鸡胚颅面部整胚原位杂交的实验

目的：：探讨并优化鸡胚整胚原位杂交的实验,以利于研究鸡胚颅面部发育相关基因的表达。方法：体外转录制备地高辛标记的 RNA反义探针,进而采用整胚原位杂交方法检测鸡胚颅面部发育相关基因的表达。结果：地高辛标记的 RNA反义探针与体内 mRNA特异性结合,在显微镜下观察到 mRNA表达部位呈现深蓝色,背景颜色较浅为浅紫色,可在保持胚胎结构完整的情况下,清楚观察到相关基因的表达。结论：利用优化的整胚原位杂交技术,可保持鸡胚结构完整,染色清晰,直观清楚地看到基因的时空表达,为进一步研究颅面部发育相关基因的表达奠定了基础。     

神经生长导向因子Slit在鸡胚脊髓中的表达

目的：探讨神经生长导向因子S1it在鸡胚脊髓中的表达模式对发育和再生神经轴突的导向作用。方法：制备地高辛标记的RNA探针，应用原位杂交技术检测Slit基因mRNA在鸡胚不同发育期脊髓中的表达情况。结果：Shit基因mRNA的表达在中线结构区呈现优势。结论：神经生长导向因子Slit在鸡胚脊髓发育期轴突投射和神经通路形成中起重要作用。     

FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布

目的 观察凋亡相关基因FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布.方法 收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本,PHA-P激活单个核细胞诱导FasL表达,提取总RNA,RT-PCR制备FasL基因片段.定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒,体外转录制备Dig-FasL cRNA探针.cRNA探针原位杂交进行FasL mRNA表达分布的观察.结果 克隆化FasL序列经DNA测序准确无误,体外转录cRNA探针标记效果满意;胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞中可检测到FasL mRNA的较高杂交信号,成人突出椎间盘细胞中罕见正常细胞,未检出FasL mRNA信号.结论 FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达,细胞凋亡发生早.成年时期,细胞数急剧减少,代谢功能低下,无法检出凋亡基因表达.     

鸡胚心肌内移植入人干细胞的动物模型的建立

目的　建立人干细胞移植到鸡胚心肌中的动物模型。方法　通过显微注射的方法 ,将Hoechsst 332 5 8标记的人胚胎生殖嵴细胞 (humanprimordialgermcells ,hPGC)注射到孵化 3～ 4d的鸡胚心脏中 ,先运用人特异性的DNA探针对活鸡胚心脏切片进行原位杂交 ,以检测心肌中移植细胞的存在 ,再运用人心肌特异性抗体肌钙蛋白T(cTnT)对相邻的心肌切片进行免疫组织化学染色 ,以观察有无人心肌细胞分化 ,并统计移植成功率。结果　原位杂交显示 ,在术后 10d鸡胚的心肌中观察到有人的细胞 ,呈心肌纤维样并与鸡胚心肌细胞发生嵌合。免疫组织化学观察到鸡胚心肌中有人心肌特异性的标记物cTnT表达。移植成功率为 15 .3%± 2 .4 %。结论　在鸡胚的心肌内建立一个人干细胞移植的模型是可行的。     

LMO3 mRNA在小鼠脑发育过程中的表达

目的:研究不同发育时期小鼠脑内LMO3的表达.方法:采用以SYBR Green I为荧光染料的定量RT-PCR及以地高辛标记的cRNA为探针的原位杂交组织化学法检测LMO3基因在小鼠脑发育过程中的表达.结果:FQ RT-PCR结果表明,LMO3在出生前高表达,P7d后表达水平急剧下降,至成年都维持在一个较低的水平. LMO3 mRNA在小鼠胚胎期E10.5d即有表达,但仅限于整个脑泡组织内,胚体其他区域均为阴性;E11.5d脑区信号逐渐加强,无核团及脑区的特异性,胚体其他部分仍为阴性;E15.5～P0d期LMO3阳性信号在几乎所有观察的脑区均有广泛而较强的着色;P7d LMO3阳性信号较出生前变弱,分布逐渐集中;P14～P60d LMO3 mRNA表达范围较P7d逐渐缩小,但仍有广泛表达,阳性信号主要集中于不同核团,表达有强弱之分.结论:LMO3基因可能与小鼠出生前脑的发育以及出生后特定脑区神经元的特化及特性维持有关.     

体外转录法制备地高辛标记cx43cRNA探针

原位杂交常用探针种类较多。检测组织细胞中mRNA，首选cRNA探针。与DNA探针不同，它是单链探针，杂交时无需变性，也没有互补链的干扰，敏感度比cDNA探针要高；与寡脱氧核酸探针比较，其敏感度也要高出许多；并且cRNA探针杂交形成RNA-RNA双链核酸比RNA-DNA和DNA-DNA双链核酸更稳定，从而允许多次洗涤，提高杂交信号，降低背景染色。但也有一些缺点，探针要求条件高，严防RNA酶污染；粘性强，与组织有较高的非特异性结合，需要多次漂洗。用地高辛标记cRNA探针，既克服了同位素探针的一些缺点，如受半衰期的限制，污物处理困难等．又避免了生物素标记探针时受内源性生物素的干扰。所以我们制备地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测宫颈组织中的connexin43(CX43)mRNA。     

经典H-2分子mRNA探针的制备及在C57小鼠中枢神经系统原位杂交中的应用

目的:研究经典H-2基因在C57小鼠中枢神经系统中的表达谱,设计合成地高辛标记的经典H-2 mRNA探针.方法:利用PCR扩增出针对经典H-2分子的特异性保守片段,然后将PCR产物纯化后与pGEM-T Easy载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中.测序后获得目的基因的单克隆,扩增并提取质粒,采用体外转录的方法合成地高辛标记的经典H-2 mRNA的正、反义RNA探针.运用原位杂交方法分析经典H-2基因在C57小鼠中枢神经系统中的表达情况.结果:成功构建了321 bp经典H-2 mRNA的正、反义探针,原位杂交方法检测到经典H-2 mRNA在出生后15 d小鼠中枢神经系统中反义探针有杂交信号,正义探针无杂交信号.结论:正义探针无杂交信号表明合成的321 bp经典H-2 mRNA反义探针具有特异性.     

神经生长导向因子Slit及其受体Roundabout在人胚胎脊髓的表达

在神经系统的生长发育和损伤后再生修复的过程中,神经生长导向因子起着关键的调节作用。Slit是近年来研究发现的第一种对轴突生长和神经元胞体迁移都具有导向作用的因子．其受体是一个叫Roundabout(Robo)的跨膜蛋白。对大鼠,果蝇。鸡的研究资料表明．Slit蛋白能排斥运动神经元轴突．还可以促进感觉神经元神经纤维的分支形成。深入进行该基因及其受体在高等哺乳动物——发育期人胚胎中枢神经系统中表达的研究具有重要意义．但迄今国内外均未见报道。本实验采用地高辛标记的cRNA探针的原位杂交方法检测Slit mRNA和Robo mRNA在来源于自然流产的人胚胎不同发育期脊髓中的表达情况．以探讨其表达模式对人类神经轴突生长的导向作用。     

兔输卵管内皮素-1 mRNA阳性表达细胞的分布

为了探明内皮素－1在兔输卵管组织细胞中的来源,本文采用地高辛精标记ET－1 cRNA探针核酸原位杂交法对兔输卵管内皮素－1mRNA阳性表达细胞的分布进行了研究。结果显示,输卵管粘膜上皮细胞浆内可见ET－1mRNA阳性杂交信号,呈深蓝色,阳性杂交信号强且密集,该阳性杂交信号主要分布在细胞核的上方,靠近游离面。     

命运分子cNumb在原肠期胚胎的表达及其生物信息学分析

目的 探讨命运分子cNumb在原肠期胚胎中的表达情况及其基因和编码蛋白的基本生物学特征.方法 利用原位杂交技术检测cNumb基因在原肠期鸡胚中的表达情况,同时应用生物学软件和在线平台对cNumb基因及其编码蛋白进行生物信息学分析.结果 cNumb mRNA在鸡胚4期开始表达于原条顶端,随发育过程逐渐扩展至亨氏节、头突和神经管,但表达区域仍相对集中.Numb基因在不同物种中具有较高保守性,cNumb编码的蛋白属于胞内蛋白,包含磷酸酪氨酸相互作用结构域和多个潜在磷酸化位点,可参与调节多种细胞生物学过程.结论 通过生物信息学分析获得了cNumb基因及其蛋白的生物学特征,为进一步研究Numb在胚胎神经发育中的调控机制奠定了基础.     

铝对大鼠黑质酪氨酸羟化酶mRNA表达的影响

为了探讨铝对中枢神经系统多巴胺能神经元的影响,采用地高辛标记酪氨酸羟化酶（TH）反义RNA探针原位杂交组织化学方法,观察了氯化铝对大鼠黑质THmRNA表达的影响。结果发现,大鼠服用氯化铝3个月后,黑质背侧部多巴胺神经元THmRNA杂交信号弱于对照组,表明氯化铝对大鼠黑质THmRNA表达有抑制作用。     

针刺对神经营养素3在脊髓可塑性中表达的影响

目的：探讨针刺对神经营养素3（NT3）在脊髓可塑性中表达的影响。方法：用NT3抗血清和NT3 cRNA探针，以免疫组化和原位杂交技术观察针刺前后备用背根节及脊髓Ⅱ板层中NT3表达的变化。结果：针刺侧备用背根节（DRG）NT3及其mRNA阳性大神经元（＞57um)和小神经元（P＜42um)百分数均较非针刺侧者明显增多（P＜0．05），此外，脊髓针刺侧Ⅱ板层NT3阳性神经元及胶质细胞百分数针刺侧亦较非针刺侧明显增多（P＜0．05），但两侧均未见NT3 mRNA的杂交信号。结论：针刺促进脊髓可塑性可能与DRG大，小神经元表达NT3和脊髓Ⅱ板层NT3阳性神经元和胶质细胞百分数的增多有关。     

多疣壁虎Fstl1基因表达及其在断尾损伤中的变化

目的：研究多疣壁虎卵泡抑制素相似蛋白1（Fstl1）基因的表达及其在壁虎断尾损伤再生中的变化。方法：通过对多疣壁虎断尾损伤cDNA文库克隆测序获得Fstl1基因序列,并采用ClustalX软件比较GenBank同源蛋白进行系统进化分析。用Northern blot与原位杂交分析多疣壁虎Fstl1转录本大小及其在脊髓中的表达定位。通过RT-PCR方法研究Fstl1基因在壁虎主要组织中的表达分布与壁虎断尾损伤模型中变化。结果：基因系统进化分析表明,多疣壁虎Fstl1与人类Fstl1同源性较高,为96.5%;与爪蟾同源性较低,为62.9%。Northen blot分析表明,成年多疣壁虎Fstl1脊髓转录本大小约为3.7kb。原位杂交结果显示,多疣壁虎脊髓中Fstl1的阳性信号主要存在于灰质神经元细胞及室管膜细胞;而在断尾再生2～3周尾芽中,Fstl1阳性信号广泛存在于再生尾芽的新生区未分化细胞及间充质细胞,3周尾芽中,阳性信号还存在于软骨生成区。RT-PCR结果显示,多疣壁虎Fstl1基因在壁虎脑、脊髓、心、肝、肺、肾、卵巢、尾巴、肌肉中均有表达,其在脊髓中呈高表达。在断尾损伤模型中,多疣壁虎Fstl1表达呈动态变化,其在近端脊髓组织中,损伤3天时Fstl1转录表达增高,并随后开始下降恢复;在断尾再生尾芽中,3周时Fstl1转录表达低于2周表达量。结论：Fstl1基因主要分布于脊髓灰质神经元细胞中,Fstl1在壁虎断尾损伤后近端脊髓的表达呈动态变化,在再生尾芽表达3周下调。     

Nogo-A mRNA在大鼠神经组织中的表达和定位

目的：观察Nogo-A mRNA在脑,脊髓,视神经,坐骨神经的表达和细胞定位。方法：采用原位杂交技术观察8只正常Wistar大鼠脑,脊髓,视神经,坐骨神经中Nogo-A mRNA的表达和定位,结果：8只大鼠脑,脊髓,视神经切片中Nogo-A mRNA均表面阳,是性信号位于胞浆,胞核不着色,8只大鼠坐骨神经切片中均表达阴性。结论：在大鼠中枢神经如脑,脊髓,视神经中Nogo-A mRNA广泛分布,而在周围神经坐骨神经则无Nogo-A mRNA表达,提示Nogo-A mRNA阳性表达及分布与中枢神经系统再生功能低下密切相关。     

脑源性神经营养因子mRNA在胚胎脊髓修复成鼠脊髓损伤过程中的变化

观察脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）在胚胎脊髓修复成鼠损伤脊髓过程中的变化。方法将妊娠１４天胚胎脊髓植入急性损伤的成体脊髓后１、３、５、７、１０、１５和３０天，用原位和斑点分子杂交技术对胚胎脊髓和正常脊髓内ＢＤＮＦｍＲＮＡ的表达变化作了定性和定量观察。结果在正常脊髓内，ＢＤＮＦｍＲＮＡ以前角运动神经元和少量胶质细胞分布为主；脊髓损伤后，杂交产物扩大到中小型神经元，同时更多的胶质细胞参与了反应；胚胎脊髓移植后，除移植物本身继续维持表达外，正常脊髓阳性反应神经元和胶质细胞数量进一步增加。损伤组原位和斑点分子杂交的反应强度明显高于正常组，而移植组的分子杂交反应又在很多时相点上显著高于损伤组。结论移植的胚胎脊髓除为自身和宿主脊髓提供神经营养外，也诱发了正常脊髓在发生过程中曾经拥有的合成机制，以增强神经营养因子表达的方式为自身的再生提供营养，同时也为移植物的发育分化提供合适的营养环境。     

脊髓损伤后毛细血管新生与血管内皮生长因子mRNA的表达

目的探讨脊髓损伤后毛细血管新生与血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达。方法采用改良Allen＇s重量打击法大鼠急性脊髓损伤模型,用马松三色染色法观察脊髓损伤后毛细血管的新生情况,原位杂交法观察急性损伤后大鼠脊髓VEGF mRNA表达的动态变化。结果脊髓损伤后引起脊髓组织中血管密度和血管分布改变,脊髓急性损伤后损伤局部出现短暂的血管新生过程。同时,原位杂交结果显示VEGFmRNA的表达上调,表达时间与血管变化的时间重叠。除了时间上的相互关联外,脊髓损伤后毛细血管新生与VEGF mRNA的表达在空间分布上是一致的。结论脊髓急性损伤可上调VEGFmRNA在脊髓血管内皮细胞、胶质细胞和巨噬细胞内的表达,有短暂的血管新生过程,损伤组织中VEGFmRNA的表达与其毛细血管新生的调节密切相关。     

睫状神经营养因子对大鼠脊髓损伤后GFAP表达的影响

目的 研究磊鼠脊髓损伤后睫状神经营养因子（ＣＮＴＦ）是否能够影响胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）的表达和脊髓损伤后大鼠功能的恢复情况。方法 将动物分为脊髓 务＋ＣＮＴＦ注射组（Ａ组）、脊髓损伤＋灭活的ＣＮＴＦ注射组（Ｂ组）。手术后１、３、７、１４、２８ｄ应用原位杂交和免疫细胞化学方法观察ＧＦＡＰ的表达,彩和计算机图像分析蜓一量分析,并用行为学和电生理检查观察大鼠功能恢复情况。结果 大鼠脊髓 务后ＧＦＡ     

应用原位杂交技术分析ZNF216基因在成年小鼠各主要组织中的表达模式

目的：获得ZNF216基因的表达模式。方法：体外转录方法合成地高辛标记的CRNA探针,利用原位杂交技术检测ZNF216基因在成年小鼠各主要组织中的表达模式。结果：在小鼠脑、心脏、骨骼肌和睾丸细胞内可检测到很强的ZNF216的杂交信号,在肾脏细胞内也可检测到杂交信号,但在脾脏和肝脏细胞内仅检测到少许杂交信号和未能检测到杂交信号。结论：ZNF16基因表达于几种组织细胞内,具有一定的组织特异性。     

多疣壁虎血管活性肠肽基因的克隆及表达

目的:克隆多疣壁虎血管活性肠肽(VIP)的cDNA全长序列,研究VIP在正常壁虎各组织中的表达及断尾损伤后脊髓再生过程中的表达变化。方法:通过对多疣壁虎断尾损伤cDNA文库克隆测序获得VIP基因序列。通过Northern blot验证VIP转录本的大小,通过原位杂交检测VIP mRNA在正常壁虎脊髓中的分布。制备壁虎断尾损伤模型,通过采用Real time-PCR和原位杂交的方法检测VIP mRNA在壁虎损伤模型断端近侧脊髓中的表达变化。结果:VIP mRNA全长1933 bp,编码156个氨基酸的前原蛋白。编码的成熟肽与其他物种的同源性约为82.1%。RT-PCR和Northern blot显示VIP在正常壁虎组织中广泛表达,且通过Northern blot发现正常壁虎体内只一个转录本,大小约1.9kb。原位杂交结果显示VIP阳性信号主要分布于脊髓灰质中,白质中仅有少量表达。Real-time PCR和原位杂交结果表明断尾损伤后的近端脊髓组织中VIP表达呈动态变化。结论:获得壁虎VIP全长mRNA序列的基本特征及其多组织表达图谱。VIP在壁虎的脊髓中主要分布于灰质中,壁虎在断尾损伤后近端脊髓VIP的表达呈动态变化。