低氧刺激复合培养的平滑肌细胞表达Janus激酶

目的：研究低氧对复合培养的平滑肌细胞中Janus激酶（JAK）基因表达的作用。方法：鼠肺微血管内皮细胞与肺动脉平滑肌细胞复合培养，采用半定量RT－PCR技术检测常氧组、低氧2、6、12h组的JAK1、JAK2和JAK3基因的表达水平，并对PCR产物进行测序。结果：低氧复合培养2h组肺动脉平滑肌细胞中JAK1、JAK2、JAK3 mRNA表达水平升高，在低氧6h组达最高，与正常组比较均有明显差别。低氧12h组的表达量低于6h组，但高于正常组。RT－PCR产物直接测序证实扩增产物片断与Genebank中相应序列相同。结论：低氧增强复合培养的肺动脉平滑肌细胞中JAK基因的表达，而JAK基因在低氧所致的肺动脉收缩和低氧肺动脉高压的信号转导中可能发挥重要作用。     

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞表达信号转导及转录激活因子基因表达的影响

目的：研究低氧对肺动脉平滑肌细胞中信号转导及转录激活因子（STATs）基因表达的影响。方法：低氧处理培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，采用半定量RT－PCR方法检测常氧组、低氧2、6、12h组的STAT3和STAT5基因的表达水平。结果：低氧培养2h组肺动脉平滑肌细胞中STAT3、STAT5 mRNA表达水平升高，在低氧6h组达最高，与正常组比较均有明显差别。低氧12h组的表达量低于6h组，但高于正常组。结论：低氧增强培养的肺动脉平滑肌细胞中STATs基因的表达，在低氧所致的肺肺动脉收缩等疾病中可能发挥重要作用。     

脂多糖对复合培养的微血管内皮细胞Janus激酶表达的影响

目的：研究脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）对复合培养的微血管内皮细胞中Janus激酶（Janus kinase,JAK）基因表达的影响。方法：与肺动脉平滑肌细胞复合培养鼠肺微血管内皮细胞，采用半定量RT－PCR技术检测正常组、LPS2、8、16h组的JAK2和TYK2基因的表达水平。结果：LPS复合培养2h组肺微血管内皮细胞中JAK2 mRNA表达水平升高，在LPS8h组达最高，与正常组比较均有明显差别。在正常组和LPS刺激组均未见肺微血管内皮细胞表达TYK2基因。结论：肺微血管内皮细胞不表达TYK2基因；LPS可使复合培养的肺微血管内皮细胞中JAK2基因的表达升高。     

低氧时复合培养的肺动脉平滑肌细胞Janus激酶蛋白表达的状况

目的：探讨低氧对复合培养的肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中Janus激酶（Janus Kinase,JAK）蛋白表达的作用。方法：采用复合胶原酶法培养大鼠PASMC，再与大鼠肺微血管内皮细胞（LMEC）进行复合培养，免疫细胞化学SABC法检测低氧状况下PASMC中JAK蛋白的表达情况。结果：与正常PASMC弱阳性（＋）比较，低氧处理单独培养PASMC的JAK1、JAK3免疫组化染色，胞浆呈深紫蓝色，呈极强阳性（＋＋＋＋）；低氧处理复合培养的PASMC的JAK1、JAK3免疫组化染色，胞浆呈强阳性（＋＋＋）。与对照的正常细胞呈弱阳性（＋）比较，低氧2h组JAK1和JAK3蛋白表达明显升高；低氧6h组复合培养PASMC的JAK1和JAK3表达显著升高至高峰；12h组比低氧6h组已有降低，仍高于2h组的表达水平。结论：低氧在复合条件下可进一步激活PASMC中JAK蛋白的表达，从而高调多种信号通路，促进细胞增殖。     

复合培养对低氧时肺动脉平滑肌细胞表达细胞因子的调节

目的 研究低氧对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)白细胞介素-1β、4、10、13(IL-1β、4、10、13)活性的影响,及复合培养下肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)对其调控作用.方法 大鼠PASMCs单独培养或与PMVECs复合培养,分为正常组、低氧作用2 h(H2)、6h(H6)、12 h(H12)、24 h(H24)组,采用ELISA法测定各组培养细胞上清中IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13的活性.结果 低氧刺激后PASMCs的IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13活性2 h开始升高,6 h达高峰,12 h降低;各时相点复合培养组均低于对应的单独培养组(P＜0.01).结论 低氧可以激活PASMCs的IL-113、IL-4、IL-10、IL-13活性,在复合培养条件下,PMVECs对此效应具有下调性影响.     

慢性低氧大鼠肺动脉内皮素mRNA的表达及定位

目的：探讨慢性低氧大鼠肺动脉内皮素－1基因表达及分布。方法：采用生物素标记cRNA探针，对Wistar大鼠肺动脉进行原位杂交。结果：低氧1周组及低氧2周组大鼠大部分肺动脉内皮细胞ET－1mRNA表达呈阳性信号，而对照组大鼠仅极少数阳性信号（P＜0．01）；低氧1周组大鼠部分显示强阳性信号。低氧1周组及低氧2周组大鼠部分肺动脉平滑肌细胞呈现ET-1mRNA表达阳性信号，而对照组大鼠则无阳性信号表达（P＜0．01及0．05）。结论：慢性低氧对大鼠肺动脉ET－1分泌的影响是在基因转录水平进行，且主要细胞定位在肺动脉内皮细胞，此外还包括肺动脉平滑肌细胞。     

腺病毒介导的p53消减基因对慢性低氧性肺动脉高压大鼠的影响

目的 探讨p53消减基因对低氧性肺动脉高压（pulmonary artery hypertension,PAH）大鼠肺动脉压力及平滑肌细胞凋亡的影响。 方法 SD大鼠60只随机分为常氧对照组、常氧实验Adeno-null组、常氧实验Adeno-p53组、低氧对照组、低氧实验Adeno-null组和低氧实验Adeno-p53组各10只。低氧组大鼠置于含有10% O2浓度的低氧舱中。培养2周后气管滴入3×108 MOI腺病毒,继续培养2周。利用右心导管测压法测定各组大鼠平均颈总动脉压、平均肺动脉压;称重右心室、室间隔+左心室的重量,计算右心室肥厚指数,TUNEL染色法检测左肺肺动脉平滑肌细胞的凋亡指数,评价p53消减基因转染对大鼠肺动脉压力及平滑肌细胞凋亡的影响。 结果 常压下持续通入10.0% O2培养4周的大鼠与正常情况下培养的大鼠相比,平均肺动脉压力显著升高,右心室明显肥厚（P＜0.01或P＜0.05）。低氧培养条件下,与低氧实验Adeno-null组相比,低氧实验Adeno-P53组肺动脉压和右心室肥厚指数降低(P＜0.05)。低氧实验Adeno-P53组的肺动脉平滑肌细胞的凋亡指数显著高于低氧实验Adeno-null组常氧实验Adeno-p53组大鼠肺动脉平滑肌细胞的凋亡指数高于常氧实验Adeno-null组(P＜0.05)。 结论 p53消减基因能在一定程度上缓解低氧性PAH的发展,其机制可能与p53消减基因诱导肺动脉平滑肌细胞的增加有关。     

IL-2基因转导CD3AK细胞免疫学功能的研究

目的 :观察白细胞介素 2 (IL 2 )基因转导后CD3AK细胞免疫学功能的变化。方法 :应用逆转录病毒载体将IL 2基因转导入CD3AK细胞。检测转导细胞中特异性NeoR 基因、培养上清IL 2的表达水平及转导CD3AK细胞的体外增殖活性、细胞毒活性和细胞表型。结果 :从转导细胞mRNA中扩增出长度为 347bp的特异性NeoR 基因片段 ,转导细胞培养上清的IL 2表达水平显著增高 ,体外增殖活性和细胞毒活性均强于未转导组细胞 ,CD4 /CD8 值升高。结论 :PLIL 2SN逆转录病毒转导CD3AK细胞后 ,IL 2基因得到表达并增强CD3AK细胞的免疫学功能     

慢性低氧对大鼠主动脉与肺动脉平滑肌细胞增殖影响的差异性

目的:探讨在整体和细胞水平下慢性低氧对大鼠主动脉及肺动脉平滑肌细胞增殖性是否有影响及其差异性。方法:分别采用整体慢性低氧模型复制及细胞培养的方法获得实验对象,整体动物上分为正常对照组和低氧3周组;细胞水平分为正常对照组及低氧24h组。分别采取HE染色,免疫组化法和图像分析的方法检测主动脉、肺内小动脉及培养的平滑肌细胞中PCNA的表达和含量的变化。MTT测细胞增殖情况。结果:正常组整体及细胞水平下PCNA在主动脉、肺内小动脉平滑肌细胞内均有微弱表达,整体实验低氧时只有肺内小动脉平滑肌细胞内其表达有增强,主动脉平滑肌细胞内PCNA的表达无明显差别。细胞低氧24h组PCNA表达明显增强,主、肺动脉平滑肌细胞之间无明显差别。结论:大鼠的主、肺动脉平滑肌细胞对慢性低氧的反应在整体水平和细胞水平是有差异的。     

IL—2基因转导CD3AK细胞免疫学功能的研究

目的：观察白细胞介素-2（IL-2）基因转导后CD3AK细胞免疫学功能的变化。方法：应用逆转录病毒载体将IL-2基因转导入CD3AK细胞，检测转导细胞中特异性Neo^R基因、培养上清IL-2的表达水平及转导CD3AK细胞的体外地产殖活性、细胞毒活性和细胞表型。结果：从转导细胞mRNA中扩增出长度为347bp的特异性Neo^R基因片段，转导细胞培养上清的IL-2表达水平显著增高，体外增殖活性和细胞毒活性均强于未转导组细胞，CD4^ /CD8^ 值升高。结论：PLIL-2SN逆转录病毒转导CD3AK细胞后，IL-2基因得到表达并增强CD3AK细胞的免疫学功能。     

低氧促进肌成纤维细胞表达和分泌结缔组织生长因子及纤维连接蛋白

目的:观察低氧对肾肌成纤维细胞合成和分泌结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和细胞外基质纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的影响,以了解肌成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用.方法:(1)采用原代培养正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞,以密闭的细胞培养罐造成低氧环境(1%O2 ,体积分数),应用Western blot方法检测低氧和正常氧(21%O2 ,体积分数)条件下低氧诱导因子-1α( hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)蛋白的表达,验证所营造的低氧条件是可靠的.(2)用Western blot方法检测在低氧和正常氧条件下,各时间点上细胞及上清液中CTGF和FN蛋白水平.(3) 用RT-PCR方法检测低氧和正常氧条件下,各时间点FN mRNA表达的变化.(4)用明胶酶谱法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotei- nase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP -9)的活性.结果:正常氧组HIF-1α蛋白表达微弱,低氧组有较高水平HIF-1α蛋白表达.低氧作用于原代培养的肌成纤维细胞6 h,12 h和24 h后细胞内的CTGF蛋白均比正常氧组增高,分别为175%±52%,347%±67%和143%±27%,以12 h最明显(P＜0.05);低氧刺激24 h时上清液中CTGF蛋白显著增加,是正常氧组的348%±99%(P＜0.05);低氧刺激肌成纤维细胞6 h,12 h和24 h后上清液中FN蛋白水平增加,分别是正常氧组的187%±42%,199%±51%和210%±29%,以24 h 最明显(P＜0.05),而对应时间点上清液中MMP-9和MMP-2活性无明显变化,但细胞内FN蛋白减少,低氧剌激6 h为正常氧组的64%±13%.低氧刺激肌成纤维细胞3 h,FN的mRNA水平开始上升,6 h达到正常氧组的135%±13%(P＜0.05),12 h 下降接近正常氧水平.结论 :低氧可通过促进肌成纤维细胞表达CTGF和FN参与肾间质纤维化的进展.     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对胰腺癌细胞基质金属蛋白酶的影响

目的研究低氧状态下乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynu—cleotide,AS—ODN）对胰腺癌高转移细胞株MIAPaCa-2细胞基质金属蛋白酶．2（matrixmetalloproteinase．2,MMP-2）和MMP-9的影响。方法以HpaAS—ODN预先阻断MIAPaCa-2细胞Hpa表达并低氧培养,观察MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表达的变化,明胶酶法检测MMP-2和MMP-9活性的变化,观察阻断Hpa对MMP-2和MMP-9表达及活性的影响。结果低氧培养条件下,MIAPaCa-2细胞MMP-2mRNA及蛋白表达略有上调,但是与常氧条件下培养对比,在6、12和24h差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。以ASODN阻断Hpa后,MMP-2mRNA及蛋白表达均无明显变化。低氧后6hMMP-9mRNA及蛋白表达开始升高,12h（P〈0．05）和24h（P〈0．01）更加明显。阻断Hpa表达后,MMP-9mRNA及蛋白表达在各时间段均有下降,而在24h下降明显,差异具有统计学意义（P〈0．01）。低氧后12h和24h,活化型的MMP-2和MMP-9均显著增强,当Hpa表达被抑制后,于12h（P〈0．01）和24h（P〈0．01）活化型的MMP-9活性受到明显抑制,而各时间内,活化型的MMP-2活性均不受HpaAS—ODN的影响（P〉0．05）。结论低氧可刺激MIAPaCa-2细胞MMP-9mRNA及蛋白的表达,增强酶活性。预先阻断Hpa表达在12h和24h可抑制MMP-9mRNA和蛋白的表达,降低MMP-9的活性,而对MMP-2则无明显影响。     

缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞Akt mRNA表达的变化

目的通过观察缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC）3种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（Akt1、Akt2、AkG）mRNA的表达水平变化,初步探讨Akt信号途径在缺氧肺动脉高压（hypoxia pulmonary hypertension,HPH）血管重建中的作用。方法组织贴片法建立纯PASMC细胞系。采用半定量RT-PCR技术检测常氧组（N组）、低氧2、8、12、24组的Akt1、Akt2和AkG基因mRNA的表达水平。结果建立了纯PASMC细胞系。各组均检测出Akt1、Akt2和AkG基因的mRNA,图像定量分析光值显示各组表达的mRNA含量与缺氧时限存在一定的关系。结论Akt信号通路可能是大鼠缺氧肺动脉高压中PASMC增殖和分化的重要传导途径,其中Akt1可能起主要作用。     

缺氧诱导大鼠肝星状细胞激活及表达内脂素的实验研究

目的 通过观察常氧及缺氧状态下大鼠肝星状细胞(HSCs)表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和内脂素水平的变化,探讨缺氧对HSCs激活及表达内脂素的影响。方法 对原代大鼠HSCs进行缺氧(37 ℃、5% CO2+1% O2 + 94% N2)处理,检测不同缺氧时间(3、6、12及24 h)和常氧条件（5%CO2+21%O2+74%N2）下HSCs中HIF-1α、α-SMA和内脂素的mRNA表达水平及蛋白表达水平。基因表达用RT-PCR检测,蛋白表达用蛋白质印迹法(Western blot) 检测。结果 缺氧3 h即能诱导大鼠HSCs表达HIF-1α mRNA(P<0.05);HSCs缺氧6 h后α-SMA mRNA及蛋白表达水平的表达上调(P<0.05);HSCs缺氧12 h上调内脂素mRNA的表达(P<0.05),6 h上调内脂素蛋白表达(P<0.05);缺氧诱导α-SMA和内脂素表达呈正相关(基因r=0.991,蛋白r=0.968,P<0.05)。结论 缺氧可上调HSCs表达α-SMA和内脂素,且二者具有相关性,提示缺氧微环境可能通过内脂素介导HSCs的激活,促进肝纤维化的发生。     

miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

【目的】观察miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用并探讨其可能的机制。【方法】原代分离和培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,并给予3%低氧处理后,用Real-time PCR法检测miR-34a和Notch1mRNA在大鼠PASMC中的表达;低氧条件下用细胞转染法过表达和抑制miR-34a、沉默Notch1基因的表达后用EDU法观察细胞增殖情况,并用Real-time PCR和Western blot法检测细胞核增殖抗原PCNA的表达。【结果】分离和培养大鼠PASMC并给予3%低氧处理后,大鼠PASMC中miR-34a表达明显降低,且低氧48h降低较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。而Notch1的表达明显增高,且48h增高较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。此外,过表达miR-34a和沉默Notch1后会显著抑制低氧引起的细胞增殖,抑制miR-34a的表达后则会促进细胞增殖,且组间差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】在低氧诱导的PASMC细胞增殖过程中miR-34a参与了PASMC的增殖过程,且可能是通过上调Notch1引起了细胞增殖。     

缺氧对肺成纤维细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的观察不同缺氧时间对肺成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法原代培养的人肺成纤维细胞在缺氧(37℃、5%CO2、5%O2、90%N2)条件下分别孵育0、1.5、3、6及12 h,同时用抗CTGF抗体干预的人肺成纤维细胞在缺氧条件下培养12 h。RT-PCR法测定细胞CTGF mRNA、基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA表达情况,ELISA法测定细胞培养上清液CTGF、MMP9的浓度。结果缺氧刺激肺成纤维细胞CTGF mRNA高表达出现在1.5 h,并保持一相对平台至6 h,12 h开始下降。MMP9 mRNA在缺氧1.5 h出现高表达,并保持持续增高的趋势。ELISA结果证实CTGF与MMP9一样其峰浓度在缺氧12 h,用抗CTGF抗体干预的成纤维细胞组较未干预组表达MMP9量明显减少。结论缺氧可刺激人肺成纤维细胞高表达CTGF;缺氧可能是通过刺激成纤维细胞高表达CTGF,进而调节细胞分泌MMP9的量,参予细胞外基质沉积和气道重构。