恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞三维成型的体外实验

目的观察在三维胶原体外培养条件下恶性胶质瘤细胞体外诱导内皮细胞血管生成的作用.方法采用鼠尾胶原作为内皮细胞样细胞ECV-304培养的支架,以恶性胶质瘤细胞系SHG-44作为诱导条件,观测ECV-304细胞生长和小管样结构形成的过程,测定形成曲线、小管管径和管长以及细胞周期,比较有和无SHG-44细胞诱导ECV-304细胞形成小管样结构的差异.结果 SHG-44细胞对体外三维培养的ECV-304细胞具有诱导小管形成的作用,所诱导的小管管径和管长数值均较对照组大,小管形成时间早.结论恶性胶质瘤细胞能促进内皮细胞的生长、迁移和小管结构的形成,是研究体外血管生成研究的良好模型.     

CXCR4在胶质瘤血管内皮细胞和ECV304细胞中的表达及其意义

目的检测人胶质瘤血管内皮细胞以及体外培养的血管内皮样细胞系ECV304趋化因子受体CXCR4的表达,观察其配体SDF-1对血管内皮样细胞迁移的影响,以探讨趋化因子受体CXCR4在肿瘤血管生成中的可能作用及其机制.方法通过免疫组化方法检测人胶质瘤血管内皮细胞CXCR4蛋白的表达,采用RT-PCR、免疫细胞化学方法检测血管内皮样细胞系ECV304上CXCR4 mRNA和CXCR4蛋白的表达,并采用48孔趋化板观察SDF-1诱导体外培养血管内皮样细胞的迁移作用.结果在胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上均检测到趋化因子受体CXCR4的表达,体外实验显示SDF-1能诱导血管内皮样细胞发生明显的迁移.在30、50 ng/ml的实验浓度范围内,诱导血管内皮样细胞的迁移作用呈明显量效关系.结论胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上存在CXCR4表达,CXCR4激活能诱导内皮细胞的迁移.     

人恶性胶质瘤细胞SHG-44经诺帝诱导分化后形态学改变及差异表达蛋白的质谱分析

目的:观察人恶性胶质瘤细胞SHG-44经去甲二氢愈创木酸类似物--诺帝诱导分化后形态学的改变,并分析差异表达蛋白.方法:分别用100、200 μmol/L诺帝诱导SHG-44细胞分化,观察处理后24、48、72 h细胞形态学的改变,并与未受刺激的空白对照组相比较;提取200μmol/L诺帝处理后的SHG 44细胞以及空白对照组细胞总蛋白进行双向电泳,用PDqest7.1软件比较两者间的差异表达蛋白,离子飞行时间质谱仪分析高丰度表达的差异蛋白.结果:200 μmol/L诺帝处理后SHG-44细胞的形态学改变较100 μmol/L更为明显;处理72 h时细胞分化最为明显.与空白对照组SHG-44细胞相比,经200 μmol/L诺帝诱导后,双向电泳发现了23个差异蛋白点,其中21个蛋白点表达下调,2个蛋白点表达上调.质谱分析高丰度表达的差异蛋白分别为:未知蛋白、增殖相关基因A、解链蛋白Up1、交替拼接因子ASF-3、cofiln 1、真核转录启动因子5A、β半乳糖苷酶结合凝集素、Pi类谷光苷肽-S-转移酶.结论:诺帝能诱导人恶性胶质瘤细胞SHG-44分化,并呈一定的时效及量-效依赖性,分化后的差异蛋白涉及到细胞增殖、分化、凋亡及基因转录调控等多个方面.     

丁酸钠诱导人脑胶质瘤细胞系SHG-44凋亡的初步探讨

目的:研究短链脂肪酸盐丁酸钠对培养人脑胶质瘤细胞系SHG-44的增殖抑制和凋亡诱导.方法:通过细胞体外培养的方法,以2mmol/和4mmol/L丁酸钠处理SHG-44细胞,用MTT比色试验和PCNA免疫组化染色观察细胞增殖,电子显微镜、线粒体跨膜电位(△ψm)检测以鉴定细胞凋亡.结果:①SHG-44细胞增殖受到明显抑制,PCNA表达减弱;②4mmol/L丁酸钠明显诱导SHG-44细胞凋亡,电镜下可见细胞膜内陷自行分割包裹碎裂的核片段和部分胞浆,脱离细胞主体,形成凋亡小体;罗丹明123染色示凋亡细胞△ψm下降.结论:丁酸钠能抑制人脑胶质瘤SHG-44细胞的增殖,4mmol/L丁酸钠能诱导SHG-44细胞发生线粒体途径凋亡.     

心肌成纤维细胞诱导体外血管新生的实验研究

目的探讨心肌成纤维细胞在血管新生中的作用。方法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF),并收集其条件培养液(cardiacfibroblastconditionedmedium,CF CM)作为ECV304[人脐静脉内皮细胞株(humanumbilicalveinendothelialcellstrain)]细胞的培养液,用3H TdR掺入法检测CF CM对ECV304细胞增殖活性的影响;采用体外血管新生三维模型,检测其是否能诱导ECV304细胞向凝胶内侵入。结果乳鼠心肌成纤维细胞的条件培养液明显促进ECV304细胞增殖(P<0.01),诱导ECV304细胞向凝胶内侵入迁移生长,形成树枝样发芽结构。结论心肌成纤维细胞的条件培养液可促进ECV304细胞增殖和迁移,即有促血管新生作用。     

吴茱萸碱对胶质瘤SHG-44细胞凋亡的促进作用及其机制

目的研究吴茱萸碱对人胶质瘤SHG-44细胞凋亡的促进用及其机制。方法将体外培养的胶质瘤SHG-44细胞分为对照组、吴茱萸碱组(根据吴茱萸碱浓度不同分为3个亚组),CCK-8法观察细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Hoechst 33258核染色法观察细胞核凋亡,透射电镜观察细胞形态学的变化,Western blot法检测胶质瘤SHG-44细胞内Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表达。结果吴茱萸碱对胶质瘤SHG-44细胞增殖有抑制作用。流式细胞仪及Hoechst 33258核染色法的检测结果表明,随着吴茱萸碱作用浓度的递增,胶质瘤SHG-44细胞凋亡率呈剂量依赖性递增;吴茱萸碱作用后可使Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达升高。结论吴茱萸碱通过改变Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达,抑制胶质瘤SHG-44细胞增殖并促进其凋亡。     

电离辐射诱导pEgr-hPTEN 表达增强其体外抗肿瘤作用

目的：研究辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染联合X射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖和诱导细胞凋亡的作用。 方法：以脂质体介导携有外源野生型PTEN基因的表达载体pEgr-hPTEN转染人胶质瘤SHG-44细胞,筛选稳定转染细胞克隆并扩增培养,以Western blotting法检测PTEN基因的辐射诱导表达情况,应用流式细胞仪及生长曲线测定稳定转染联合0~10 Gy X射线照射对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响。 结果：SHG-44-hPTEN稳定转染细胞PTEN蛋白的相对表达量可被辐射诱导增强,5 Gy以内呈剂量依赖性增加。稳定转染联合辐射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,照射后第8天稳定转染不同剂量组细胞数仅为稳定转染0 Gy假照组的30.0%~50.0%和未转染0 Gy假照组的7.7%~13.0%;稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0 Gy假照组的1.5~2.3倍、未转染照射组的1.9~4.4倍及未转染0 Gy假照组的3.4~5.1倍。 结论：体外基因-放射联合作用可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

血管生成抑制剂TNP-470对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44及其移植瘤生长的影响

目的：观察TNP－470对人恶性胶质瘤细胞系SHG－44体内和体外生长的影响。方法：采用MTT法、软琼脂克隆法、流式细胞仪、光镜和透射电镜技术观察SHG－44细胞体内外增殖、克隆形成、细胞周期和形态学变化及异种移植瘤生长情况。结果：20－2000ng/mlTNP－470可显著抑制SHG－44细胞体外增殖,克隆形成率显著降低,G0／G1期细胞明显增多,S、G2／M期细胞减少。彩和30mg/kg体重TNP－470隔日皮下注射后,移植瘤体积缩小、重量显著减轻,组织出现明显调亡细胞和坏死。结论：TNP－470对SHG-44细胞的生长抑制作用与其调控细胞周期和诱导细胞凋亡相关,提示TNP－470作为一种血管生成抑制剂对胶质瘤细胞生长也具有直接抑制作用。     

β-榄香烯对血管内皮细胞成血管能力、细胞凋亡及MMP-2、MMP-9活性的影响

  目的 观察β-榄香烯对血管内皮细胞成血管能力、细胞凋亡及基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9活性的影响,探讨β-榄香烯对肿瘤血管生成的抑制作用。方法 人血管内皮细胞株ECV304体外培养,Matrigel胶检测血管内皮细胞的成血管能力,Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,明胶酶谱实验检测血管内皮细胞中MMP-2和MMP-9的活性。结果 接种于Matrigel胶的ECV304细胞经β-榄香烯作用后,形成管腔数目明显减少。随着β-榄香烯浓度增加及作用时间延长,ECV304细胞凋亡明显增多。明胶酶谱实验结果显示,β-榄香烯可明显抑制内皮细胞中MMP-2和MMP-9的活性。结论 β-榄香烯可以促进体外培养的血管内皮细胞凋亡,抑制血管内皮细胞的成血管能力,使血管内皮细胞在Matrigel胶中形成的管腔数目减少,同时β-榄香烯能够抑制血管内皮细胞中MMP-2和MMP-9的活性。     

对乙酰氨基酚联合外照射对脑胶质瘤细胞照射后代增殖的影响

目的 观察对乙酰氨基酚联合外照射对脑胶质瘤SHG-44细胞株照射存活后代增殖的影响,探讨对乙酰氨基酚作为复发性恶性脑胶质瘤放射治疗增敏剂的可能性.方法 培养人脑胶质瘤SHG-44细胞株经6 MV X线DT10 Gy照射后的存活后代细胞(SHG-44-10细胞),测定其群体倍增时间;在培养SHG-44-10细胞中加入对乙酰氨基酚,进行集落形成实验和流式细胞仪检测,分析其放射敏感性和细胞周期的变化.结果 与SHG-44细胞相比较,SHG-44照射后代细胞克隆形成率降低,倍增时间延长,对放射的敏感性明显降低.而加入对乙酰氨基酚培养后,SHG-44照射后代细胞对放射的敏感性可增加.SHG-44照射后代细胞再次照射后12 h,G2/M相细胞比例增高,24 h比例下降,而加入对乙酰氨基酚培养后G2/M相细胞12 h、24 h均维持较高的比例.结论 (1)SHG-44细胞照射后存活后代细胞增殖延缓,放射敏感性下降.(2)小剂量对乙酰氨基酚可提高SHG-44细胞照射后存活后代细胞的放射敏感性,其可能的机制为诱导细胞阻滞在对放射敏感的G2/M期并能诱导它的凋亡.(3)对乙酰氨基酚有可能成为治疗复发性脑胶质瘤的放射增敏剂.     

诺帝对人恶性胶质瘤细胞甲酰化肽受体表达及其活化后促增殖和血管生成因子产生的影响

目的观测自行研制的脂氧化酶抑制剂诺帝（Nordy）对人恶性胶质瘤细胞系U87中甲酰化肽受体（FPR）的表达和激活后功能活性的影响。方法采用间接免疫荧光标记、激光共聚焦扫描显微术观测诺帝对U87系人恶性胶质瘤细胞FPR表达的影响;FPR激动剂N-甲酰化的甲硫酰-亮氨酸-苯丙氨酰胺（fMLF）激活FPR后加入诺帝,实验分为以下3组：①对照组,②fMLF刺激组,③诺帝处理组,分别采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）和双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测诺帝对FPR活化后引起的细胞增殖及细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）和白细胞介素8（IL-8）的作用。结果诺帝（100μmol／L）明显抑制U87细胞FPR受体的表达,同时对FPR激动剂fMLF（100nmol／L）诱导的U87细胞增殖和血管生成因子VEGF、IL-8 mRNA表达和蛋白的分泌具有明显的抑制作用。对照组U87细胞分泌一定量的VEGF和IL-8,分别为（4．14±0．28）ng／ml和（4．03±0．59）ng／ml;fMLF作用于U87细胞36h后,VEGF和IL-8蛋白水平均显著高于对照组（P〈0．05）,分别为（6．46±0．33）ng／ml和（7．54±0．73）ng／ml;诺帝作用于U87细胞12h后加入fMLF共同处理36h后,VEGF和IL-8蛋白水平分别为（3．59±0．33）ng／ml和（3．13±0．48）ng／ml,均显著低于对照组（P〈0．05）。结论诺帝对人恶性胶质瘤细胞的FPR表达和该受体活化后的促瘤细胞增殖及促血管生成因子VEGF、IL-8 mRNA表达和蛋白的分泌具有抑制作用,提示诺帝具有抑制肿瘤生长和抗血管生成的作用。     

补肾活血方对大鼠心脏成纤维细胞增殖及胶原表达的影响

摘要：目的探讨补肾活血方对大鼠成纤维细胞增殖及胶原表达的影响,为其抗心肌纤维化提供实验依据。方法通过血清药理
学方法制备补肾活血方含药血清,与DMEM配成细胞培养液。提取大鼠心脏成纤维细胞（CFs）并传代培养,将3~4代CFs分为
4组：A组为10%含药血清培养液培养,B组为20%含药血清培养液培养,C组为不含药血清培养液培养,D组为对照组,为常规胎
牛血清培养液培养。培养72 h后CCK-8检测CFs增殖,RT-PCR检测胶原基因表达,Western blotting检测胶原蛋白表达。结果
与C组、D组相比,A组、B组CFs增殖明显降低,B组较A组进一步降低（P<0.05）;Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA在A、B两组表达较C、
D两组明显下调（P<0.05）,Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达在A、B两组明显低于C、D两组（P<0.05）。结论补肾活血方可以抑制大鼠
成纤维细胞增殖及胶原表达。
     

大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的 探讨建立大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧损伤模型的一种新方法. 方法 本实验使用大鼠NRK-52E细胞.实验分为对照组和实验组,实验组分为缺氧2,4,6 h及缺氧后复氧1,12和24 h组.缺氧时换用缺氧液,再置入N294% O2 1% CO2 5%缺氧环境;缺氧后换用含10%胎牛血清的EMDM/F12,置入95%空气 CO2 5%有氧环境,制作缺氧/复氧模型;台盼蓝摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量. 结果 大鼠肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,与对照组相比,台盼蓝摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 采用三气孵箱法建立大鼠.肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法 操作简单、易行、可靠.     

碱性成纤维细胞生长因子对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用研究

目的 :观察碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用。方法 :实验分为两组 ,即加入浓度 2 0ng·ml-1bFGF的bFGF组及不加bFGF的对照组。采用Pepper等介绍的三维培养胶原基质配制及细胞培养方法制作标本 ,透射电子显微镜下观察结果。 结果 :对照组内皮细胞在胶的表面呈单层生长 ,未见其向深层生长及管腔结构形成。bFGF组内皮细胞在胶内呈多层浸润生长 ,伸展、变形呈扁平状 ;内皮细胞与胶原纤维之间可见半桥粒结构 ,内皮细胞之间以桥粒连接 ,形成毛细血管样管腔结构 ;在形成管状结构的内皮细胞中可见空泡样变 ,边界由胞质与胞膜组成 ,细胞核变形 ,凹陷 ,可见切迹 ,或呈薄片状 ;内皮细胞游离面有微绒毛突起。结论 :三维培养技术简单易行 ,是揭示在体血管形成的最简单模型 ;bFGF有利于三维培养内皮细胞在有展性的胶原基质面形成血管样结构。     

福莫司汀对人脑胶质瘤细胞株U251细胞周期的影响

目的:观察福莫司汀(Fotemustine)对人脑胶质瘤细胞株U251细胞增殖的影响。方法:通过体外培养的人脑胶质瘤细胞株U251,用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测福莫司汀诱导胶质瘤细胞凋亡及其增殖周期的分布;与对照组比较,并进行统计学处理。结果:Fotemustine诱导后,细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);诱导后细胞,G1期数量减少,而S期和G2期数量增多,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:Fotemustine可诱导人脑胶质瘤细胞株U251的凋亡;诱导细胞增殖周期分布的变化,有助于S期、G2期的化疗药物作用的发挥。     

人表皮生长因子对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察表皮生长因子(EGF)对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用体外培养的牛角膜内皮细胞,在培养液中分别添加不同浓度的人表皮生长因子(hEGF),加药后第3、7天采用MTT法,在酶标仪492nm波长处测定吸光度值观测细胞增殖,并记录细胞形态变化。将体外培养的牛角膜内皮细胞分为二组,常规DMEM培养液组和含50ng/mLEGF的DMEM培养液组,培养3、7天后,应用流式细胞仪检测细胞周期各阶段G1、S、G2期分布。结果与对照组相比,不同浓度EGF组对牛角膜内皮细胞增殖有促进作用且与浓度相关,其中10ng/mL和100ng/mL组作用强于1ng/mL组。EGF加入后3d,对照组S期细胞24.5%,G2-M期细胞0.08%,加药组S期细胞24.6%,G2-M期细胞0.06%。与对照组相比较,各期细胞分布大致相等,无显著差异。加入7d后对照组S期细胞20.8%,G2-M期细胞0.41%,加药组S期细胞18.2%,G2-M期细胞1.55%,细胞分布发生明显变化。结论EGF促进体外培养的牛角膜内皮细胞增殖,并使体外培养的牛角膜内皮细胞的细胞周期发生变化,S期细胞比例下降。     

SENP1、SENP2和SENP6蛋白在人恶性胶质瘤组织和细胞中的表达及其意义

目的：观察SUMO特异性蛋白酶（SENPs）家族成员SENP1、SENP2和SENP6在人恶性胶质瘤组织和细胞中的表达,阐明其在恶性胶质瘤发生中的作用。方法：取人脑正常组织和恶性胶质瘤组织样品分别作为正常对照组和恶性胶质瘤组;培养Cos7细胞和恶性胶质瘤LN443和U343细胞,Cos7细胞作为正常细胞对照组,LN443和U343作为恶性胶质瘤细胞组;采用Western blotting法检测SENP1、SENP2和SENP6蛋白在人恶性胶质瘤组织和细胞中的表达水平。结果：在脑组织中,与正常对照组比较,恶性胶质瘤组恶性胶质瘤组织中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。在细胞中,与正常细胞对照组比较,恶性胶质瘤细胞组LN443和U343细胞中SENP1、SENP2和SENP6蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。结论：SENP1、SENP2和SENP6在恶性胶质瘤组织和细胞中高表达,其可能对恶性胶质瘤的发生起到了重要的促进作用。     

内皮祖细胞在早期急性肾缺血再灌注损伤中的抗凋亡作用观察

目的:观察内皮祖细胞(EPC)移植对急性肾缺血再灌注损伤(IRI)早期的治疗作用及其对肾小管上皮细胞凋亡的影响,探讨其可能的肾脏保护机制.方法:大鼠骨髓单个核细胞体外定向诱导、扩增获取EPC并标记.SD大鼠随机分为3组:移植组进行急性肾缺血再灌注操作后行EPC移植;IRI组缺血再灌注后注入等量生理盐水;假手术组假手术后注入EPC.检测IRI后24、48 h 3组大鼠的肾功能,观察IRI后72 h 3组大鼠肾组织损伤、肾小管上皮细胞凋亡、EPC在肾组织中的归巢情况.结果:肾IRI后72 h,移植组肾脏皮髓交界处内可见少量CM-Dil阳性细胞.移植组大鼠较对照组肾功能明显改善(P<0.05),肾损伤明显减轻(P<0.01),肾小管上皮细胞凋亡明显减少(P<0.01),血管内皮生长因子(VEGF)表达水平显著升高(P<0.05).结论:骨髓源性EPC移植对急性肾IRI有治疗作用,其可能机制是通过减少肾小管上皮细胞凋亡来减轻IRI早期的肾损害.     

低氧对肾小管上皮细胞表达VEGF的影响

目的探讨低氧条件下对培养肾小管上皮细胞(HKCs)表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法在3%氧浓度下培养肾小管上皮细胞,用细胞生长曲线及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色试验研究细胞活力;用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况;分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法检测HKCs在正常和低氧条件下,VEGF mRNA及其蛋白质的表达.结果MTT比色试验较细胞生长曲线更敏感地检测出低氧对细胞代谢的影响,用TUNEL法可检测细胞凋亡率随低氧时间延长而增加,低氧条件下HKCs表达VEGF并无明显增高.结论低氧条件下,检测不到HKCs的VEGF表达增加,可能与低氧诱导HKCs凋亡和代谢率降低有关.