替米沙坦上调3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的机制

目的探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)在替米沙坦调节脂肪细胞脂联素表达中的作用。方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,采用替米沙坦(10μmol/L)和/或PPARγ阻断剂GW9662(30μmol/L)干预3T3-L1脂肪细胞,采用实时定量RT-PCR和Westernblot方法检测3T3-L1脂肪细胞的脂联素表达水平。结果与空白对照组相比,经GW9662干预后3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA表达水平明显降低(P<0.05);替米沙坦组脂联素mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.05);替米沙坦+GW9662组(替米沙坦+GW组)脂联素mRNA和蛋白表达水平有增高趋势,但与空白组相比无统计学差异(P>0.05)。结论 PPARγ活性在替米沙坦上调3T3-L1脂肪细胞脂联素表达过程中可能起着一定程度的作用。     

人脂联素基因在L-02细胞中表达及其功能检测

目的:在人正常肝细胞株L-02中表达外源人脂联素蛋白,并观察其生物学活性。方法:采用脂质体法将成功构建的人脂联素真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin转染L-02细胞;免疫组织化学定位观察脂联素的表达;Western blot检测培养上清及细胞沉淀中脂联素水平;酶联免疫法测定培养基血糖。结果:构建的真核表达质粒能有效转染L-02细胞,并在培养上清及细胞沉淀中检测到脂联素蛋白,该重组蛋白能够降低高糖处理的L-02细胞的血糖水平。结论:重组人脂联素蛋白能在L-02中有效表达,该蛋白定位在细胞质,并且能分泌到胞外,表达产物经体外实验证实具有生物学活性。     

二氢杨梅素对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的改善作用及其机制研究

目的研究二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的改善作用及其机制。方法采用地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞形成胰岛素抵抗细胞,以1×10-6mol·L-1罗格列酮为阳性对照,DMY(1×10-5¹×10-8mol·L-1)与胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞共培养72 h,用葡萄糖氧化酶法测定细胞培养基中的葡萄糖含量,计算葡萄糖消耗量;采用RT-PCR检测脂肪细胞的GLUT4、Akt 2和脂联素基因的表达量。DMY(1×10-51×10-8mol·L-1)与胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞共培养72 h,用葡萄糖氧化酶法测定细胞培养基中的葡萄糖含量,计算葡萄糖消耗量;采用RT-PCR检测脂肪细胞的GLUT4、Akt 2和脂联素基因的表达量。DMY(1×10-5¹×10-8mol·L-1)加入正常3T3-L1脂肪细胞中培养48 h,检测细胞的葡萄糖消耗量。结果 DMY(5×10-71×10-8mol·L-1)加入正常3T3-L1脂肪细胞中培养48 h,检测细胞的葡萄糖消耗量。结果 DMY(5×10-7¹×10-8mol·L-1)明显增加地塞米松诱导胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量,并呈现一定的浓度依赖性,和罗格列酮相比,差异无统计学意义。1×10-51×10-8mol·L-1)明显增加地塞米松诱导胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量,并呈现一定的浓度依赖性,和罗格列酮相比,差异无统计学意义。1×10-5¹×10-8mol·L-1DMY处理正常3T3-L1脂肪细胞48 h后,葡萄糖消耗量与正常组相比差异无统计学意义。RT-PCR结果显示,DMY作用于胰岛素抵抗的脂肪细胞72 h后,脂肪细胞的GLUT4、Akt2和脂联素基因的表达量明显增加,与地塞米松模型组相比,差异有统计学意义。结论 DMY能改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗状态,其机制可能与其上调GLUT4、Akt2和脂联素基因的表达量有关。     

分泌型丛生蛋白通过抑制线粒体自噬缓解H2O2诱导的心肌细胞损伤 #br#

目的 探讨分泌型丛生蛋白（sCLU）对心肌细胞氧化损伤的影响及其机制。方法 采用大鼠心肌细胞 H9C2。实验1分为Control组（仅更换培养基）和H2O2组（100 µmol/L H2O2处理）。实验2分为Control组、pcDNA3.1组 （转染 pcDNA3.1 对照空质粒）、pcDNA3.1-sCLU 组（转染 pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒）、H2O2组（100 µmol/L H2O2处 理）、H2O2+pcDNA3.1 组（pcDNA3.1 对照空质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU 组 （pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）。实验 3 分为 DMSO 组（加入 1% 体积分数 的 DMSO）、Mdivi-1 组（10 µmol/L 的 Mdivi-1 处理）、H2O2+DMSO 组（加入 1% 体积分数的 DMSO 处理 30 min 后加入 100 µmol/L的H2O2处理）、H2O2+Mdivi-1组（10 µmol/L的Mdivi-1处理30 min后加入100 µmol/L的H2O2处理）、H2O2+ pcDNA3.1-sCLU 组（pcDNA3.1-sCLU 过表达质粒转染 48 h 后加入 100 µmol/L H2O2处理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1组（pcDNA3.1-sCLU过表达质粒转染48 h后加入10 µmol/L的Mdivi-1处理30 min,再加入100 µmol/L H2O2 处理）。采用MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二 醛（MDA）水平。DFCH-DA荧光探针测定细胞活性氧（ROS）水平。实时定量聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验 检测细胞中sCLU表达,Western blot法检测CLU、PINK1、Parkin和LC3蛋白表达水平。结果 （1）实验1。与Control 组比较,H2O2组细胞中sCLU mRNA、细胞培养上清中sCLU蛋白及细胞中CLU蛋白相对表达水平均降低（P＜0.01）。 （2）实验2。与Control组比较,H2O2组细胞活力、SOD水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低,细胞凋亡率、ROS水平、MDA 水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均升高（P＜0.05）;与H2O2组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU组细胞活力、SOD水平、 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均升高,细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平、PINK1和Parkin蛋白表达水平均降低（P＜0.05）。（3） 实验3。与DMSO组比较,Mdivi-1组细胞活力与细胞凋亡率差异无统计学意义;H2O2+DMSO组细胞活力下降,细胞 凋亡率升高（P＜0.05）。与H2O2+DMSO组比较,H2O2+Mdivi-1组、H2O2+pcDNA3.1-sCLU组和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+ Mdivi-1 组细胞活力均升高,细胞凋亡率均下降（P＜0.05）。与 H2O2+Mdivi-1 组比较,H2O2+pcDNA3.1-sCLU 组和 H 2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1组细胞活力差异无统计学意义,细胞凋亡率降低（P＜0.05）。结论 sCLU对氧化应 激条下的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与线粒体自噬的抑制有关。     

miR-760靶向调节黑色素瘤抗原家族D1抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的研究北大核心CSCD

目的 探讨microRNA-760(miR-760)靶向负调节黑色素瘤抗原家族D1(NRAGE)表达对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。方法 将胃癌NCI-N87细胞分为空白组、miR-760 NC组、miR-760 mimics组、miR-760 mimics+NRAGE NC组和miR-760 mimics+NRAGE OE组。空白组用RPMI 1640培养基培养;miR-760 NC组、miR-760 mimics组分别转染miR-760 NC、miR-760 mimics;miR-760 mimics+NRAGE NC组同时转染miR-760 mimics和空载pcDNA3.1质粒;miR-760 mimics+NRAGE OE组同时转染miR-760 mimics和NRAGE过表达pcDNA3.1质粒。用蛋白质印迹法检测NRAGE的表达水平,用Transwell实验法检测NCI-N87细胞的迁移、侵袭能力。结果 空白组、miR-760 NC组和miR-760 mimics组的NRAGE蛋白相对表达水平分别为0.95±0.06,0.93±0.09和0.27±0.04;迁移细胞数分别为(268.65±14.08),(261.43±13.25)和(163.25±11.37)个;侵袭细胞数量分别为(183.58±10.65),(176.29±9.93)和(95.73±8.29)个;miR-760 mimics组的上述指标均较空白组、miR-760 NC组显著降低(均P<0.05)。NRAGE OE可显著减弱miR-760 mimics对上述指标的影响(均P<0.05)。结论 miR-760可能通过靶向下调NRAGE表达,抑制胃癌NCI-N87细胞的增殖、迁移及侵袭。     

白藜芦醇对小鼠3T3-L1细胞增殖与分化的影响及其机制

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对小鼠3T3-L1细胞增殖、分化的影响及其机制。方法培养3T3-L1前脂肪细胞,添加不同剂量的白藜芦醇,用WST-1法检测细胞的增殖;用油红O染色后以染色比色法分析脂肪细胞的分化程度;采用RealtimePCR技术检测各组脂联素和瘦素的mRNA表达;采用Westernblot技术检测相关位点,包括沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,Sirt1)、过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated re-ceptor γ,PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(CCTT Aenhan-cerbinding proteinα,C/EBPα)的蛋白质表达。结果Res明显抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,且呈一定的时间-剂量依赖关系;与对照组比较,Res组脂联素和瘦素的mRNA表达水平下降(P<0.01),Res抑制3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化;添加Res导致脂肪细胞中Sirt1蛋白表达水平上升,PPARγ和C/EBPα蛋白表达水平下降。结论白藜芦醇能抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化,其机制可能是通过增加Sirt1表达,抑制脂肪细胞分化相关蛋白PPARγ、C/EBPα的表达。     

周期蛋白D1正反义表达质粒的构建鉴定及其对哮喘大鼠气道平滑肌增殖的影响

观察哮喘大鼠气道平滑肌周期蛋白D1的表达，并构建大鼠周期蛋白D1 (CyclinD1)正反义表达质粒，转染支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)，探讨CyclinD1在哮喘大鼠ASMC增殖过程中的影响。大鼠雾化吸入卵清蛋白建立哮喘模型，免疫荧光检测CyclinD1的表达。以气道平滑肌条总RNA为模板，通过RT-PCR获取大鼠CyclinD1全长cDNA，插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建CyclinD1正义表达质粒(pcDNA3.1-CyclinD1)和反义表达质粒(pcDNA3.1-asCyclinD1)。用脂质体介导的基因转染方法，将正反义重组体和空质粒(vector)分别转染哮喘大鼠和正常大鼠ASMC，用Western blotting方法鉴定CyclinD1基因的表达。采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、增殖细胞核抗原(PCNA)染色等方法观察构建质粒对哮喘大鼠ASMC增殖的影响。结果表明：(1)与对照组相比，哮喘组CyclinD1表达显著增高；(2)酶切鉴定和测序分析证实，试验成功构建了CyclinD1正反义表达质粒。与转染pcDNA3.1-CyclinD1组和vector组相比，转染pcDNA3.1-asCyclinD1组大鼠ASMC中CyclinD1表达水平下降(P<0.01)；(3)与vector组S+G₂M期比例、吸收度(A)值、PCNA阳性表达率相比，转染pcDNA3.1-CyclinD1组增殖指标均明显增加(P<0.01)。转染pcDNA3.1-asCyclinD1组增殖指标均明显下降(P<0.01)。正常组大鼠转染质粒后各组间变化趋势与哮喘组一致。pcDNA3.1-CyclinD1可促进哮喘大鼠ASMC增殖，pcDNA3.1-asCyclinD1可抑制哮喘大鼠ASMC增殖，提示CyclinD1在哮喘ASMC增殖的信号转导中具有重要作用。     

脂联素对高糖环境下肾小球系膜细胞转化生长因子β1及细胞间粘附分子1表达的影响

目的研究脂联素(ADPN)对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子β1(TGF-β1)及细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达的影响。方法以培养的大鼠HBZY-1肾小球系膜细胞(MCs)为受试对象,将MCs分为3组:正常对照组(5.5mmol/L葡萄糖,NG组),高糖组(30mmol/L葡萄糖,HG组),高糖+不同浓度的脂联素组(30mmol/L葡萄糖,2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0μg/mlADPN)分别作用48h后,用ELISA法测定细胞内TGF-β1及ICAM-1表达。结果作用48h后,高糖明显上调细胞内TGF-β1及ICAM-1表达。加入低浓度脂联素对于TGF-β1、ICAM-1表达影响不大,而随着脂联素浓度的升高,TGF-β1及ICAM-1的表达明显下降,与高糖组相比,浓度为10～20mg/L的脂联素组TGF-β1及ICAM-1的表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论中等以上浓度的脂联素能下调TGF-β1及ICAM-1表达,提示脂联素可能通过阻抑TGF-β1及ICAM-1表达起到抗纤维化,从而发挥对糖尿病肾脏的保护作用。     

维生素D对人脂肪细胞脂联素、瘦素表达的影响

目的研究1,25二羟维生素D对人脂肪细胞脂联素、瘦素表达的影响。方法原代分离培养人大网膜前脂肪细胞:前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞:应用免疫组化法检测脂联素、瘦素的表达。结果成功培养人前脂肪细胞并诱导人前脂肪细胞分化为脂肪细胞。分化组脂联素及瘦素表达水平高于未分化组,而1,25二羟维生素D对脂肪细胞脂联素及瘦素表达水平均具有影响,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 1,25二羟维生素D对人脂肪细胞脂联素、瘦素的表达有抑制作用。     

高糖环境下脂联素对人肾小管上皮细胞转化生长因子-β1表达的影响

目的:探讨脂联素(ADPN)对体外高糖培养的人肾小管上皮细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响,以揭示ADPN对高糖环境中的肾小管上皮细胞的可能保护作用机制.方法:人肾小管上皮细胞分别培养于不同的培养基中,在高糖环境中加入脂联素,分别培育48 h后采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中TGF-β1的含量.结果:TGF-β1在高糖组表达较高,加入中等浓度(ADPN浓度为10.0,15.0,20.0μg/mL)TGF-β1的表达减少,和高糖组相比,两者的差异有统计学意义.结论:中等浓度ADPN可以抑制TGF-β1在人肾小管上皮细胞的表达.     

过表达亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因 1对胰腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响

目的 探究过表达亮氨酸拉链假定肿瘤抑制基因1(LZTS1)对胰腺癌PANC-1细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响.方法 将PANC-1细胞按照随机数字表法分为四组,对照组(常规培养)、NC组(转染阴性对照)、pcDNA-LZTS1-1组(转染pcDNA 3.0 LZTS1-1质粒)、pcDNA-LZTS1-2组(转染pcDNA 3.0 LZTS1-2质粒).蛋白质印迹法(Western blotting)检测转染效果;噻唑蓝(MTT)观察PANC-1细胞增殖,流式细胞术检测凋亡率,Transwell法检测细胞的侵袭、迁移.结果 与对照组相比,pcDNA-LZTS1-1组和pcDNA-LZTS1-2组PANC-1细胞中LZTS1蛋白水平[(2.835±0.301),(4.125±0.385)比(1.000±0.085)]显著增加,其中pcDNA-LZTS1-2组增加显著;过表达LZTS1抑制PANC-1细胞增殖、侵袭[(56.369±6.432)个比(117.258±12.152)个]、迁移[(120.145±14.210)个比(233.258±25.148)个],诱导其凋亡[(23.252±2.152)％比(6.589±0.645)％].结论 过表达LZTS1显著抑制PANC-1细胞增殖、侵袭、迁移,促进其凋亡.     

S100A11过表达对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响

目的探讨钙囊素(S100A11)过表达对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。方法构建S100A11过表达载体质粒pcDNA3.1-S100A11,并转染人胰腺癌细胞PANC-1细胞。Western blot检测转染效果;CCK-8检测转染后PANC-1细胞增殖活力;流式细胞术检测PANC-1细胞的凋亡和细胞周期的变化。结果 S100A11蛋白表达量与pcDNA3.1-S100A11的转染量成正相关。过表达S100A11基因可明显提高PANC-1细胞增殖速度,降低凋亡细胞比例,并使PANC-1细胞S期细胞比例增加,G1期细胞减少(P<0.05)。结论S100A11过表达能调控PANC-1细胞周期,并促进PANC-1细胞的增殖。     

防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究

目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制.方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)-EGFP中、构建重组质粒pcDNA3.1 (+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+ )/LL37-EGFP.(2)经组织块法原代培养入阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况.结果:成功构建了pcDNA3.1( +)/HD5-EGFP和pc DN A3.1(+ )/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24h时表达量最高.联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.001).LL37组和联合转染组的LL37水平,联合转染组的HD5水平均是6h时分泌最低,24h达高峰,然后呈下降趋势.HD5组的HD5水平随时间增加而呈增加趋势.结论:HD5和LL37成功转染人人阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础.     

OX40Ig修饰大鼠脂肪间充质干细胞的实验研究

目的构建含OX40融合蛋白(OX40Ig)基因修饰的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)即ADSCs^OX40Ig,探讨其在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法构建pcDNA3.1(+)/OX40Ig融合基因表达载体,采用核转染技术转染大鼠ADSCs,Western blot检测ADSCs中OX40Ig表达水平。ADSCs与大鼠异基因淋巴细胞共培养后分为对照组(反应细胞+刺激细胞)、ADSCs组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs)及ADSCs^OX40Ig组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs^OX40Ig),MTT法检测淋巴细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴细胞内干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-10及转化生长因子(TGF)-βmRNA表达。结果经测序鉴定验证,pcDNA3.1(+)/OX40Ig质粒构建成功,转染ADSCs后OX40Ig蛋白呈高表达;与ADSCs组比较,ADSCs^OX40Ig显著增强异基因淋巴细胞增殖抑制率(P<0.05);对照组、ADSCs组及ADSCs<...     

微小 RNA-212调控 TOB2蛋白表达对转化因子 -β1干预 A549细胞诱导肺纤维化及上皮 -间质转化的影响

目的 探讨微小RNA-212(miR-212)对转化因子-β1(TGFβ1)干预A549细胞诱导肺纤维化及上皮-间质转化(EMT)的影响及可能的相关机制.方法 体外培养A549细胞,实验分组:PBS组(常规培养)、TGFβ1组(含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-con组(转染anti-miR-con后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-212组(转染anti-miR-212后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-212+si-con组(共转染anti-miR-212与si-con后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2组(共转染anti-miR-212与si-TOB2后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养).实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中miR-212与TOB2的表达水平;甲基噻唑基四唑(MTT)检测干扰miR-212的表达对TGFβ1诱导A549细胞增殖的抑制作用,以及下调TOB2的表达对TGFβ1诱导A549细胞增殖的促进作用;双荧光素酶报告基因检测验证miR-212与TOB2的靶向关系;Western blot检测干扰miR-212的表达或下调TOB2的表达对细胞周期蛋白1(CyclinD1)、波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原a1(COL1a1)、上皮钙黏附素(E-cadherin)表达的影响.结果 与PBS组比较,TGFβ1组细胞增殖率显著升高[(100.23±5.64)％比(218.34±16.38)％,P<0.05],miR-212[(1.00±0.14)比(6.07±0.86)]、CyclinD1[(0.54±0.06)比(0.89±0.07)]、Vimentin[(0.26±0.04)比(1.09±0.13)]、α-SMA[(0.43±0.05)比(0.86±0.07)]、COL1a1[(0.57±0.06)比(1.17±0.13)]的表达水平显著升高(P<0.05),而TOB2[(1.02±0.12)比(0.44±0.14)]、E-cadherin[(0.93±0.09)比(0.47±0.06)]的表达水平显著降低(P<0.05);干扰miR-212的表达可显著抑制TGFβ1诱导A549细胞增殖(P<0.05),抑制CyclinD1、Vimentin、α-SMA、COL1a1表达(P<0.05),促进E-cadherin表达(P<0.05);共转染WT-TOB2的miR-212组荧光素酶活性显著低于miR-con组(P<0.05),共转染MUT-TOB2的miR-212组与miR-con组荧光素酶活性比较差异无统计学意义;相较于TGFβ1+anti-miR-212+si-con组,TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2组A549细胞增殖率显著升高[(69.29±8.04)％比(88.27±9.26)％,P<0.05],CyclinD1[(0.59±0.08)比(0.75±0.11)]、Vi-mentin[(0.42±0.05)比(0.56±0.07)]、α-SMA[(0.38±0.06)比(0.53±0.06)]、COL1a1蛋白[(0.41±0.05)比(0.55±0.04)]表达水平显著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平显著降低[(0.82±0.08)比(0.45±0.06),P<0.05].结论 干扰miR-212的表达可通过上调TOB2的表达而抑制TGFβ1诱导的A549细胞增殖及EMT进而发挥抗肺纤维化作用.     

黄芩醇提液对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响

目的：探讨黄芩醇提液对甲型流感病毒核蛋白（NP）的作用。方法本实验设HeLa细胞组、pcDNA3.1（＋）/empty组、pcDNA3.1（＋）/NP 组、TFSB 组,其中pcDNA3.1（＋）/empty 组、pcDNA3.1（＋）/NP 组分别通过瞬时转染将重组质粒 pcDNA3.1（＋）/empty、pcDNA3.1（＋）/NP转染到HeLa细胞中;黄芩醇提液组在将重组质粒pcDNA3.1（＋）/NP转染到HeLa细胞的同时使用黄芩醇提液进行药物干预。结果与真核重组质粒pcDNA3.1（＋）/NP组比较,黄芩醇提液组NP基因起始拷贝数具有统计学意义,P＜0.05。结论黄芩醇提液能够下调甲型流感病毒NP基因的表达。     

脂联素的球状结构域对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型AMPK信号通路的影响

目的观察脂联素的球状结构域(gAd)对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型AMPK信号通路的影响。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。用软脂酸制备脂肪细胞IR模型,3个浓度的gAd干预已产生IR的3T3-L1脂肪细胞。用葡萄糖氧化酶法,检测培养液中葡萄糖的浓度;用RT-PCR法,检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、脂肪酸分解代谢关键酶肉碱脂酰转移酶I(CPT-I)基因水平的变化;用Western blot法,检测AMPK Thr-172磷酸化水平。结果 gAd可促进3T3-L1脂肪细胞IR模型葡萄糖摄取,可增加3T3-L1脂肪细胞AMPK、CPT-I基因的表达,且与剂量呈正相关(均P=0.000);gAd可增加3T3-L1脂肪细胞AMPK Thr-172磷酸化水平,且与剂量呈正相关(P=0.000)。结论 gAd经AMPK途径,可改善3T3-L1脂肪细胞的IR。     

TNF-α对人脂肪细胞与单核/巨噬细胞共培养体系中脂联素和瘦素表达的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人原代脂肪细胞与单核/巨噬细胞系THP-1共培养体系中脂联素和瘦素表达的影响.方法 建立脂肪细胞与单核/巨噬细胞共培养体系,将细胞分为六组:对照组(A组),脂肪细胞单独培养;共培养组(B组),脂肪细胞和THP-1细胞共培养;共培养TNF-α组(C组),脂肪细胞和THP-1共培养,TNF-α 10 ng/ml干预24 h;共培养SP、PD、SB组(D、E、F组),分别用丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路阻断剂SP600125、PD98059、SB203580预处理1 h后,TNF-α 10 ng/ml干预24 h.收集细胞培养的上清液,ELISA法检测脂联素和瘦素的表达.结果 与A组相比,其余各组脂联素表达均减少(P<0.05);D、E、F组脂联素表达较C组增加(P<0.05).各组瘦素表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 TNF-α诱导共培养体系中MAPK信号通路激活;脂肪细胞与单核/巨噬细胞之间相互作用,影响下游炎症因子的表达.     

调节性核糖核酸酶 1对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的探讨调节性核糖核酸酶 1(Reg1)对高糖诱导的视网膜神经节细胞损伤的保护作用及机制。方法 2018年 8月至 2020年 2月构建高糖诱导的 RGC-5视网膜神经节细胞损伤模型,实验分为四组: Con组(正常糖 +未转染的 RGC-5细胞)HG组(高糖 +未转染的 RGC-5细胞)、 pcDNA3-Reg1组(高糖 +转染 Reg1过表达质粒的 RGC-5细胞)、 pcDNA3-NC组(高糖 +转染对、照质粒的 RGC-5细胞)。实时荧光定量聚合酶链式反应检测 Reg1、白细胞介素( IL)-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)的表达;蛋白质免疫印迹检测 Reg1、B淋巴细胞瘤 -2(Bcl-2)、 Bcl-2相关 X蛋白( Bax)、活化的胱天蛋白酶 3(cleaved caspase-3)、磷酸化 p65(p-p65)、磷酸化核因子 κB抑制蛋白 α(p-IκBα)的表达;免疫荧光染色检测 Reg1、p-p65的表达; TUNEL染色检测凋亡水平;酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中各炎性因子的含量。结果 Con组中 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为 1.00±0.21、1.00±0.15、1.00±0.18,HG组 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为 2.49±0.36、3.86±0.42、3.17±0.39,pcDNA3-Reg1组 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为6.77±0.72、8.18±0.67、6.30±0.51,pcDNA3-NC组 Reg1的相对荧光强度、 mRNA相对表达量、蛋白质相对表达量分别为 2.75±0.40、3.59±0.38、2.85±0.34,HG组、 pcDNA3-NC组 Reg1相对荧光强度、 mRNA和蛋白质相对表达量高于 Con组,且低于 pcDNA3Reg1组( P<0.05)。 Con组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 1.73±0.22)%、1.00±0.28、1.00±0.20、1.00±0.17,HG组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 14.79±0.83)%、0.29±0.11、5.25±0.66、4.93±0.52,pcDNA3Reg1组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 3.77±0.34)%、0.58±0.43、2.51±0.45、2.58±0.33,pcDNA3-NC组 TUNEL+细胞比例、 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3分别为( 14.55±0.90)%、0.21±0.14、5.14±0.59、4.77±0.46,Con组、 pcDNA3-Reg1组 TUNEL+细胞比例、 Bax、cleaved caspase-3蛋白质相对表达量低于 HG组、 pcDNA3-NC组,而 Bcl-2蛋白质相对表达量高于 HG组、 pcDNA3-NC组( P<0.05)。 Con组、 pcDNA3-Reg1组细胞 IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α mRNA相对表达量,及上清液蛋白质含量低于 HG组、 pcDNA3-NC组( P<0.05)。 Con组、 pcDNA3-Reg1组 p-p65相对荧光强度,及 p-p65、p-IκBα蛋白质相对表达量低于 HG组、 pcDNA3-NC组( P<0.05)。结论高糖状态下 RGC-5视网膜神经节细胞高表达 Reg1,上调 Reg1表达可以降低细胞凋亡及炎症,可能与抑制 NFκB信号通路活化有关。     

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。