol／L的PMA作用相似,PDD的结构相似物4α—PDD对HK活性无上述作用。G66976抑制了PMA对HK活性的诱导。10、20、30、40及50Ixmol／L的Goe976预处理PMC30min,再予1μmol／LPMA培养24h,HK活性分别抑制了14．6％、26．8％、34．2％、44．2％及54．9％（P〈0．05）。结论PKC使HK活性上调,增加了细胞对葡萄糖的净利用,可能与长期腹膜透析后PMC对葡萄糖的吸收加速有关;cPKC抑制剂对HK活性的阻断可能成为提高腹膜透析超滤的有效途径之一。     

高糖和脂多糖对腹膜间皮细胞己糖激酶活性的调节作用

目的:研究高糖和脂多糖(LPS)对腹膜间皮细胞(PMC)己糖激酶(HK)活性的调节作用。方法:行PMC的原代培养及鉴定。首先将不同浓度的葡萄糖(0.10,1.50,2.50,4.25%)分别和不同剂量的LPS(0,0.1,1.0,10.0,50.0,100.0mg/L)加入培养基;其次用含4.25%葡萄糖和10.0mg/LLPS的培养基孵育细胞不同时间(0,1,3,6,12,24h);6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法测定HK活性。最后用含10.0mg/LLPS的培养基孵育细胞不同时间(0,1,3,6,12,24h);测定HK活性和细胞葡萄糖的摄入量,分析HK活性与葡萄糖摄入量的相关性。结果:高糖和LPS对HK的活性具有交互作用(F=423.55,P<0.01)。高糖和LPS以剂量(P<0.01)和时间依赖的方式诱导HK活性(P<0.01);LPS以时间依赖的方式促进PMC葡萄糖净利用(P<0.01)。结论:高糖和LPS对PMC己糖激酶活性的调节作用在腹膜透析失超滤的过程中发挥了重要的作用。     

人腹膜间皮细胞的原代培养及传代

目的探讨建立一种有效的HPMC体外原代培养及传代的方法。方法用0.25%的胰蛋白酶0.02%EDTANa2消化腹部择期手术者大网膜组织,细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养。采用形态学、免疫组织化学（ABC法）、电镜等鉴定细胞。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路样鹅卵石状,免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,电镜下可见细胞表面的微绒毛,证明培养的细胞的为HPMC。结论胰蛋白酶消化法是一种简单实用的培养HPMC的方法 。     

d-α-生育酚对高糖诱导的人腹膜间皮细胞己糖激酶表达的调节作用

目的探讨d-α-生育酚对高糖诱导的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelium cell,HPMC)己糖激酶(hexokinase,HK)及其同工酶表达的调节作用。方法胰蛋白酶消化法分离培养HPMC,免疫细胞化学染色及扫描电镜对培养细胞进行鉴定。第3代HPMC分为正常对照组(0．1％葡萄糖,相当于5．5 mmol／L)、高糖组(0．5％、1．0％、1．5％、2．5％、4．25％的葡萄糖)及d-α-生育酚干预组。培养24 h后,利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶耦联比色法和温度敏感实验检测HK及其同工酶的活性;免疫细胞化学染色检测HK蛋白的细胞内定位;Western印迹及逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)法分别检测HK蛋白及mRNA的表达。己糖激酶法检测培养液内葡萄糖的消耗量作为细胞对葡萄糖净利用指标。结果角蛋白和波形蛋白在HPMC的胞质呈阳性表达,扫描电镜可见细胞表面有丰富的微绒毛。1．5％、2．5％及4．25％葡萄糖组,HK总活性上调,与正常对照组(20．6±2．5)U／g蛋白比较,相对活性分别为115．4％、129．1％及155．2％,并以HKⅡ增加为主(P<0．05)。50 mmol／L d-α-生育酚干预组,HK总活性下调,是2．5％葡萄糖组的82．1％(P=0．001),其中HKⅡ受抑为主;d-α-生育酚干预后HPMC对葡萄糖的净利用由(25．3±3．9)mmol／L降至(17．3±2．1)mmol／L(P= 0．018)。正常状态下,HKⅡ蛋白在胞质呈棕色淡染;随葡萄糖浓度的增加(葡萄糖≥1．5％),HKⅡ在核周积聚、浓染,呈珠链样;d-α-生育酚预处理后,HKⅡ在核周的积聚变淡。HKⅡ蛋白及mRNA的表达与HKⅡ活性同步。结论d-α-生育酚抑制了高糖对HKⅡ活性、蛋白及mRNA表达上调的作用,并减少HPMC对葡萄糖的净利用;可能成为增加腹膜透析超滤的手段之一。     

高糖对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响

目的：通过观察高糖对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响,从多元醇通路的角度探讨高糖造成腹膜间皮细胞损伤的可能机制。方法：采用人的网膜作为细胞来源,胰蛋白酶-EDTA消化法进行人腹膜间皮细胞的分离、培养,间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定。第2-3代细胞同步后用于实验。观察葡萄糖浓度及其作用时间对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响。应用紫外分光光度计记录NADPH在340nm处吸光值的下降表示醛糖还原酶活性。结果：①醛糖还原酶活性随葡萄糖浓度的增加而显著增加。②随着葡萄糖作用时间的延长,醛糖还原酶活性逐渐增加。结论：高糖以时间及剂量依赖的方式使腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性增加。     

大鼠腹膜间皮细胞的分离培养方法

目的建立简便有效的大鼠腹膜间皮细胞(passage of rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)的体外培养方法。方法采用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化大鼠大网膜及脾胃韧带,细胞悬液进行离心培养,沉淀重悬后进行培养。通过形态学、免疫荧光、免疫组化法鉴定细胞。结果分离培养的细胞在光镜下呈铺路鹅卵石状,免疫荧光鉴定显示细胞角蛋白阳性,免疫组化鉴定显示波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,证实培养的细胞为RPMC。结论胰蛋白酶消化法是一种简便而实用的分离RPMC的方法。     

一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响

目的通过观察一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶（AR）活性的影响，探讨一氧化氮对腹膜间皮细胞醛糖还原酶的调节作用。方法采用人的网膜作为细胞来源，胰蛋白酶-EDTA消化法进行人腹膜间皮细胞（HPMC）的分离、培养，间接免疫荧光法对第二代细胞进行鉴定。第2-3代细胞用于实验。以硝普纳为一氧化氮供体，硝普纳（0．5mmol／L、1mmol／L、2mmol／L）＋1．5％葡萄糖培养液为实验组，以无一氧化氮1．5％葡萄糖培养液为对照组，观察剂量及时间对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响。应用紫外分光光度计记录NADPH在340nm处吸光值的下降表示醛糖还原酶活性。结果高糖状态下各浓度一氧化氮组醛糖还原酶活性均高于对照组，且醛糖还原酶活性随一氧化氮浓度的增加而增加；一氧化氮＋葡萄糖组醛糖还原酶活性随着时间的延长而逐渐增加。各时点一氧化氮＋葡萄糖组醛糖还原酶活性均高于葡萄糖组。结论一氧化氮以时间及剂量依赖的方式使腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性增加。     

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液改善脂多糖-高糖腹膜透析液诱导的人腹膜间皮细胞损伤的实验研究

目的 评估丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（STS）减轻脂多糖-高糖腹膜透析液（LPS-PDS）诱导的人腹膜间皮细胞（HPMCs）损伤以及抑制腹膜纤维化的作用。方法 HPMCs来自腹腔外科手术患者腹膜细胞的原代培养。以LPS-PDS诱导的HPMCs损伤为模型,通过观察STS对HPMCs增殖活性、转化生长因子-β（TGF-β1）分泌、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、组织基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP1）等的影响,阐明STS对HPMCs的保护作用及抗腹膜纤维化的机理。结果 LPS-PDS可造成HPMCs损伤,表现为活性下降,STS可明显减轻LPS-PDS对HPMCs的毒性,改善其造成的细胞活性下降,减轻LPS-PDS诱导的TGF-β1、TIMP1 mRNA上调和MMP-9 mRNA表达下降。结论 STS可以减轻LPS-PDS诱导的HPMCs损伤,可能是通过调节TGF-β1、TIMP1、MMP-9等蛋白的表达,发挥保护腹膜细胞和拮抗腹膜纤维化的作用。      

高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白的影响

目的研究高糖对人腹膜间皮细胞间隙连接蛋白（connexin43）表达的影响。方法分离培养人腹膜间皮细胞,细胞分为3组：正常糖组（含5．5mmol／L葡萄糖）、高糖组（含140mmol／L葡萄糖）和渗透压对照组（含5．5mmol／L葡萄糖加24．5mmol／L甘露醇）,培养24、48h后,应用Northernblot、Westernblot方法检测connexin43mRNA和蛋白质表达,比较3组之间的差异。结果正常糖组腹膜问皮细胞表达丰富的connexin43,高糖环境下培养的腹膜间皮细胞connexin43mRNA和蛋白质表达均较正常糖组显著下降（P〈0．05）。渗透压对照组与正常糖组之间无明显差异（P〉0．05）。结论高糖可抑制腹膜间皮细胞connexin43mRNA和蛋白质表达,可能为腹膜透析（PD）中腹膜间皮层完整性损伤的机制之一。     

大鼠软脑膜间皮细胞的原代培养与鉴定

目的建立一种有效的大鼠软脑膜间皮细胞体外培养方法。方法用机械吹打法和2.5 g.L-1胰蛋白酶轻消化法剥离SD乳鼠软脑膜组织后培养。采用倒置相差显微镜、苏木素-伊红染色、扫描电子显微镜、细胞免疫荧光及免疫细胞化学法鉴定细胞。结果倒置显微镜示细胞融合后呈多边形;苏木素-伊红染色显示细胞呈多角形,胞浆薄染为淡红色;扫描电子显微镜下见细胞有丰富的微绒毛;细胞免疫荧光显示大鼠软脑膜间皮细胞可表达细胞角蛋白;免疫细胞化学法鉴定显示细胞角蛋白、波形蛋白抗原阳性表达,第Ⅷ因子相关抗原及磷酸盐缓冲液空白对照呈阴性。结论机械吹打法和胰蛋白酶轻消化法培养软脑膜间皮细胞的方法切实可行,可为脑膜纤维化及脑积水的形成机制研究提供实验模型。     

不同浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞表达p21WAF1的影响

【目的】观察不同浓度的葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞p2 1WAF1表达的影响。【方法】大鼠腹膜间皮细胞在含糖13 8g/L和 38 6g/L的无血清培养基培养 2 4h后 ,用流式细胞仪分析细胞周期分布 ,用RT PCR法测定p2 1WAF1的表达水平。【结果】经含糖 13 8g/L和 38 6g/L培养基培养 2 4h后腹膜间皮细胞大多出现细胞肥大和停滞于细胞周期的G1期 ,以 38 6g/L组明显。高浓度葡萄糖刺激p2 1WAF1mRNA表达 ,38 6g/L组表达明显增高 (P <0 0 5 ) ;无血清常规培养基组和甘露醇组几乎无表达。【结论】高糖可刺激间皮细胞p2 1WAF1的表达 ,且可能与高糖作用下细胞肥大及G1期阻滞有关。     

不同浓度腹透液对大鼠腹膜间皮细胞单核细胞趋化蛋白-1的影响

目的探讨非感染状态下,腹透液（PDF）对腹膜间皮细胞（PMCs）产生单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响,及其与持续性不卧床腹膜透析（CAPD）相关性腹膜硬化的关系。方法将40只大鼠随机分为5组,除正常对照组外分别给予1.5%、2.5%和4.25%PDF及NS腹腔注射,40ml/d,第15天取标本检测PMCs中MCP-1mRNA表达,血清和PDF中MCP-1浓度,腹膜纤维连接蛋白（FN）的表达。结果3个腹透液实验组PMCs中MCP-1mRNA表达,4.25%腹透液组高于2.5%组和1.5%组,差异具有显著性（P〈0.05）;PDF中MCP-1水平和腹膜中FN表达,4.25%腹透液组最高,但与2.5%和1.5%组比较差异没有显著性。血清中的MCP-1水平在5组中未见显著差异（P〉0.05）,且均低于PDF中。FN水平与PMCs中MCP-1mRNA表达和PDF中MCP-1蛋白质水平均呈正相关。结论高浓度PDF可使PMCs中MCP-1mRNA表达升高。MCP-1升高可能是CAPD相关性腹膜硬化的原因之一。大量NS灌入腹腔也可导致腹腔炎症状态。     

肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞的增殖及其表达白细胞介素-1中的作用

目的:初步观察肝素在高糖影响大鼠腹间皮细胞(Rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)增殖及其表达白细胞介素-1,(Interleukin-l,IL-l)中的作用,从而为持续性非卧床腹膜透析(Continuous ambulatory peritoneal dialysis,CAPD)中肝素的临床应用打下一定的理论基础。方法:建立RPMC的体外培养;并用四四氮唑蓝(MTT)细胞增殖实验和酶联免疫吸附方法(ELISA),来分析肝素对高糖(3.86％葡萄糖)影响RPMC增殖及其分泌IL-l的作用。结果:3.86％葡萄糖能显著抑制RPMC的增殖,而1.25U/ml肝素能部分逆转高糖对RPMC增殖的抑制作用(P <0.01),3.86％葡萄糖能显著增加RPMC表达IL-1β,而1.25U/ml肝素能部分减少高糖增加RPMC表达IL-1β的作用(P<0.01)。结论:本文结果提示,肝素可能通过逆转高糖对RPMC的增殖抑制作用及减少高糖增加RPMC表达促炎细胞因子IL-l的作用,而延缓CAPD相关性腹膜纤维化的发生,最终有益于CAPD进行。     

罗格列酮对脂多糖作用下及高糖对大鼠腹膜间皮细胞TLR2 mRNA表达的影响

目的观察罗格列酮对脂多糖(LPS)作用下大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)toll样受体2(TLR2)mRNA表达的影响;观察高糖对RPMC的TLR2mRNA表达的影响。方法胰蛋白酶法行RPMC的原代培养和传代,经鉴定第3代细胞融合至80%时分组。正常对照组:不同浓度LPS(1,10,100μg/ml)作用8h组;10μg/mlLPS作用不同时间(2,6,12h)组;10μg/mlLPS预孵育2h后,加入罗格列酮(10μmol/L)再作用4h组;不同浓度葡萄糖(1.5%,2.5%,4.25%)作用8h组;2.5%葡萄糖作用不同时间(5,10,20h)组。RT-PCR技术检测TLR2mRNA的表达。结果LPS及高糖均可刺激RPMC的TLR2mRNA表达显著增加,呈剂量依赖性(P<0.05),并且LPS作用下RPMC的TLR2mRNA表达增加在12h内呈时间依赖性(P<0.05),高糖作用下RPMC的TLR2mRNA表达增加在20h内呈时间依赖性(P<0.05);罗格列酮可抑制由LPS刺激导致的TLR2mRNA表达上调(P<0.05)。结论LPS及高糖可上调体外培养RPMC的TLR2mRNA表达,罗格列酮可拮抗LPS对TLR2mRNA的表达上调作用。     

腹透液CA125水平与腹膜转运的关系

目的探讨腹透患者检测癌抗原125(CA125)的临床意义以及间皮细胞在腹膜转运中的作用。方法采用4.25%葡萄糖浓度的腹透液对34例腹透患者行腹膜平衡试验,于腹透液留腹4h时采集10mL用放免法测定CA125浓度,并用体表面积校正。收集0、1、4h的透析液及1h的血标本,测定肌酐和葡萄糖浓度,记录净超滤量(nUF),计算4h透析液肌酐与血肌酐浓度之比(D/Pcr)、肌酐转运面积系数(MTACcr)、葡萄糖吸收率(Glu%)、1h透析液钠与血钠比值(D/PNa+)等溶质和液体转运参数。结果腹透液CA125平均浓度为(7.39±4.47)U·mL-1·1.73m～2。腹透液CA125水平与患者腹透龄呈显著负相关(P<0.05);与D/PNa+弱正相关(P<0.05);与溶质转运参数D/Pcr、MTACcr、Glu%、nUF不相关。结论动态观察腹透液CA125水平可间接了解腹膜间皮细胞状态。随着腹透治疗时间的延长,腹膜间皮细胞的数量会逐渐减少。腹透时间皮细胞不是溶质转运的一道重要滤过屏障。     

腹膜间皮细胞在腹膜纤维化中的作用及机制研究进展

腹膜间皮细胞(PMCs)是腹膜组织的结构细胞,在腹膜纤维化(PF)的发生和发展过程中起着重要作用。PMCs损伤和凋亡是引发和促进PF增生的始动因素之一,其损伤后一方面导致腹膜结构发生改变,同时其分泌蛋白酶、炎性细胞因子及其他促纤维化因子,引起腹膜间质细胞的激活和基质重构,从而触发了PF的发生和发展。另外,PMCs在PF过程中的作用与上述因素及其他细胞(尤其是成纤维细胞)之间的相互作用有关。体外研究发现,PMCs在肿瘤坏死因子β1的诱导下可以向间充质细胞转化,但其在PF过程中所起的作用及分子机制尚有待进一步阐明。     

大鼠胸膜间皮细胞培养方法的研究

目的:建立大鼠胸膜间皮细胞的培养方法.方法:采用组织块法和酶消化法培养大鼠胸膜间皮细胞,通过胸膜细胞形态学鉴定方法,对两种方法培养的细胞进行鉴定.结果:组织块法培养大鼠胸膜间皮细胞获得成功.结论:组织块法培养大鼠胸膜间皮细胞成本低、简便易行.     

罗格列酮对尿酸致腹膜间皮细胞损伤的干预作用

目的观察PPAR-γ激动剂罗格列酮对尿酸致腹膜间皮细胞（HPMC）增殖、损伤作用的影响。方法①细胞培养及分组：待生长状况良好的HPMC株60％-80％细胞贴壁后,无血清培养基同步24h,采用15μmol／L罗格列酮预处理细胞4h后,给予600μmol／L尿酸不同作用时间（24h、48h、72h）进行干预。②指标检测：采用细胞活性检测法检测HPMC增殖情况;采用乳酸脱氢酶测定试剂盒,检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）水平。结果①600μmol／L尿酸作用HPMC24h、48h、72h后,抑制HPMC增殖;与对照组比较,抑制增殖作用明显（P〈0．05）,差异有统计学意义;罗格列酮干预后,各不同时间点,尿酸对HPMC抑制作用减弱。②600μmol／L尿酸作用HPMC24h、48h、72h后,HPMC培养液中LDH水平增高,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;罗格列酮干预后,各不同时间点,HPMC培养液中LDH水平降低（P〈0．05）。结论罗格列酮能够降低尿酸对HPMC增殖抑制、损伤作用。