脑损伤患者骨髓间充质干细胞形态学特征

目的:骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs)具有自我复制能力,可以经过不可逆的终末分化过程产生子代细胞,神经元细胞,极有可能成为组织工程较为理想的种子细胞。观察脑损伤患者骨髓间充质干细胞形态学变化,以寻求另一种治疗方式。方法:实验于2003-09/11在河南省人民医院生物治疗研究中心完成。将脑损伤患者的BM-MSCs,自体骨髓经密度梯度离心分离、纯化和培养,观察原代和传代细胞的细胞形态。结果:原代培养的BM-MSCs最佳的贴壁时间为3d,生长性状不一,呈散在圆形细胞群、克隆圆形细胞群、散在梭形细胞群、花带状细胞群、旋涡状细胞群,而传代培养的细胞,增殖速度较快,性状一致,排列规则,呈饱满的梭行。结论:体外非诱导培养的BM-MSCs方法可能为临床治疗脑损伤患者提供种子细胞。     

缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：观察缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞形态学特征。方法：将缺血性脑血管病患者自体骨髓中的阃充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM—MSCs）经密度梯度离心法分离、纯化和培养，观察原代和传代细胞的形态。结果：原代培养的BM—MSCs最佳贴壁时间为3d，生长性状不一，呈散在圆形细胞群、散在梭形细胞群、克隆圆形细胞群、花带状细胞群、漩涡状细胞群，而传代培养的细胞，增殖速度较快，性状一致，排列规则，呈饱满的梭行。结论：通过体外非诱导培养获得的自体BM—MSCs，有较强的增殖能力和多向分化潜能，为缺血性脑血管病的临床治疗提供了实验依据。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞形态学的实验研究

目的：慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞形态学实验观察。方法：将慢性粒细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞，自骨髓经密度梯度离心分离、纯化和培养，观察原代和传代细胞的细胞形态。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞最佳的的贴壁时间为3d，生长性状不一，散在圆形细胞群、树枝状细胞群、飞燕状细胞群、火焰状细胞群。结论：体外非诱导培养的骨髓间充质干细胞方法可能为临床治疗慢性粒细胞性白血病患者进行异基因骨髓移植后抑制移植物抗宿主病反应提供物质基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养——贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法

目的：对骨髓间充质干细胞的培养一般采用流式细胞仪分离法及密度梯度离心法和免疫磁珠分离法，本实验观察了采用贴壁分离和消化控制相结合方法分离纯化的可行性。方法：实验于2004—09／12在锦州医学院附属第一医院外科实验室完成。选取6—8周龄的SD大鼠，雌雄不限，从其股骨、胫骨中取材，在无菌条件下操作，用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端，暴露骨髓腔，用含有体积分数为0．15的胎牛血清Dulbecco改良培养基从骨髓腔中冲出骨髓于平皿中，用含有体积分数为0．1的胎牛血清的Dulbecco改良培养基培养，用消化控制及贴壁分离法分离纯化骨髓间充质干细胞，并观察其生长状态，测定骨髓间充质干细胞的生长曲线，分裂指数，贴壁率，用免疫细胞化学方法对骨髓间充质干细胞进行表型分析。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈椭圆型、短梭型、长梭型、多角型等。纯化、扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭型，第6代前生长性状稳定，增殖能力强。传代周期为7d，每次传代时细胞活力测定均&;gt;97％，传代后24h内贴壁率99％。免疫细胞化学检测第3代细胞均匀表达CD54(ICAM-1)、纤维连接蛋白。结论：实验建立了一种可行的大鼠骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增方法。培养的骨髓间充质干细胞纯度高，细胞活力强，生物学性状稳定。本实验通过贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便，条件要求低等优点，是目前一种比较理想的分离纯化方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞作为良好的种子细胞,将其复合于生物支架治疗骨缺损取得了良好的进展,是当今研究的一大热点。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨样细胞分化的效果。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为2组,对照组细胞仅用DMEM/F12培养基培养;实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12培养基培养。结果与结论：全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或多角形贴壁生长;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈圆形或卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组（P〈0.01）;茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组有明显增加（P〈0.01）;骨钙素ELISA定量分析较对照组明显升高（P〈0.01）。提示全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

密度梯度离心与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞及其生物学特性观察

背景：获取更大量、更高纯度、有活性的骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究发展的基础。目的：拟建立一套体外分离培养及大量扩增兔骨髓间充质干细胞的方法，并对细胞生物学特性进行观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—12／2007—07在山东省烟台市莱阳中心医院骨科试验室完成。材料：清洁级1月龄雌性新西兰大白兔1只。方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方式，分离兔骨髓间充质干细胞，应用细胞刮收集呈长梭形的细胞，形成克隆后用胰蛋白酶＋EDTA消化，按1：3传代进行体外扩增培养。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态特征，免疫细胞化学SABC法鉴定CD34、CD44抗原的表达，观察细胞生长特性，测定细胞活力。结果：原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形，漩涡状排列，约14d达90％以上融合；传代后增殖迅速，细胞为单一的梭形，排列更加有序。所培养的细胞CD44呈阳性表达，而CD34呈阴性。第1～5代细胞培养3—5d为对数生长期，第7代以后对数增长期延长。第1～5代细胞成活率均〉94％，其中第3，4代成活率高达97％；至第7代细胞活力呈明显下降趋势，细胞成活率仅为78％。结论：应用密度梯度离心结合贴壁法，可成功分离并扩增兔骨髓间充质干细胞，且细胞生长稳定，增殖力强．可作为细胞移植的种子细胞。     

密度梯度离心与贴壁法分离培养免骨髓间充质干细胞及其生物学特性观察

背景：获取更大量、更高纯度、有活性的骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究发展的基础。目的：拟建立一套体外分离培养及大量扩增兔骨髓间充质干细胞的方法，并对细胞生物学特性进行观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—12／2007—07在山东省烟台市莱阳中心医院骨科试验室完成。材料：清洁级1月龄雌性新西兰大白兔1只。方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方式，分离兔骨髓间充质干细胞，应用细胞刮收集呈长梭形的细胞，形成克隆后用胰蛋白酶＋EDTA消化，按1：3传代进行体外扩增培养。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态特征，免疫细胞化学SABC法鉴定CD34、CD44抗原的表达，观察细胞生长特性，测定细胞活力。结果：原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形，漩涡状排列，约14d达90％以上融合；传代后增殖迅速，细胞为单一的梭形，排列更加有序。所培养的细胞CD44呈阳性表达，而CD34呈阴性。第1～5代细胞培养3—5d为对数生长期，第7代以后对数增长期延长。第1～5代细胞成活率均〉94％，其中第3，4代成活率高达97％；至第7代细胞活力呈明显下降趋势，细胞成活率仅为78％。结论：应用密度梯度离心结合贴壁法，可成功分离并扩增兔骨髓间充质干细胞，且细胞生长稳定，增殖力强．可作为细胞移植的种子细胞。     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的：探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化，为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据。方法：实验于2005-05／06在解放军北京军区总医院肝病中心完成。骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者，应用Ficoll分离液分离培养其骨髓间充质于细胞，应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化，采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中自蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达，通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。结果：①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20d左右细胞生长达80％～90％汇合，其形态呈较均一的长梭形。②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后，诱导组中出现圆形细胞，呈克隆样生长。③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时，表达少量白蛋白核糖核酸，于诱导3周时可见白蛋白．核糖核酸的表达明显增多。④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中自蛋白及角蛋白18染色均呈阳性。结论：肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景：培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提。目的：寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记。结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统。第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性。提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验。     

成人骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞的诱导分化

背景：促甲状腺素、胰岛素或类胰岛素生长因子等对甲状腺细胞的发育分化、特异基因的表达及功能的产生等起着重要作用,故实验模拟甲状腺的体内胚胎发生过程逐步加入以上刺激因子对骨髓间充质干细胞进一步诱导。目的：探讨在特定环境下体外定向诱导成人骨髓间充质干细胞分化为甲状腺细胞的可行性。方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞,应用促甲状腺素、胰岛素等试剂进行诱导。利用倒置光学显微镜、透射电镜观察细胞分化过程的形态学变化,免疫荧光等检测方法研究成人骨髓间充质干细胞的分化情况。结果与结论：诱导组培养第3天可见骨髓间充质干细胞由长梭形变为圆形、椭圆形或三角形,不规则形生长,边界欠清晰。从第8天开始可见贴壁的胚胎体逐渐呈扁平状。诱导培养第7天可见分化细胞中有甲状腺细胞的特有基因如TSHr的表达;第9天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TTF-1的表达。结果初步表明骨髓间充质干细胞可以在体外诱导分化为甲状腺细胞,是研究甲状腺疾病组织工程治疗的理想种子细胞。     

聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织

背景:研究证实,在一定的诱导条件下,骨髓间充质干细胞可能向心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化.目的:探索以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,体外构建工程化心肌组织的可行性.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞加入含5-氮胞苷的培养液进行诱导分化,培养4周.将诱导成功后的细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物上,培养14 d.以倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后骨髓间充质干细胞中心肌特异性肌钙蛋白l的表达,大体观察工程化心肌组织在培养期间的形态,透射电镜观察工程化心肌组织的超微结构.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞14 d形成集落,传代细胞体积变大,5-氮胞苷诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长.免疫荧光染色结果显示诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.透射电镜可见肌丝、Z线样物质.结果证实,以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,可于体外构建出类似天然心肌的工程化心肌组织.     

成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

目的:为避免种子细胞培养过程中应用异体或异种血清的排斥及伦理问题,制备成人自体血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞,观察其增殖及生长特征。方法:实验于2005-01/2006-01在北华大学医学院细胞生物实验室完成。①细胞来源:选取北华大学医学院附属医院收治的行骨髓干细胞保健治疗的成年志愿者3名,25～30岁,对本实验均知情同意。②实验方法:空腹无菌采集志愿者外周静脉血40mL,4℃静置4h,37℃静置4h,500g离心30min,吸取上清,即自体血清。从骨髓血中提取间充质干细胞,利用DMEM/F12培养基添加自体血清进行黏附培养和扩增。原代记为P1,按1∶3进行传代接种,第2代记为P2,以此类推。每次传代培养的细胞接种密度严格控制与原代培养接种密度相同的水平。③实验评估:倒置光学显微镜下观察骨髓间充质干细胞生长和形态变化,计数和MTT法观察原代和传代培养的增殖及生长特征,免疫组化法分析骨髓间充质干细胞纯度。结果:①原代及传代培养的成人骨髓间充质干细胞的光镜观察:原代培养24h后可见贴壁细胞,部分细胞有伪足伸展,第3天换液时有散在克隆生长,第5天呈克隆式增殖,10～12d可达90%细胞融合,基本铺满孔底面,呈骨髓间充质干细胞特征性的旋涡状生长,排列有方向性,旋涡中心细胞呈多层分布,细胞界限不清,细胞形态多呈梭形。传代细胞的生长较原代快,4h内即发现有贴壁细胞,24h内完全贴壁并伸展,第6～8天即可达到80%以上融合。②成人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:原代接种后2～6d为生长潜伏期,第7天开始形成大小不一的多个细胞克隆,至第9天细胞克隆进一步扩大,细胞数目呈指数级递增,为对数增殖期;第10～12天细胞生长进入平台期,原代培养结束。传至5代内的细胞生长旺盛,生长特性基本与第1代一致。③成人骨髓间充质干细胞免疫组化鉴定结果:P0、P1、P3、P5代细胞CD34染色呈阴性,而CD105染色阳性细胞在95%以上。结论:以自体血清体外扩增培养的骨髓间充质干细胞纯度高、增殖活性强,且至少在5代内生长旺盛并维持其生物特性。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景：国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的：观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法：体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论：人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10／12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5d后首次换液，细胞融合率达90％时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14d左右可达90％融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1～3d为潜伏期，3d后进入对数生长期，7～8d为平台期，平均倍增时间为24．22h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93．0％。结论：采用密度梯度离心联合差速贴擘、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

Ficoll密度梯度离心法分离培养纯化猪的骨髓间充质干细胞

背景：研究报道显示猪骨髓间充质干细胞体外分离方法、效率、培养条件各不相同,并且尚无统一的鉴定标准。目的：建立一种高效、经济的猪骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定方法。方法：采集健康猪股骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,进行原代和传代培养,流式细胞仪检测细胞膜表面抗原表达情况,并观察细胞成骨、成脂及成软骨分化的能力。结果与结论：分离培养的单个核细胞活力旺盛,体外生长良好,细胞呈梭形、纺锤形和小多角形,具有稳定的增殖分裂能力;细胞膜表面抗原CD29、CD44、CD90呈阳性表达,而CD14、CD34、CD45、CD166、HLA-DR呈阴性表达;在特定诱导条件下,该细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。说明采用Ficoll密度梯度离心法成功分离培养出纯化的猪骨髓间充质干细胞,其生长状态良好,具有多项分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法

目的:对骨髓间充质干细胞的培养一般采用流式细胞仪分离法及密度梯度离心法和免疫磁珠分离法,本实验观察了采用贴壁分离和消化控制相结合方法分离纯化的可行性。方法:实验于2004-09/12在锦州医学院附属第一医院外科实验室完成。选取6～8周龄的SD大鼠,雌雄不限,从其股骨、胫骨中取材,在无菌条件下操作,用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端,暴露骨髓腔,用含有体积分数为0.15的胎牛血清Dulbecco改良培养基从骨髓腔中冲出骨髓于平皿中,用含有体积分数为0.1的胎牛血清的Dulbecco改良培养基培养,用消化控制及贴壁分离法分离纯化骨髓间充质干细胞,并观察其生长状态,测定骨髓间充质干细胞的生长曲线,分裂指数,贴壁率,用免疫细胞化学方法对骨髓间充质干细胞进行表型分析。结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈椭圆型、短梭型、长梭型、多角型等。纯化、扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭型,第6代前生长性状稳定,增殖能力强。传代周期为7d,每次传代时细胞活力测定均>97%,传代后24h内贴壁率99%。免疫细胞化学检测第3代细胞均匀表达CD54(ICAM-1)、纤维连接蛋白。结论:实验建立了一种可行的大鼠骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增方法。培养的骨髓间充质干细胞纯度高,细胞活力强,生物学性状稳定。本实验通过贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便,条件要求低等优点,是目前一种比较理想的分离纯化方法。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用

目的：目前有关骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化的研究较少。本实验分离和培养人骨髓间充质干细胞，用带有VEGF165的质粒转染人骨髓间充质干细胞，探讨血管内皮生长因子对其体外诱导分化的作用。 方法：实验于2005—04／2006—04在吉林大学人兽共患病教育部重点实验室完成。取成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓（自愿提供），采用Percoll梯度分离培养骨髓间充质干细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。原代细胞培养至增殖接近融合状态时，单克隆培养法分离传代培养，扩增骨髓间充质干细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫学表型。在原核细胞大肠杆菌DH5α中复制扩增和提取，纯化、克隆pcDNA3．0-VEGF165质粒。用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞：应用流式细胞术检测诱导后骨髓间充质干细胞免疫学表型变化j并采用免疫荧光染色鉴定转染情况，并设质粒空载和未转染的骨髓间充质干细胞为对照。 结果：人骨髓间充质干细胞原代培养1周后，造血细胞消失，贴壁细胞体积增大，呈现梭形外观，有粗大的细胞突起伸出。2周后细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显的方向性，细胞排列成旋涡状、网状、辐射状。流式细胞术显示，人骨髓间充质干细胞免疫学表型CD44、CD29阳性，CD34、CD31、CD45阴性。VEGF165诱导骨髓间充质千细胞后CD44表达明显降低，CD31明显升高。免疫荧光染色显示，用FITC标记后的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光，用cy3标记的CD31抗体使细胞显现了红色荧光。 结论：转染后的骨髓间充质干细胞细胞表型发生明显转变，CD31表达率明显增高，呈现典型的内皮细胞的表型特征，这说明骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞分化的潜能。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07／2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0．1μmol／L地塞米松、10mmol／L β-甘油磷酸钠、50μmol／L维生素C对第3代骨髓间充质于细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。主要观察指标：相差强微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显做镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延艮，局部细胞呈重叠牛长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14d可形成倒置显做镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节争黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

背景:培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是其作为种子细胞在组织工程等领域广泛应用的重要前提.目的:寻求快捷有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,免疫荧光分析细胞骨架,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测其表面标记.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形;细胞生长曲线呈S形;微丝免疫荧光染色结果显示,培养的骨髓间充质干细胞具有良好的细胞骨架系统.第3代骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD71、CD90均呈阳性表达,而CD13、CD34、CD45、CD133呈阴性.提示,经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学和细胞表面标志物表达方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为骨髓间充质干细胞,其第3代活性最佳,可用于后续实验.