肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与死亡受体结合后，可启动凋亡信号的转导。它对肿瘤细胞的高效杀伤作用使其成为最具有潜力的肿瘤治疗药物，但在TRAIL的研究领域中仍然存在许多热点问题有待解决。本文综述了近年来TRAIL认几诱导肿瘤细胞凋亡的胞内机制、抗肿瘤活性及安全性问题的研究进展。     

重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体纯化中试工艺研究

目的摸索一条适合重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的中试分离纯化工艺。方法发酵后菌体经洗涤、超声破碎和2步盐析等预处理后,经过3步色谱纯化,对最终蛋白质进行纯度、内毒素和活性检测。结果目的蛋白质纯度达98%以上,生物活性为4.8×107-6.94×107U/mg,热原符合标准。最终1L发酵液经过分离纯化,可以得到目的蛋白质200mg以上。结论此工艺纯化收率高,蛋白质纯度高,生物活性好,重复性好,适合工业化生产。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与肿瘤治疗

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）或称凋亡素2配体（Apo2 ligand,Apo-2L）是1995年发现的TNF超家族的新成员。它的最大特点是可以选择性诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡,但对正常组织和细胞没有显著毒性效应。本文从TRAIL的结构、受体、凋亡机制及其在肿瘤治疗中的应用等方面对其进行了介绍。TRAIL很可能在肿瘤治疗方面发挥重要作用。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体临床治疗应用前景

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)具有选择性细胞毒性,不仅诱导肿瘤细胞凋亡,还诱导肝和脑细胞凋亡,也诱导病毒感染的细胞凋亡,但对机体正常组织无毒性。TRAIL已成为全球新药研究的热点。本文从TRAIL的凋亡通路及其调控、肿瘤细胞对TRAIL抵抗的原因综述TRAIL在难治性疾病治疗中的应用。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体研究进展

目前认为，肿瘤的发生发展除了与细胞增殖失控和细胞分化异常有关外，另一个重要原因是发生转化的细胞不能正常凋亡，而细胞凋亡（又称程序性死亡）是基因编程调控的细胞自主性死亡过程。已知多种因素参与诱导和抑制细胞凋亡，而细胞表面的受体和配体相互作用在诱导凋亡中起主导作用。     

药物载体用于递送肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）是肿瘤坏死因子家族的成员之一,可与肿瘤细胞膜表面过度表达的死亡受体4或5结合,特异性诱导肿瘤细胞凋亡,且对正常细胞无明显影响,因此被认为是临床最有发展前景的蛋白药物之一。然而,由于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体存在体内稳定性差和生物利用度低等缺点,限制了其在临床中的应用。运用药物载体对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体进行递送,成为目前解决此弊端的有效策略。本综述简要介绍了近年来药物载体在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体递送方面的研究进展。     

芥子气诱导真皮成纤维细胞分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的时效和量效研究

目的探讨芥子气诱导真皮成纤维细胞分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的规律。方法采用酶联免疫吸附（ELISA）方法,检测不同浓度的芥子气调节TRAIL分泌的量效和时效关系。结果真皮成纤维细胞自身可分泌一定量的TRAIL,芥子气作用后,可显著上调其TRAIL的分泌（P〈0．05）,并呈时间依赖性和剂量依赖性。结论芥子气治疗银屑病的作用机制可能与促进细胞分泌TRAIL有关。     

离子交换层析法纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白

目的纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白。方法将pET28a-TRIAL转入BL21(DE3),先进行硫酸铵初级分离,然后利用CM Sepharose阳离子交换柱进行离子交换层析进行纯化。结果在20℃条件下,使用0.5 mmol/LIPTG诱导8 h,TRAIL蛋白表达量达到最大;经硫酸铵初步分离和离子交换层析纯化后,从1L菌液纯化得到5.8 mg纯净的TRAIL蛋白。结论成功建立了一种原核表达TRIAL蛋白的大规模纯化方法。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的 获取抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗体。方法 利用PCR技术和基因重组技术将TRAIL基因构建于原核表达载体pPre-TMHTb中，经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后，通过IPTG诱导其在大肠杆菌DH-5α中获得表迭，并将TRAIL蛋白免疫家兔，通过DotBlot及Western Blot检测抗TRAIL抗体的产生。结果 成功构建TRAIL基因原核表达栽体，并在大肠杆菌DH一5α中获得表达，TRAIL蛋白表达量占菌体蛋白质总量的11．8％，经Dot Blot及Western Blot检测证实获得了抗TRAIL抗体。结论 成功制备抗TRAIL抗体，从而为TRAIL在真核细胞水平的深入研究奠定了实验基础。     

重组Pichia pastoris的发酵条件初步研究

在摇瓶中进行重组Pichia pastoris菌株SIBAS 5071发酵条件的研究,考察了碳源、底物、pH、磷酸盐浓度、溶氧量等对该菌细胞生长和产生S-腺苷甲硫氨酸(sAM)的影响,初步确定的优化条件下发酵3 d后,SAM产量可达2.3 g/L(118 mg/g干细胞).     

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

发酵条件对毕赤酵母工程菌产rhBSP的影响

Pichia pastrois酵母工程菌GSll5／pPICZaA—hbsp能分泌表达重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)。本文通过其发酵条件的研究，找出摇瓶发酵表达rhBSP的最适条件。以BMGY作为种子培养基，菌体密度A500达到9时，重悬于1／5体积的BMMY培养基中，A500达到45，pH值6．0，2％甲醇诱导4d，rhBSP产量达高峰期，最大表达量为0．255g/L。     

重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的药代动力学和组织分布

目的研究重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)的药代动力学和组织分布。方法恒河猴单次静脉滴注rhTRAIL1,5和25mg.kg-1及iv5mg·kg-1后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定rhTRAIL在恒河猴体内的血药浓度,并采用放射性核素示踪技术结合三氯乙酸(TCA)沉淀和分子排阻高效液相色谱法测定[125I]rhTRAIL在荷瘤裸鼠组织内的含量。结果恒河猴单次静脉滴注rhTRAIL1,5和25mg·kg-1后,各剂量组的药代参数除cmax和AUC以外,均无显著差异,表现出线性动力学性质。恒河猴每天给药1次,连续7d,药物在体内没有蓄积。恒河猴静脉滴注和iv给药对药物的体内清除过程无明显影响。[125I]标记rhTRAIL后的放化纯度大于98%。荷瘤裸鼠iv给予[125I]rhTRAIL后,在各组织广泛分布,总放射性在肿瘤组织中于给药后2h达到高峰,在其他大部分组织中于给药后10min达高峰。给药后10min及2,8和24h,肿瘤/血清的酸沉放射性比值分别为0.07±0.01,0.62±0.17,0.78±0.57和1.66±0.50;给药后24h,肿瘤组织的放射性浓度高于其他组织和血清。结论在研究剂量范围内,rhTRAIL在恒河猴体内表现为线性动力学。[125I]rhTRAIL给药后在荷瘤裸鼠中广泛分布,在肿瘤组织中分布浓度较高,并主要经肾脏排泄。     

重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究

目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

毕赤酵母高效电转化条件的研究

目的建立毕赤酵母的高效电转化方法,为利用毕赤酵母重组表达海洋药物功能基因提供方法基础。方法采用电穿孔的方法把外源DNA转化进毕赤酵母基因组中。通过对毕赤酵母生长状态,电击条件等影响因素进行探索。结果当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、电压为1.5kV、质粒浓度为0.15g.L-1和0.2cm电转化杯时,转化效率达到最大值,为每微克质粒DNA 36个转化子。经抽样PCR鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。结论通过对电转化各种条件的优化,获得了高效电转化技术方法。     

重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定

目的在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。