白念珠菌MAb03.2C1-C2特异性验证及临床研究

目的进一步验证抗白念珠菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2(MAb)的特异性及在临床中的应用价值,为今后的实验研究和应用性研究打下基础。方法用白念珠菌标准株,重庆、九江两地不同地域中临床分离的白念珠菌、非白念念珠菌、常见的酵母菌和实验室保存的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌做抗原包被,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,ⅡF)方法,对单抗MAb03.2C1-C2特异性进行分析。取临床口腔及阴道念珠菌病患者真菌涂片菌丝阳性的标本,MAb03.2C1-C2作为I抗,用ⅡF方法检测。结果200例被检临床病例中,84例口腔念珠菌病和51例阴道念珠菌病真菌涂片ⅡF试验阳性的标本中,最终鉴定均为白念珠菌。38例口腔念珠菌病和27例阴道念珠菌病中标本最终鉴定为非白念念珠菌或新型隐球菌。MAb03.2C1-C2仅与白念珠菌芽管或菌丝特异性地结合,与白念珠菌的孢子及其他念珠菌种的假菌丝和孢子均不发生结合,也不与金黄色葡萄球菌发生反应。61例标本8种临床分离的非白念念珠菌的孢子和菌丝不能特异性地与单抗结合;分离的4例新型隐球菌及金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌均不能与该单抗相结合。结论进一步证实了MAb03.2C1-C2对白念珠菌芽管高度专一的特异性,并可用于口腔念珠菌病及阴道念珠菌病真菌涂片中白念珠菌的检测。     

抗白念珠菌芽管单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其对血清芽管诱导率的影响

目的制备并鉴定抗白念珠菌芽管单克隆抗体杂交瘤细胞株,观察该单抗对白念珠菌菌相转换的影响。方法白念珠菌ATCC-90028标准株带芽管孢子做抗原,运用细胞融合技术,制备抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,并鉴定。将该单抗参与白念珠菌芽管血清诱导,对比其芽管诱导率与血清芽管诱导率。结果建立1株持续分泌抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株M cAb03.2C1-C2。其小鼠腹水单克隆抗体效价达1∶25 600;抗体重链属IgG1亚类,轻链属λ型;证实M cAb03.2C1-C2的靶位是位于白念珠菌芽管胞壁外膜上分子量为156kD的抗原成分。间接免疫荧光(IIF)可见单抗能与白念珠菌芽管特异性地结合,与白念珠菌的孢子相不发生反应。单抗能明显降低芽管诱导诱导率。结论本研究建立的M cAb03.2C1-C2对白念珠菌致病相-芽管有高度的特异性,为早期、快速地诊断系统性白念珠菌感染提供了新的前景。M cAb03.2C1-C2对菌相转换有明显的抑制作用,可能在抗白念珠菌系统性感染中起保护性作用。     

白念珠菌芽管特异性抗原快速检测方法的建立和初步评价北大核心CSCD

目的建立白念珠菌芽管特异性抗原快速检测系统,探讨其特异性和敏感性。方法以单克隆抗体McAb03．2C1-C2作为一抗,辣根过氧化物酶标记McAb03．2C1-C2为二抗,建立双抗体夹心ELISA实验方法并检测6只动物模型和5例系统性白念珠菌感染患者的血清标本。结果筛选出McAb03．2C1-C2最佳稀释度和检测包被抗原浓度分别为l：4000和1．25-40μg,／ml;双抗体夹心ELISA检测动物模型的特异性和敏感性分别为95％、92％,其对阳性临床标本的检测结果与常规鉴定方法一致。结论初步建立白念珠菌芽管特异性抗原的双抗体ELISA快速检测系统,动物模型实验证实该系统有较好的特异性和敏感性。     

白念珠菌芽管特异性抗原的研究

运用ⅡＦ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫印迹技术，证实８株临床分离的白念珠菌芽管表面存在芽管特异性抗原。白念珠菌菌丝相胞壁提取物中含有比孢子相更多的、不同的蛋白成份；发现白念珠菌菌丝相胞壁提取物中有一分子量大约为３９ ０００蛋白抗原成份很可能是白念珠菌芽管特异性抗原；认为白念珠菌孢子相和其它念珠菌孢子相胞壁中有以隐蔽状态存在的芽管抗原成份。     

白念珠菌孢子相、菌丝相胞壁提取物SDS-PAGE分析

白念珠菌是一种重要的双相性条件致病性真菌。在念珠菌感染的组织中，目前认为，相变是白念珠菌的毒力因子之一。Ashman等认为，白念珠菌孢子相向菌丝相转变，表达于细胞表面的抗原有质和量的变化。我们采用梯度十二烷基磺酸钠—聚丙烯凝胶电泳(SDS—PAGE)技术，对临床分离的6株白念珠菌孢子相和菌丝相(带芽管的孢     

伊曲康唑治疗婴儿泛发性皮肤念珠菌病1例

采用伊曲康唑治疗1例婴儿泛发性皮肤念珠菌病。患儿男,4月大,3个月时无明显诱因臀部出现红斑、丘疹、渗出、糜烂,渐波及颈部、面部,口腔内有一灰白色膜。真菌镜检口腔内芽生孢子及假菌丝阳性,颈、臀部分泌物真菌培养白念珠菌生长。予伊曲康唑20mg[5mg/(kg·d)]口服15天,皮损好转。3个月后随访,皮肤恢复正常,未见复发。查肝功能未见异常。     

慢性皮肤黏膜念珠菌病1例

患者男,3岁。头面部、手背、手指间皮疹伴口腔白膜2年。取病变部位鳞屑直接镜检可见菌丝和孢子,多个部位真菌培养均有奶油样菌落生长,镜下见成簇卵圆形孢子和假菌丝。组织病理见表皮内有菌丝和孢子,真皮组织内见大量淋巴细胞、组织细胞浸润。根据形态学,生化实验等诊断为白念珠菌感染引起的慢性皮肤黏膜念珠菌病。经口服伊曲康唑和外用抗真菌药治疗,皮损基本控制。     

白念珠菌二相性与毒力关系的实验研究

目的　探讨白念珠菌二相性与毒力的关系。方法　分别将孢子相、菌丝相白念珠菌与人口腔颊黏膜细胞 (BEC)进行黏附试验 ,比较二相性白念珠菌对BEC的黏附率 ;分别用牛血清白蛋白培养基及卵黄培养基测定二相性白念珠菌的分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力 ;分别将二相性白念珠菌进行小鼠毒力实验。结果　菌丝相白念珠菌对BEC的黏附率显著高于孢子相 (P <0 .0 0 1) ;菌丝相白念珠菌分泌性酸性蛋白酶与细胞外磷脂酶的活力均显著高于孢子相 (P分别 <0 .0 0 1和 <0 .0 0 2 ) ;注射菌丝相白念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢子相的小鼠 (P <0 .0 2 5 ) ,且平均存活期低于注射孢子相的小鼠 (P <0 .0 0 1)。结论　菌丝相白念珠菌的毒力强于孢子相。     

白念珠菌保护性单抗的研究

目的 探讨抗白念珠菌单克隆抗体在系统性念珠菌感染动物中的保护作用。方法 制备抗白念珠菌单抗,观察单抗对系统性念珠菌感染小鼠存活时间,组织病理改变以及组织中菌落形成单位的影响。结果 制备出3株抗白念珠菌胞壁外膜抗原单克隆抗体-1B5、3E8、4C7;1B5、3E8两株单抗能显著延长致死量白念珠菌感染小鼠存活时间,减少感染小鼠主要脏器组织中白念珠菌菌落形成单位,减轻组织病理改变;1B5单抗能识别白念珠菌胞壁外膜上相对分子质量约为32000抗原;并在体外能抑制白念珠菌孢子对人颊粘膜上皮细胞,胎儿脐静脉内皮细胞的粘附。结论 1B5、3E8是具有保护作用的抗白念珠孢子对人颊粘膜上皮细胞,胎儿脐静脉内皮细胞的粘附。结论 1B5、3E8是具有保护作用的抗白念珠菌单抗;其中1B5是抗白念珠菌胞壁外膜上相对分子质量为32000的抗原的单抗;1B5单抗可通过抑制白念珠菌对上皮细胞,内皮细胞的粘附,降低该菌的侵袭力。     

外阴阴道念珠菌病的致病菌群分析

目的 探讨青岛及周边地区外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种特征。 方法 采用常规念珠菌培养方法鉴定菌种,包括沙氏培养基,血清芽管实验,CHROMagar念珠菌显色培养基及API 20C AUX酵母菌鉴定系统。结果 2011年5 ~ 11月共收集362例妇科门诊患者的阴道分泌物,病原学分析显示,念珠菌阳性例数为313例,总感染率为86.46%,菌种构成分布为白念珠菌275株,光滑念珠菌13株,近平滑念珠菌8株,热带念珠菌7株,克柔念珠菌5株,葡萄牙念珠菌1株,都柏林念珠菌1株,粘质红酵母菌1株,奥默毕赤酵母菌1株,粘性丝孢酵母菌1株。结论 白念珠菌仍是外阴阴道念珠菌病的常见致病菌,非白念以光滑念珠菌为主。     

单克隆天然抗体3B4抑制白念珠菌芽管形成的机制初探

目的观察单克隆天然抗体3B4对白念珠菌芽管形成的影响,并进一步分析其结合于白念珠菌的部位及成分,探讨其发挥作用的机理。方法将纯化的单克隆抗体3B4与白念珠菌共孵育,计数形成芽管的数量。采用间接免疫荧光方法和流式细胞仪分析抗体3B4与白念珠菌结合的部位;将白念珠菌用蛋白酶K、氢氧化钠等分别处理后,观察3B4对其的结合情况,初步确定其结合成分。结果相对于同型对照,抗体3B4作用组白念珠菌芽管生成率显著下降并有统计学差异。流式细胞仪和间接免疫荧光检测均发现3B4可以与白念珠菌的芽管相结合,而与酵母相的结合很弱;蛋白酶K、氢氧化钠等处理后,3B4对芽管相和酵母相白念珠菌均不发生结合,提示抗体3B4结合的成分是主要表达于菌丝相的一种糖蛋白。结论单克隆天然抗体3B4可能通过与主要表达在芽管上的一种糖蛋白结合而抑制其芽管形成。     

阴道念珠菌随机扩增多态性DNA分型研究

目的 对分离自外阴阴道念珠菌病患者阴道的念珠菌进行基因分型,并对不同菌株间的亲缘关系作相似性分析。方法 用形态学及生化方法对分离到的致病性念珠菌进行鉴定,然后采用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对45株临床分离株基因组DNA进行扩增,并将DNA扩增带型进行聚类分析。结果 30株白念株菌可以分成7群共19个亚群,15株非白念珠菌(包括光滑念珠菌6株,克鲁斯念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌各3株)至少可鉴定到种水平。白念珠菌种内不同菌株间的相似性系数在90%以上,不同念珠菌种间的相似性系数介于80%~90%。结论 外阴阴道念珠菌病的主要致病菌是白念珠菌,用RAPD技术可将之分成不同的基因组型别。     

单克隆天然抗角蛋白抗体384抑制白念珠菌芽管生成的研究

目的观察单克隆天然抗角蛋白抗体384与自念珠菌结合及对芽管生成的影响。方法采用ELISA和流式细胞仪检测单克隆天然抗角蛋白抗体384与白念珠菌结合，并将抗体与真菌共孵育，检测白念珠菌芽管生成的变化。结果ELISA和流式细胞仪检测均发现384可以与白念珠菌结合；相对于同型对照组，384作用组真菌芽管生成率显著下降，两组差异有统计学意义。结论单克隆天然抗角蛋白抗体384可以与白念珠菌结合并抑制其芽管生成，提示天然IgM在机体抗真菌天然免疫中可能具有一定的作用。     

阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的对分离自外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道的常见致病性非白念珠菌进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法的鉴定。方法首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、法国科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统将分离自VVC患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种,然后采用真菌通用引物将4种常见非白念珠菌(包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌)进行PCR扩增,并选用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果在4种非白念珠菌中光滑念珠菌15株(7.50%),近平滑念珠菌7株(3.50%),克柔念珠菌5株(2.50%),热带念珠菌2株(1.00%);PCR扩增后均产生稳定、清晰的条带,扩增产物经MspⅠ,HaeⅢ酶切后分别产生4种和2种特异性带型。结论外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌为主;PCR-RFLP方法在鉴定常见致病性非白念珠菌中比较可靠、稳定、特异,但仍有方法繁琐等不足之处。     

用单克隆抗体检测白念珠菌表面抗原

关于用单克隆抗体研究白念珠菌表面抗原表达的研究很少,尚未见用单克隆抗体作系统性念珠菌病诊断的报告.新近我们以完整白念珠菌孢子免疫小鼠,获得一株针对白念珠菌表面抗原(可能是甘露聚糖)的单克隆抗体E₈H₁₀.它除与白念珠菌有反应外,尚与热带念珠菌、高里氏念珠菌有反应;仅对20株临床分离的白念珠菌中的s株起反应.用E₈H₁₀通过免疫荧光法直接检查标木中的念珠菌,较常规培养法速度快,检出率高.     

外阴阴道念珠菌病复发前后分离菌株基因型分析

目的 比较从外阴阴道念珠菌病患者复发前后分离菌株的RAPD指纹图谱的异同。方法 通过流行病学调查表来收集病例和采集样本。所有临床分离菌株均经芽管形成试验、念珠菌显色培养基（CHROMagar Candida） 和API20C系统鉴定，然后用RAPD技术对2株白念株菌标准菌株和来自24例患者连续2次及1例患者连续3次分离出的临床菌株共51株菌株进行基因分型。结果 引物4的RAPD扩增结果表明，66.7%的患者再次发作前后菌株的扩增带型一致。引物7的RAPD扩增结果为，58.3%的患者复诊前后菌株的扩增带型一致。25例患者中有4例患者前后2次分离的菌种从白念珠菌替换成光滑念珠菌。结论 从外阴阴道念珠菌病患者分离的菌株半数以上在再次发作前后无明显基因型上的差别，仅有部分菌株会在复发前后基因型发生改变。