感染约氏疟原虫的斯氏按蚊组织化学观察

目的观察蚊媒感染疟原虫后的组织化学变化.方法应用组织化学技术观察对照组和感染约氏疟原虫的斯氏按蚊体内乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、三磷酸腺苷酶(Mg2+-ATPase)活性反应与含量以及糖原含量的变化.结果与对照组相比,感染约氏疟原虫后,蚊体内LDH活性与含量显著增加,SDH和Mg2+-ATPase活性与含量及糖原含量显著降低.结论感染约氏疟原虫可明显影响蚊媒的营养代谢和吸收.     

约氏疟原虫感染大鼠和小鼠的红外期研究

约氏疟原虫约氏亚种的子抱子经尾静脉接种大鼠和三株小鼠(ICR/JCL,C57BL,KM株)后42h,在大鼠和小鼠的肝连续切片中均查见红外期裂殖体(EE裂殖体),但在KM鼠株的切片中,正常的EE裂殖体甚少。不论宿主同否,EE裂殖体均大小不等,呈圆形、椭圆形或其他形状,分化程度不同,发育不完全同步。大鼠肝中的EE裂殖体可看到明显的外膜,周围并出现细胞反应。ICR/JCL、C57BL鼠株和大鼠肝中的EE裂殖体均较KM鼠株发育良好,数量较多,但大鼠中的红内期迅速消失。结果表明;ICR/JCL和C57BL鼠株用作约氏疟原虫—斯氏按蚊系统鼠疟模型的宿主较合适。     

影响约氏疟原虫红细胞外期发育因素的研究

采用正交试验设计,观察环境温度、光照周期、脾脏切除和雌激素水平对大鼠体内约氏疟原虫红细胞外期生长发育的影响。结果显示:脾脏在清除子孢子方面有重要作用,切脾组的红外期原虫密度显著高于对照组;雌激素水平的升高则明显抑制红外期的发育。低温环境对红外期的密度虽无明显影响,但使之发育变缓,不同步更为显著。光照周期的长短似乎对红外期的生长发育无明显影响。两种因素交互作用时,脾脏切除和雌激素水平升高的影响相互抵消,其他两两因素的作用,经方差分析,均未见显著性差异。     

大劣按蚊和斯氏按蚊对约氏疟原虫不同易感性的遗传多态性研究

目的 比较分析对约氏疟原虫易感的斯氏按蚊和不易感的大劣按蚊的基因组DNA的多态性，探讨媒介按蚊与疟原虫遗传基因间的相互关系。方法 设计5条随机引物，应用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术对斯氏按蚊、大劣按蚊成蚊（未感染蚊和感染蚊）及其幼虫的基因组DNA进行随机扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后分析。结果 5条随机引物对2种按蚊扩增的条带数不同，其中P5对斯氏按蚊扩增的效果较好，共16～17条带型，长度为200～1800bp；P4对大劣按蚊扩增效果较好，出现17条带型，长度为180～1500bp；P1对大劣按蚊无扩增产物。用P3对2种按蚊扩增，感染前后的扩增产物电泳条带数相同，但亮度不同；成蚊与幼虫带型数量不同，斯氏按蚊成虫与幼虫有3条相同带型（400、650、850bp），大劣按蚊成虫与幼虫有4条相同带型（350、500、750、800bp）；大劣和斯氏按蚊成蚊带型分别为10和13条，其中相同带型6条（300、350、400、550、600、800bp）。结论 斯氏按蚊和大劣按蚊之间存在基因差异。同种未感染蚊和感染蚊基因带型仅存在亮度差异，而幼虫与成虫的基因差异较大。     

抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的作用

目的 观察抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的抑制作用。 方法 解剖实验室饲养斯氏按蚊雌蚊，取中肠（胃）制备中肠蛋白抗原并免疫BALB/c小鼠（8只， 100 μg/只)， 共免疫4次， 每次间隔7～10 d，末次免疫后10 d，腋窝动脉取血，分离血清。用蛋白质印迹（Western blotting）分析中肠蛋白的免疫活性抗原。用葡聚糖凝胶过滤法获得相对分子质量（Mr）为38 000~50 000的蛋白。用该中肠蛋白免疫小鼠（12只， 100 μg/只)， 共免疫4次，每次间隔7~10 d。同时设PBS对照组。末次免疫后7 d，ELISA检测小鼠血清中的抗体，抗体效价≥1 : 2 560时，该免疫组小鼠和对照组小鼠经腹腔接种感染约氏疟原虫（约含2×10⁷个感染疟原虫的红细胞），感染后3 d取小鼠尾血镜检，雌配子体数＞2/10个视野的小鼠作为供血鼠，斯氏按蚊成蚊吸血后9 d解剖，计数中肠的卵囊数量。 结果 Western blotting显示斯氏按蚊中肠蛋白抗原的显色区带有8条，其中Mr 38 000~50 000的区带显色较清晰；实验组和对照组中肠卵囊感染率分别为28.70%（62/216）和51.09%（47/92）（P＜0.05），中肠卵囊指数分别为14.14（1 541/109）和26.02（1 223/47），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论 斯氏按蚊Mr 38 000~50 000中肠蛋白有免疫活性；针对该中肠蛋白的抗体对约氏疟原虫卵囊的发育有明显的抑制作用。     

大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白的筛选和鉴定

目的 筛选并鉴定大劣按蚊感染约氏疟原虫后血淋巴的相关蛋白．为进一步的功能研究和蚊先天性免疫研究奠定基础。方法 以大劣按蚊一约氏疟原虫为实验模型，利用二维电泳技术分离和比较饱吸约氏疟原虫感染的鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊血淋巴蛋白，获得差异蛋白．并对差异蛋白进行N端氨基酸测序和生物信息学分析,从而推测差异蛋白的功能。结果 获得清晰二维电泳图，并筛选获得37个差异蛋白点。对其中比较明显的差异蛋白1进行氨基酸测序后发现，该蛋白可能为一翻译延伸因子。结论 成功分离和筛选获得了大劣按蚊感染约氏疟原虫血淋巴相关蛋白。并进行了初步鉴定。     

斯氏按蚊血细胞对约氏疟原虫卵囊黑化的影响

目的　探讨斯氏按蚊血细胞及血细胞PPO对疟原虫卵囊黑化的影响。方法　利用电镜观察蚊血细胞在卵囊黑化中的作用、RT -PCR检测蚊血细胞、蚊胃中PPOmRNA的表达、原位杂交检测血细胞中PPOmRNA的表达。结果　通过RT -PCR和原位杂交 ,发现斯氏按蚊PPOmRNA在血细胞中有表达 ,颗粒细胞可能是其主要的表达细胞 ;硝喹可使约氏疟原虫卵囊发生退行性变 ,卵囊黑化比率明显增加。结论　说明血细胞能够合成PPO ,进一步证实了蚊血细胞 ,特别是硝喹对卵囊的发育有抑制和阻断作用时 ,颗粒细胞在疟原虫卵囊黑化中起重要作用。     

约氏疟原虫与伯氏疟原虫侵入期抗原的初步研究

目的　用针对鼠约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)侵入期的8种单克隆抗体,对约氏疟原虫和伯氏疟原虫(P.berghei)侵入期即动合子、裂殖子和子孢子棒状体和表面抗原检测分析。　方法　间接免疫荧光实验(IFA)对各侵入期抗原进行亚细胞结构定位,SDSPAGE及Western印迹对两种鼠疟原虫的不同侵入期进行抗原组分分析。　结果　经上述两种方法检测发现,顶端复合体抗原成分复杂,约氏疟原虫和伯氏疟原虫的棒状体有共同的抗原表位,约氏疟原虫的动合子与其自身的裂殖子有类似成分,也有各自独特的抗原。两种鼠疟原虫动合子抗原有类似成分。约氏疟原虫的子孢子具有与裂殖子、动合子不同的抗原成分。　结论　疟原虫侵入期棒状体和表面抗原在同一虫种的不同侵入期和不同虫种中有共同的抗原表位,也有各自的独特组分。     

胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸抑制疟原虫红前期发育

目的 观察胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸（cytidine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotide,CpG ODN）对疟原虫红前期发育的影响。 方法 通过构建约氏疟原虫BY265株18S rRNA外标准品质粒,与小鼠三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）内标准品共同组成TaqMan RT-PCR分析模型。用不同剂量（0.05×10⁵ 、0.1×10⁵、0.5×10⁵、1×10⁵和2×10⁵个）约氏疟原虫唾液腺子孢子感染BALB/c小鼠,42 h后处死小鼠取其肝脏,制备约氏疟原虫cDNA进行TaqMan RT-PCR反应,以小鼠肝脏虫荷指标检验模型的有效性。将12只BALB/c小鼠随机均分为CpG组、CpG对照组和PBS对照组,CpG组和CpG对照组小鼠分别尾静脉注射脱氧寡核苷酸1826（ODN1826）及其对照（ODN1826 control）各30 μg,PBS对照组注射0.01 mol/L PBS溶液 200 μl。24 h后各组每鼠感染100个子孢子,于感染后42 h处死小鼠取肝脏,制备约氏疟原虫cDNA进行TaqMan RT-PCR,定量分析感染疟原虫24 h前CpG ODN预处理小鼠肝脏虫荷的变化。 结果 构建的约氏疟原虫外标准品质粒所插入的BY265株18S rRNA基因与17XNL株18S rRNA基因相似性为98%,它与小鼠GAPDH内标准品共同组成的TaqMan RT-PCR分析模型能够正确反映小鼠肝脏虫荷与唾液腺子孢子感染量的正比关系。感染疟原虫24 h前给予CpG ODN处理,CpG组小鼠肝脏虫荷为CPG对照组的1/5（0.28/1.33）,两者差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 本实验建立的TaqMan RT-PCR分析模型适用于红前期疟原虫（肝脏）虫荷指标的研究。CpG ODN能显著抑制红前期疟原虫的发育。     

Inhibitory role of toll-like receptors agonists in Plasmodium yoelii liver stage development

It is well known that innate immune plays an important role in controlling the development of Plasmodium liver stage. However, little is known about the role of toll-like receptors (TLR) signalling in the pre-erythrocytic immunity against Plasmodium. Here, we found that pre-treatment with individual TLR agonist pam3CSK4 (TLR2), poly(I:C) (TLR3), LPS (TLR4) and CpG (TLR9) could decrease significantly the liver malaria parasite load in mice for 58%, 63%, 75% and 88% respectively. Moreover, no parasitaemia was observed within 14 days in CpG group mice challenged with 100 sporozoites. At 24 h prior to CpG injection, administration of gadolinium chloride (GdCl₃) led to the rebound of liver Plasmodium load through inhibiting selectively Kupffer cells (KC) phagocytosis capacity but failed to neutralize completely CpG-induced immunity against malaria liver stage. Compared with the control, pre-treatment of CpG up-regulated hepatic pro-inflammatory cytokines IL-12, IFN-γ and TNF-α, but down-regulated anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-β. Hence, our data demonstrated the inhibitory role of diverse TLR agonists in the Plasmodium development during pre-erythrocytic stage. As the most robust agonist, CpG might inhibit the development of Plasmodium liver stage through regulation of intrahepatic inflammatory cytokines and enhancement of KC cells phagocytosis capacity.     

恶性疟原虫对氯喹抗性及其逆转剂的研究进展

恶性疟原虫对氯喹抗性的出现和广泛传播迫使人类调整治疗疟疾的用药策略并寻找更加有效的新型抗疟药。然而,在一些贫困的疟疾流行区,氯喹仍被用于治疗恶性疟。了解氯喹抗性机制、探索逆转其抗性的方法,将使氯喹这一价廉高效的抗疟药继续发挥作用。抗性逆转剂的研究和发展为上述目标提供了线索,当与氯喹合用时它能够部分恢复氯喹对氯喹抗性株的作用。为此,本文对恶性疟原虫氯喹抗性机制及其逆转剂的研究进展作一综述。     

IL-10在约氏疟原虫感染过程中免疫调节作用的实验观察

目的探讨IL-10在疟原虫感染过程中的免疫调节效应。方法用约氏疟原虫感染DBA／2和BALB／c小鼠，取血，制薄血膜，染色后镜检疟原虫，计算红细胞感染率；用ELISA试剂盒检测小鼠血清IFN-γ和IL-10水平。结果DBA／2小鼠于感染后第21d自愈，血清IFN-γ在感染后第3d显著升高（6542pg／ml），之后逐渐下降，至感染后第12d仍高于未感染鼠；血清IL-10于感染后第6d显著升高（248pg／ml），并于感染后第15d达到峰值（980pg／ml）后下降。BALB／c小鼠感染后第6d红细胞感染率达57．5％，并于当日和次日全部死亡；血清IFN-γ仅于感染后第3d出现一过性升高，峰值为2225pg／ml而IL-10一直处于高水平状态，峰值为432pg／ml。结论小鼠感染约氏疟原虫后过早分泌的高水平IL-10对Th1反应具有明显的抑制效应，而IL-10适时的分泌可能与Th1向Th2反应的转换密切相关。     

青蒿琥酯阻断恶性疟传播的研究

目的 观察青蒿琥酯（ATS）对恶性疟原虫配子体的作用。 方法 31例外周血含恶性疟原虫无性体和配子体的志愿者分为ATS组（15例）、奎宁（QN）组（10例）和安慰剂组（6例）。ATS组于第0、6和24 h口服青蒿琥酯片各200 mg,第3～6天100 mg/d;QN组口服硫酸奎宁片,每天3次,500 mg/次,连服7 d;安慰剂组口服复合维生素B片,每天3次,2片/次,连服7 d。每例患者每天检查外周血恶性疟原虫配子体密度,并于服药后第1、7、14、21和28天抽取静脉血人工感染大劣按蚊,检测其感染恶性疟原虫子孢子情况。 结果 服药后ATS组恶性疟原虫配子体相对密度迅速下降,第7、14和21天分别为(12.5±3.3）%、（1.2±0.4）%和（0.3± 0.1）%,转阴时间为（22.0±1.4） d;QN组第7、14和21天恶性疟原虫配子体相对密度分别为（173.9±47.0）%、（112.5±45.4）%和（32.5±17.8）%,转阴时间为（32.5±2.1）d,两组间转阴时间差异有统计学意义（t=4.731,P＜0.01）;安慰剂组住院后恶性疟原虫配子体相对密度有所下降。患者血液人工感染大劣按蚊试验显示,服药第14天,ATS组、QN组和安慰剂组的子孢子阳性率分别为0、35.0％和48.7％。子孢子相对感染强度, ATS组第7和14天分别为18.2%和0;QN组第7、14和21天分别为142.0%、98.6%和20.3%。安慰剂组第1、7、14、21和28天子孢子感染强度较稳定, 均为100%(6/6)。 结论 口服ATS 6 d总量1 000 mg对阻断恶性疟传播有良好的作用。     

Protective immunity induced by daily bites from irradiated mosquitoes infected with Plasmodium yoelii

Individuals in malaria endemic regions do not develop fully protective immune responses against Plasmodium liver stage infections. In high transmission areas, individuals can be exposed to more than two infective mosquito bites daily. Their exposure to Plasmodium sporozoites, therefore, is in the form of small and frequent doses. This is very different from individuals studied in controlled immunization trials where the delivery of large numbers of radiation-attenuated sporozoites in a limited number of doses can induce sterile protective immunity. Using irradiated mosquitoes infected with Plasmodium yoelii 17XNL, we tested whether daily bites from a few mosquitoes can induce a protective immune response in mice. This immunization strategy successfully induced a protective response, preventing the development of liver stages when mice were challenged with nonirradiated sporozoites. These results provide further support for the development of liver stage vaccines. They are also a call for further study into why fully protective responses against the liver stage are not seen in individuals from endemic regions.     

Nest-PCR和PCR-RFLP在恶性疟原虫地理株基因分型及多态性研究中的应用

目的 分析套式PCR（nest-PCR）和限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）方法在恶性疟原虫地理株裂殖子表面蛋白（MSP2）基因多态性研究中的分型效率及特异性。 方法 分别在海南省三亚市和云南省腾冲县等地通过静脉采血法采集疟疾患者血样98份,其中恶性疟88份,间日疟10份。另从上海地区的健康人群中抽取10份血样作为阴性对照。用nest-PCR和PCR-RFLP方法分别对疟原虫地理株进行MSP2等位基因分型,并对分型结果进行归纳和比较分析。 结果 常规nest-PCR方法对于恶性疟原虫地理株MSP2等位基因的总检出效率为79.8％（166/208）,其中,对于FC27家族等位基因的检出效率为92.7％（101/109）,但对3D7家族等位基因的检出率仅为65.7％（65/99）,且无法鉴定具体的等位基因。PCR-RFLP分型法检出效率比nest-PCR法提高了20.2%,且特异性好。 结论 PCR-RFLP相对于常规的nest-PCR分型法具有检出效率、分辨率和特异性皆高的优点,可以鉴定地理株中具体的等位基因类型。     

伯氏疟原虫红内期融合抗原的构建、表达及其免疫原性研究

目的 合成伯氏疟原虫红内期融合抗原基因PbCP-2.9，在毕赤酵母真核系统中表达其产物，并进行免疫原性分析。 方法 选取与恶性疟原虫红内期融合抗原基因PfCP-2.9具有同源性的伯氏疟原虫AMA1（Ⅲ）和MSP1-19序列，融合形成PbCP-2.9基因。基因序列经密码子优化，在毕赤酵母中分泌表达。60只BABL/c小鼠均分为6组，其中蛋白免疫组3组，分别用PbCP-2.9蛋白与福氏佐剂、ISA206和IMS1312佐剂乳化后，皮下注射免疫小鼠，抗原免疫剂量20 μg/只·次，注射体积200 μl，共免疫3次，每次间隔2周。佐剂对照组3组，以 PBS代替免疫抗原同法免疫。免疫前及每次免疫后1周鼠尾取血，分离血清。用ELISA和IFAT方法检测血清中特异性抗体的滴度及其与天然抗原的反应结果。 结果 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中分泌表达出Mr约26 400的 PbCP-2.9蛋白，其与抗伯氏疟原虫红内期原虫的血清能进行特异性反应；ELISA检测PbCP-2.9蛋白免疫组结果表明，福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度为(52.62±11.26), 第3次免疫后为( 94.50±52.84); ISA206 组第2次免疫后为(7.59±5.61), 第3次免疫后为( 25.60±16.92) ; IMS1312组第2次免疫后为(9.41±8.86), 第3次免疫后为( 28.92±12.98)。福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度分别为ISA206 组的6.9和IMS1312组的5.6倍（F＝81.06，P＜0.01），第3次免疫后分别为ISA206 组的3.7和IMS1312组的3.3倍（F＝13.29，P＜0.01）。IFAT检测结果显示，经PbCP-2.9免疫的鼠血清与Pb ANKA株虫体表面抗原有阳性反应。 结论 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中高效表达，重组抗原免疫原性强，其免疫血清能识别伯氏疟原虫天然抗原。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端基因导入烟草叶绿体的研究

目的 将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 C末端msp1-42基因（3D7株）导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。 方法　 利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫（3D7株）msp1-42基因的引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出msp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp。通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500 mg/L壮观霉素的选择压力下筛选抗性植株,采用PCR鉴定抗性植株的msp1-42基因及aadA基因,对鉴定阳性植株进行同质化筛选（叶片切碎、在含500 mg/L壮观霉素分化培养基上分化出新的植株）3轮以上,并采用多重PCR分析其同质化情况。 结果　 构建了恶性疟原虫msp1-42基因的叶绿体表达载体LRrrmsp。基因枪转化后获得6个转化子,转化频率为0.6个/枪。转化3～5 d后,小块叶片开始增大增厚,并逐渐由绿色变为黄绿色,7～10 d后黄化或白化,再经约30 d的筛选培养,叶片上出现绿色小芽。PCR检测抗性植株的msp1-42及aadA基因,分别扩增出约900 bp与500 bp的条带,与预期相符。多重PCR分析从经过3轮同质化筛选植株的叶绿体基因中扩增出与未转基因烟草对照大小一致的弱条带,表明经过3轮同质化筛选的转基因植株仍含有未插入外源基因的叶绿体基因组。 结论 获得含恶性疟原虫msp1-42的烟草叶绿体表达载体,并将恶性疟原虫msp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得尚未完全同质化的转基因烟草。