人肝癌组织伴生成纤维细胞的体外培养及其生物学性状的初步探讨

目的:体外培养人肝癌组织伴生成纤维细胞,观察其生长状态,为进一步研究其功能奠定基础。方法:应用组织块培养法进行人肝癌伴生成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、免疫组织化学方法检测细胞膜波形蛋白(v im entin)、角蛋白(keratin)表达情况,对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第2次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3代以后基本可获得呈典型克隆性生长、长梭形纤维样细胞,生长周期短。免疫组化染色结果为v im entin染色阳性,keratin染色阴性。结论:在体外成功培养了人肝癌组织伴生成纤维细胞,并对其生物学性状进行了初步探讨,为进一步研究其与肝癌细胞生长、浸润及转移的关系等机制奠定了基础。     

肥大细胞对肺成纤维细胞生长及胶原合成的影响

目的:通过肥大细胞与肺成纤维细胞接触和非接触共体培养观察,了解肥大细胞对肺成纤维细胞生长及胶原合成的影响。方法:分离成年大鼠肺成纤维细胞和腹腔肥大细胞,实验分为三组:对照组,正常大鼠肺成纤维细胞培养;接触共育组,肥大细胞与肺成纤维细胞接触共体培养;非接触共育组,肥大细胞与肺成纤维细胞非接触共体培养。每组设3复孔,并作细胞爬片,共培养5 d,每日镜下计数肺成纤维细胞数量,建立生长曲线,5 d后用MTT比色法测定肺成纤维细胞增殖率,通过ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原蛋白含量。结果:①细胞计数显示:接触共育组各时段成纤维细胞的数目均较非接触共育组和对照组明显增多。接触共育组中成纤维细胞增殖数与非接触共育组和对照组比较,有明显差异(P<0.05);非接触共育组和对照组比较,差异不明显(P>0.05)。②MTT结果:接触共育组肺成纤维细胞光密度值明显高于对照组和非接触共育组(P<0.05),提示接触共育组肺成纤维细胞增殖明显高于对照组和非接触共育组,非接触共育组比对照组也高,但差异不明显(P>0.05)。③ELISA法检测结果提示,在肥大细胞与肺成纤维细胞接触共育培养组,培养液中Ⅰ型胶原蛋白含量明显高于非接触共育组和对照组(P<0.05),提示接触共育组肺成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白明显增加,非接触共育组比对照组也高,但差异不明显(P>0.05)。结论:肥大细胞影响肺成纤维细胞的增殖及胶原合成;肥大细胞可能通过紧密接触来促进肺成纤维细胞的增殖及胶原合成。     

硬皮病皮损成纤维细胞整合素表达的免疫电镜观察*

目的：研究硬皮病皮损成纤维细胞整合素表达及细胞超微结构特征。方法：将培养的硬皮病皮损成纤维细胞置包被纤维粘连蛋白的培养瓶中作粘附培养,运用间接免疫胶体金技术在电镜下观察成纤维细胞表面整合素α5,β1亚基表达、分布特征及细胞超微结构变化。结果：硬皮病皮损成纤维细胞整合素α5,β1亚基表达均较正常成纤维细胞显著增加（P<0.01）,并呈簇集分布的特征;细胞内骨架成分微丝密集成束。结论：整合素α5,β1介导的纤维粘连蛋白与成纤维细胞相互作用在硬皮病时增强。     

不同浓度胎牛血清对原代心肌成纤维细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨不同浓度胎牛血清体外培养对原代心肌成纤维细胞增殖和分化的影响。方法: 用酶消及差速贴壁法分离并培养SD乳鼠心肌成纤维细胞;采用不同浓度胎牛血清（1%、5%、10%和20%）培养心肌成纤维细胞并观察细胞形态,免疫荧光共聚焦法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白表达,划痕实验检测心肌成纤维细胞的迁移能力,CCK8实验检测心肌成纤维细胞的增殖能力。结果: 随着胎牛血清浓度升高,细胞形态逐渐变圆,细胞表面积增加,α-SMA阳性细胞比例增加,心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化增多,细胞迁移能力增加。高浓度胎牛血清（20%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最旺盛,低浓度胎牛血清（1%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最低,5%和10%胎牛血清培养时心肌成纤维细胞增殖均旺盛。结论: 高浓度胎牛血清培养会导致心肌成纤维细胞分化,5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较10%和20%胎牛血清培养分化程度少,增殖能力较1%胎牛血清好,选用5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较好。     

肺癌H460细胞与胚肺成纤维细胞相互作用对基质金属蛋白酶-2的表达影响

目的：研究肺癌H460细胞和胚肺成纤维细胞相互作用对基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响．方法：在单层平面培养条件下,H460细胞和胚肺成纤维细胞条件培养基或胚肺成纤维细胞和H460细胞条件培养基共同培养,胚肺成纤维细胞分别按1：1,1：2,1：4,1：8与H460细胞共同培养．三维胶原立体培养条件下,H460细胞和胚肺成纤维细胞共同培养,72h后明胶酶谱法测定培养基中MMP-2的表达．结果：胚肺成纤维细胞条件培养基不能促进H460细胞MMP-2酶原和活化酶的表达,但H460细胞条件培养基能促进胚肺成纤维细胞MMP-2酶原和活化酶的表达．胚肺成纤维细胞分别按1：1,1：2,1：8与肺癌H460细胞时共同培养时,MMP-2酶原和活化酶的表达均增强;按1：4与肺癌H460细胞共同培养时MMP-2酶原表达有所增加,但活化酶未见改变．三维胶原立体H460细胞和胚肺成纤维细胞共同培养时MMP-2酶原和活化酶的表达均增强且高于单层平面培养．结论：肺癌H460细胞与胚肺成纤维细胞相互作用能通过上调MMP-2的表达和活化影响肺癌侵袭和转移．     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

正常人皮肤成纤维细胞不同培养条件下的生物学特性

目的 观察成纤维细胞在不同培养条件下生长,增殖,代谢及蛋白质合成等情况,探讨成纤维细胞的最佳培养模型。方法 将正常皮肤中的成纤维细胞（NsFb）分离出来并进行原代及继代培养,之后建立不同的成纤维细胞培养系统,分别利用绘制细胞生长曲线,^3H-胸腺嘧啶（^3H-TdR）掺入及^3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖,DNA代谢及胶原合成等情况,研究细胞在不同条件下的生物学特性。结果 成纤维细胞在单层及纤维蛋白胶中培养时细胞的增殖,代谢及蛋白质合成等生物学功能均明显强于两种胶原凝胶中培养时的情况。结论 以纤维蛋白胶为支架的三维培养系统能更好地模拟生理条件下创面愈合时成纤维细胞的生物学特性。     

维拉帕米对瘢痕成纤维细胞β1、α1-4整合素表达的影响

目的：了解维拉帕米对瘢痕成纤维细胞表达β1、α1-4整合素的影响,并从整合素功能角度探讨其抗瘢痕增生挛缩作用机制。方法：瘢痕成纤维细胞体外培养,利用原位ELISA技术检测瘢痕成纤维细胞在维拉帕米作用下后表达整合素的水平。结果：不同浓度的维拉帕米对瘢痕成纤维细胞膜上的β1、α1-4整合素粘附分子表达均有着不同程度的抑制作用,其中对β1、α1、α2、α3和α4整合素的最大抑制作用浓度分别达21.01%、27.47%、11.44%、30.77%和29.60%;另外,瘢痕成纤维细胞在低浓度维拉帕米作用时对其细胞形态无明显影响,而当维拉帕米浓度超过50ug/ml时,可造成细胞体积缩小、间隙增大。结论：维拉帕米对瘢痕成纤维细胞β1、α2、α3和α4整合素表达有较为显著的抑制作用;通过抑制细胞整合素粘附分子表达不但对细胞的生物学活性有一定影响,而且对细胞与细胞外间质之间的收缩动力传导起阻滞作用。由此提示,维拉帕米具有良好的抗瘢痕增生挛缩作用。值得进一步研究探讨。     

损伤后脑膜成纤维细胞对星形胶质细胞活性及胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的 体外观察损伤后脑膜成纤维细胞对星形胶质细胞活性及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法 体外分别培养SD大鼠大脑皮层的星形胶质细胞和大脑脑膜的成纤维细胞,经GFAP和纤维粘连蛋白(FN)免疫荧光染色鉴定后,将损伤后成纤维细胞来源条件培养基与星形胶质细胞共培养,根据成纤维细胞损伤时间不同分为正常对照组(A组)、损伤4h组(B组)、损伤24 h组(C组)、损伤72 h组(D组),应用CCK8试剂检测星形胶质细胞的活性,通过GFAP免疫荧光染色观察星形胶质细胞GFAP表达.将损伤的成纤维细胞与星形胶质细胞接触共培养72 h,根据与成纤维细胞的距离,将星形胶质细胞分为近(J)组和远(Y)组,通过FN和GFAP双重免疫荧光细胞化学染色观察GFAP表达.结果 B组星形胶质细胞活性低于A、C、D组(P＜0.05);非接触共培养时,C组星形胶质细胞GFAP表达强度显著高于B、D组(P＜0.05);接触共培养时,J组星形胶质细胞的GFAP表达强度显著高于Y组(P＜0.05).结论 损伤后脑膜成纤维细胞能触发星形胶质细胞反应性胶质化.     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

无血清培养人肝癌细胞增生率的变化和bFGF在细胞中的表达

采用无血清培养体系 ,研究肿瘤细胞自分泌调控机制。将人肝癌细胞培养在无血清无外源分裂因子培养基中 ,采用细胞原位计数法和免疫组织化学染色法 ,观察不同时相人肝癌细胞增生率的变化以及碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)的表达情况。结果 :人肝癌细胞生长良好 ,其增生速度与其分泌的bFGF量成正比。提示 :肝癌细胞在无外源生长因子的条件下通过分泌bFGF ,以自分泌和旁分泌的方式作用于自身和相邻细胞 ,促进细胞生长和增生。     

分泌甲胎蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原的肝癌细胞株的建立

CZHC/8571细胞株来源于1例血清甲胎蛋白(AFP)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性的肝细胞型肝癌伴慢性活动性肝炎患者。采用组织块培养法,9个月共传25代。从第10代开始进行生物学特性检测,其细胞形态和糖原染色经光学和电子显微镜观察均与原始癌细胞一致;细胞生长指数、分裂指数和倍增时间分别为7.9、70‰和64h;染色体主流数为84;C组染色体数目普遍增多,结构异常可见单、双体断裂、易位和环状染色体;浓缩20倍的24h培养液中即可测及AFP(对流法阳性);分别以5×10~6个细胞接种3只裸鼠,50～60d后均形成移植瘤。结果表明CZHC/8571细胞株是具有能产生和分泌AFP、HBsAg功能的人类肝癌细胞株。     

MicroRNA-150-5p对肝细胞癌细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的  研究microRNA-150-5p（miR-150-5p）在人正常肝细胞和肝细胞癌细胞中的表达，及其对肝细胞癌细胞增殖、凋亡和周期的影响及潜在机制。方法  通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各处理组细胞中的miR-150-5p的表达水平；MTT法检测miR-150-5p对肝细胞癌细胞增殖的影响；流式细胞术检测miR-150-5p对肝细胞癌细胞凋亡和周期的影响；荧光素酶报告基因实验检测锌指蛋白609是否为miR-150-5p的直接靶基因。结果  miR-150-5p在肝细胞癌细胞系中的表达较人正常肝细胞细胞系降低，miR-150-5p可抑制肝细胞癌细胞的增殖，促进肝细胞癌细胞的凋亡，并阻滞细胞周期于G1期。miR-150-5p在肝细胞癌中发挥肿瘤抑制分子作用的潜在机制为直接靶向抑制ZNF609的表达。结论  miR-150-5p在肝细胞癌细胞中表达降低，并可通过调控ZNF609的表达而调控肝细胞癌细胞增殖、凋亡和周期。

     

肿瘤相关成纤维细胞对胆囊癌细胞生长和侵袭的影响

目的研究人胆囊癌相关成纤维细胞（CAFs）的培养方法及其对胆囊癌细胞生物学行为的影响,探讨CAFs在胆囊癌发生
发展中的作用。方法采用酶消化法及组织块法进行人胆囊癌CAFs的原代培养,采用差速贴壁法进行纯化,免疫细胞化学及细
胞免疫荧光进行鉴定;噻唑蓝（MTT）法检测CAFs对胆囊癌细胞增殖能力的影响,Transwell小室法检测CAFs对癌细胞侵袭能
力的影响。结果酶消化法及组织块法均可获得人胆囊癌CAFs,以酶消化法更为简便、高效;MTT及Transwell侵袭实验证实
CAFs可促进胆囊癌细胞的增殖、侵袭能力（P<0.05）,差距具有统计学意义。结论通过酶消化法可较为简便地获得人胆囊癌
CAFs,CAFs可显著增强胆囊癌细胞增殖、侵袭能力,表明其在胆囊癌发生、发展中起重要作用。
     

血清饥饿和表皮生长因子上调人肝癌细胞表皮生长因子受体的研究

目的探讨血清饥饿以及EGF对人肝癌细胞EGFR表达的影响。方法用免疫组化方法研究血清饥饿、5ng／mlEGF和25ng／EGF对人肝癌细胞EGFR表达的影响。结果撤血清培养组、5ng／mlEGF和25ng／mlEGF刺激组人肝癌细胞EGFR的表达阳性细胞分别为(5.66±0.86)％、(10.67±1.26)％和(16.83±1.66)％,与正常对照组(1.81±0.75)％相比较差异显著(P<0.01),EGF刺激组比血清饥饿组明显增高(P<0.01)、25ng／mlEGF组比5ng／mlEGF组增高(P<0.01)。结论血清饥饿和EGF能明显增强人肝癌EGFR的表达,且EGF上调EGFR表达的作用具有剂量依赖效应。     

RNA干扰HBx基因对肝癌细胞化疗效果的影响

目的：探讨RNA干扰技术和传统的化疗方法联合应用对肝癌细胞生长抑制作用的影响,并选择高效的治疗组合,研究其凋亡机制。方法：鉴定3组肝癌细胞——MHCC97-H(原肝癌细胞株),HK3细胞（转染空质粒的MHCC97-H细胞）和21543细胞（转染含HBx-shRNA质粒的MHCC97-H细胞）;RT-PCR检测RNA干扰对HBx mRNA沉寂作用,CCK8和TUNEL分别检测RNA干扰HBx后化疗药物对MHCC97-H肿瘤细胞生长的抑制及诱导细胞凋亡情况。结果：RT-PCR结果显示,与MHCC97-H细胞组比较,21543细胞的HBx mRNA水平下降约91%,HK3细胞HBx mRNA水平下降不明显;RNA靶向干扰HBx基因后的肝癌细胞（21543细胞）较原肝癌细胞（MHCC97-H细胞）和HK3细胞增殖明显减慢,而后两种细胞差别无统计学意义;3种不同细胞加用3种不同浓度的氟尿嘧啶(0~120 mg/L)、顺铂(0~32 mg/L)后细胞生长明显减慢并呈浓度依赖性,以RNA靶向干扰HBx基因后的21543细胞生长抑制最明显;相同浓度的氟尿嘧啶对3组不同肝癌细胞均可引起细胞凋亡,以21543细胞凋亡最明显。结论：RNA干扰HBx可明显抑制肝癌细胞的增殖,并增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性;RNA干扰HBx基因和化疗药物联合应用使肝癌细胞凋亡更明显,细胞增殖速度明显减慢。     

奥沙利铂联合吉西他滨对肝癌细胞株HEPG-2生长抑制作用的研究

目的：通过对奥沙利铂（L-OHP）、吉西他滨（GEM）单独及联合作用抑制肝癌细胞株HepG2生长的实验研究,探讨两药合用的效果及最佳剂量。方法：采用一定浓度梯度L-OHP和GEM单独及联合与人肝癌细胞株HepG2孵育后,采用MTT法检测细胞生长变化,并采用两药相互作用系数来评价两药相互作用性质。结果：在各作用时间点,联合组对肝癌细胞HepG2的生长抑制率与相应浓度L-OHP、GEM单药组相比均显著增强。结论：L-OHP与GEM联用可增强互补,减少各自用药剂量,达到减毒增效的目的。     

肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响

目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞(hCAF),阐明其在肝癌发生发展中的作用。方法：采用酶消化法分离、纯化人hCAF, Western blotting法鉴定其相关蛋白标记物的表达,流式细胞术检测肝癌细胞Hep3B经hCAF上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化,建立裸鼠移植瘤模型,观察hCAF对肝癌细胞生长的影响。结果：在肝癌组织标本中成功分离出hCAF,Western blotting结果显示hCAF特异性地高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。CCK8细胞增殖检测试剂盒检测证实,经hCAF上清处理后的Hep3B细胞增殖量为完全培养基处理48 h细胞增殖量的126.0%、125.0%及120.5%,细胞增殖量差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术结果显示,经hCAF上清处理后的Hep3B细胞增殖速度及细胞周期中处于S期的细胞数目均高于完全培养基处理的Hep3B细胞（P<0.05）。hCAF与Hep3B共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（1.34±0.52） cm3］明显大于单独接种Hep3B组［(0.51±0.09)　cm3］,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：hCAF可以明显促进肝癌细胞系Hep3B的生长,其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。     

间充质干细胞介导的TRAIL可控性表达及其杀伤人肝癌细胞的活性研究

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)在间充质干细胞中可控性表达及其对肿瘤细胞的杀伤活性,探索间充质干细胞用于肿瘤治疗的前景.方法 构建TRAIL可控性表达的腺病毒载体Ad-Tet-TRE-TRAIL,包装获得重组腺病毒后,感染小鼠间充质干细胞,免疫印迹法和酶联免疫吸附法测定间充质干细胞TRAIL可控性表达和分泌.四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定TRAIL抑制肝癌细胞生长的能力.膜联蛋白(Annexin)-V/碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术测定TRAIL对肝癌细胞的杀伤活性.结果 重组腺病毒Ad-Tet-TRE-TRAIL感染的小鼠间充质干细胞能够在强力霉素的控制下表达和分泌TRAIL,并显著抑制SMMC-7402人肝癌细胞生长,其机制是诱导肝癌细胞凋亡,结果显示SMMC-7402细胞在杀伤24、48 h后的存活率分别为66.5%±4.8%和42.9%±6.5%,而对照组(未加强力霉素)的细胞存活率分别为97.3%±2.2%和99.4%±4.7%.结论 间充质干细胞介导TRAIL可控性表达进而有效诱导肝癌细胞凋亡并抑制肝癌细胞生长,为肿瘤的细胞治疗提供了新的策略.

Abstract：

Objective To study the controllabe expression of soluble tumor necrosis factor-related apoptosis-iuducing ligand (TRAIL) in mesenchymal stem cells and evaluate its potential tumoricidal effects in cancer therapy. Methods The controllable TRAIL expression vector of Ad-Tet-TRE-TRAIL was established in an adenovirus vector for transfection into murine mesenchymal stem cells. The controllable expression and secretion of TRAIL were detected by Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay.The viability of hepatocellular carcinoma cells was determined by MTT assay. The tumoricidal activity of TRAIL was determined by Annexin-V/PI staining and flow cytometry. Results The murine expression model of TRAIL was successfully established in the presence of doxycycline. The secreted TRAIL in cell culture medium could efficaciously suppress the growth of human hepatocellular carcinoma SMMC-7402 by induced apoptosis. The cell viability of SMMC-7402 was 66. 5% ± 4. 8% and 42.9% ± 6. 5% at post-treatment versus 97.3% ±2. 2% and 99. 4% ±4. 7% in the control group at 24 h and 48 h. Conclusion The controllable TRAIL expression mediated by mesenchymal stem cells kills human hepatocellular carcinoma cells effectively. And it may provide a novel therapeutic strategy for hepatocellular carcinoma.     

不同组织来源的成纤维细胞的生物学特性比较

目的 探讨来自政治家皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞的生物学特性。方法 对三种组织均采用组织块法进行细胞的原代培养,采用胰蛋白酶消化传代,分别利用绘制细胞生长曲线,^H-胸腺嘧啶掺入及^3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖,DNA合成代谢及胶原合成等情况。并比较它们之间的差异。结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞在细胞增殖、DNA合成代谢及胶原合成量等方面均明显高于正常皮肤及增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞。后两者之间有一定区别但无统计学意义。结论 不同组织来源的成纤维细胞其生物学行为亦有所区别,因此,在进行实验研究时应有一定的针对性。