小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的一些因素，以建立稳定的MEF培养体系。方法 取BALB／c小鼠胚胎分离成纤维细胞，利用体外培养体系，对MEF的生长形态，生长曲线及细胞周期进行观察，并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究。结果 13.5d胎龄鼠胚的MEF分离效果优于10.5d,18.5d胎龄鼠胚；MEF在体外为贴壁生长型细胞，第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下，0.25%胰酶消化MEF时间以3－5min为宜。结论 MEF在第3代增殖旺盛，最适宜作胚胎干细胞的饲养层。     

HCMV体外感染小鼠胚胎成纤维细胞的研究

目的 观察人巨细胞病毒(HCMV)AD169株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的生物学特征,为探讨HCMV AD169株能跨种属感染MEF提供依据.方法 将100 TCID50 HCMV AD169株病毒悬液接种至MEF和人胚胎成纤维细胞(HF)上,逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE);分别收集感染后1、3、5 d 的MEF和HF培养物,提取细胞DNA,采用实时荧光定量PCR检测HCMV立即早期基因(IE)拷贝数变化;分别采用HCMV立即早期基因(IE-1)、主要衣壳蛋白(MCP)和包膜糖蛋白(gB)单克隆抗体进行间接免疫荧光实验检测感染后的1、3、5 d MEF和HF中相应病毒蛋白的表达.结果 观察到HCMV AD169株接种MEF出现病毒所致CPE,与HF出现的CPE相似;实时荧光定量PCR检测HCMV IE基因拷贝数发现,MEF在HCMV AD169感染后的1、3、5 d,病毒基因拷贝数呈增长趋势,但均低于相同时间点的HF中病毒拷贝数;间接免疫荧光检测HCMV感染MEF和HF后1、3、5 d HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达情况时发现,在MEF上HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达随时间延长呈增强趋势.结论 HCMV AD169株可以体外感染MEF,并在其中复制增殖.     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制

目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系，用于分离和克隆胚胎干细胞研究。方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞，观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响，以及丝裂霉素C对细胞增殖的抑制作用；细胞增殖的数量用MTT法测定。结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12．5—14．5d；20℃-25℃时，用0．25％胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min；可在培养3—6d后进行传代。细胞冻存于-80℃3-4个月，复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg/10^5细胞，作用2-4h，可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d内不增殖也不死亡。结论 在合适条件下，小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养，并能多次传代和冻存；经丝裂霉素C处理后增殖受抑制，可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。     

丝素蛋白材料细胞相容性的研究

目的：研究再生丝素膜对大鼠真皮细胞生长和细胞遗传学的影响。方法：采用静置贴壁培养法在再生丝素膜上培养大鼠真皮细胞，并用活细胞计数法和常规染色体检测技术，观察再生丝素膜对细胞生长和染色体的影响。结果 再生丝素膜能支持细胞正常生长，呈现正常的生长繁殖曲线且染色体的形态和数目正常。结论 再生丝素膜对大鼠真皮细胞具有良好的细胞相容性。     

γ射线对ICR小鼠胚胎成纤维细胞的抑制作用研究

目的建立安全有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层体系,用于人胚胎干细胞的培养和研究。方法取ICR小鼠胚胎制备原代成纤维细胞,观察不同剂量的γ射线对成纤维细胞的抑制作用,用流式细胞仪分析MEF细胞周期的改变,用MTT测定细胞的数量。结果在30Gy剂量的γ射线条件下,能有效地抑制小鼠胚胎成纤维细胞的分裂,且不影响其活力。结论在合适剂量的Y射线照射下,能安全有效的抑制MEF的有丝分裂,为人胚胎干细胞的研究奠定基础。     

丝素蛋白作为生物材料的基础研究

研究丝素蛋白作为动物细胞生长基质和生物材料对于细胞生长的促进作用,探索丝素薄膜性能的进一步优化。通过细胞计数和噻唑蓝(MTT)法实验表明,丝素薄膜上猪髋动脉内皮细胞生长的密度是普通细胞培养基质上的242.01%,细胞在薄膜上的贴壁率为在普通基质上的238%。经由酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)处理后,薄膜上的细胞生长密度是未经处理薄膜上的115.98%,细胞的贴壁率为在普通细胞培养基质上的269%。因此,丝素蛋白薄膜可作为动物细胞生长基质,经aFGF处理的薄膜显示更优越的细胞亲和性。     

纳米羟基磷灰石膜复合材料与小鼠成纤维细胞的相容性

目的探讨纳米羟基磷灰石膜聚氨酯复合材料(nano-Hydroxyapatite/ polyurethane,nHA/PU) 与小鼠成纤维细胞（L929）的生物相容性[1]。方法 将小鼠成纤维细胞与纳米羟基磷灰石膜聚氨酯复合材料体外复合培养,并设单独细胞培养的阴性对照和细胞与传统材料复合培养的对照组,倒置相差显微镜、扫描电镜行形态学观察,计数接种后的黏附情况,流式细胞仪分析接种到材料上的细胞的生长周期,CCK-8法[2]检测材料对细胞增殖影响。结果 小鼠成纤维细胞在纳米羟基磷灰石膜聚氨酯复合材料上良好的黏附、生长、增殖,流式细胞仪分析接种到材料上的细胞,其细胞周期与空白对照组和传统对照对比差异均无显著统计学（P>0.05）,CCK-8检测显示材料对细胞增殖的影响小于传统材料。结论 纳米羟基磷灰石膜聚氨酯复合材料具有良好的细胞相容性,可望作为组织工程人工肛门括约肌的外层套囊材料。     

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

目的：建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳分离培养及丝裂霉素C(MMC)处理的方法,用于培养胚胎干细胞。方法：取不同胎龄的胎鼠分离原代成纤维细胞,观察不同胎龄和培养、分离条件对细胞增殖的影响;观察不同浓度和不同作用时间下MMC对细胞增殖的抑制作用。用MTT法测定细胞增殖的数量。取妊娠3．5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果：制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄是12．5～14．5d：室温条件下,0．25％胰蛋白酶消化时间最好在3～5min之内：原代细胞培养2～4d后即可传代,MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是20μg/ml,2～4h,成纤维细胞饲养层可以维持10d。囊胚在饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。结论：从12．5～14．5d胎龄小鼠胚胎分离培养的胚胎成纤维细胞质量最佳,经20μg／ml MMC处理2～4h后,可以作为饲养层用于胚胎干细胞的分离克隆。     

丝素蛋白与丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料体外细胞相容性的比较

目的探讨丝素蛋白（SF）与丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料（SF/HA）的体外细胞相容性,为组织工程提供理想的生物支架材料。方法将小鼠的骨髓间充质干细胞（C3H10T1/2）接种于上述两种生物材料上,运用四唑盐比色试验（MTT法）检测细胞的增殖能力,利用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在材料上的生长形态。结果 C3H10T1/2在SF与SF/HA上都能很好地黏附、生长和增殖。SF、SF/HA和C3H10T1/2都有良好的细胞相容性。结论 3%SF、6%SF、600%SF/HA3组多孔材料的体外细胞相容性最好。     

再生柞蚕丝素蛋白对小鼠间充质干细胞体外生长的支持作用

目的探讨再生柞蚕丝素蛋白对小鼠间充质干细胞体外生长和分化的支持作用。方法采用再生家蚕丝素蛋白、再生柞蚕丝素蛋白、I型胶原、普通细胞培养板为研究对象,观察小鼠间充质干细胞（C3H10T1/2）在这4种生物材料上的黏附、生长及表面抗原的变化。利用光学显微镜观察细胞生长形态,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞仪测定细胞表型。结果再生柞蚕丝素蛋白对细胞生长形态、细胞表面抗原表达均无影响。培养第6天C3H10T1/2细胞在再生柞蚕丝素膜上增殖明显,与其他3种生物材料的差异有统计学意义（P〈0.05）。结论再生柞蚕丝素蛋白在体外支持C3H10T1/2细胞的黏附、生长,具有很好的组织相容性。     

HA-P软腭植入材料的研制及细胞毒性检测

目的:研制一种新的治疗鼾症的软腭植入系统微创手术的生物材料并于体外检测其细胞毒性,探讨将其应用于软腭植入系统的可能性.方法:将羟基磷灰石颗粒(HA)、聚乳酸-三亚甲基碳酸酯P(LATMC)按一定比例复合,利用有机溶剂注模法,制备重组软腭植入材料;并采用MTT检测法,将不同浓度的HA-P浸提液与MH-3T3成纤维细胞接触1、3、5 d,检测细胞的增殖活性,计算细胞的相对增殖度,用6级毒性法进行评级.结果:研制不同浓度的HA-P材料浸提液在不同的时间点培养的细胞均正常增殖(P＞0.05),毒性级别为0～1级.结论:研制的HA-P材料具有良好的细胞相容性,可能是一种良好的软腭植入系统材料.     

鹅细小病毒VP3蛋白抗血清的制备及在鸭胚和鸭胚成纤维细胞中的增殖研究

目的 制备鹅细小病毒(GPV) VP3衣壳蛋白的兔抗血清,在绍兴麻鸭鸭胚及其成纤维细胞中成功增殖GPV.方法 根据GPVH分离株的VP3基因序列构建原核表达载体pET3a-VP3,诱导纯化VP3蛋白,皮下注射免疫新西兰白兔,收集和纯化VP3抗血清,经Western blotting检测VP3抗血清与VP3蛋白的反应性.GPV H株鹅胚尿囊液接种SPF绍兴麻鸭胚和其成纤维细胞,通过PCR反应和间接免疫荧光方法,检测GPV在鸭胚及其成纤维细胞中的增殖.结果 成功制备了VP3的兔抗血清,同时GPV在鸭胚及其成纤维细胞中进行良好增殖.结论 VP3抗血清的制备及GPV在绍兴麻鸭鸭胚及成纤维细胞中的增殖实验为GPV分子生物学特性及致病机制的研究奠定基础.     

C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

Effect of Patient Age and Embryo Parameters on Pregnancy Outcome in In Vitro Fertilization-Embryo Transfer （IVF-ET）

Objective To study the effect of patient age, the number and quality of embryos transferred on pregnancy outcome in in vitro fertilization-embryo transfer procedures （IVF-ETs）. Methods A retrospective study was conducted with infertile women who underwent a total of 1 800 cycles of lVF-ET and intracytoplasmic sperm injection （ICSI） at the Reproductive Medicine Center of the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College from Jan. 2006 to Dec. 2007. The patients were divided into three groups based on age （year）. 〈30, 30-34 and 235. The rates of clinical pregnancy and multiple pregnancies were compared in each group when 1-3 embryos and 0-3 goodquality embryos were transferred respectively. Results 1） In the group of patients aged 〈30 years, there was no significant difference in pregnancy outcomes with 1-3 embryos transferred. However, pregnancy rates were similar when 2 3 good-quality embryos were transferred, which was significantly higher compared with 0-1 good-quality embryos transferred; the incidence of multiple pregnancies was not an issue when only 1 embryo was transferred. 2） The pregnancy rate of the patients aged 30 34 was not significant not only when only 2-3 embryos were transferred but also when 2-3 good-quality embryos were transferred, which was significant compared with when 1 embryo or 0 1 good-quality embryo was transferred. The subgroup of 3 good-quality embryos transferred, at the same time, was expected to significantly increase multiple pregnancy rate. 3） For the patients aged 235, there were similar pregnancy rates in the subgroup involving 1-3 embryos transferred. Compared with 0-2 good-quality embryos transferred, the pregnancy rate was significantly higher in the patients with 3 good-quality embryos transferred. An increased trend toward multiple pregnancies was observed among not only the subgroups with 1-3 embryos transferred, but also when 1-3 good-quality embryos were transferred, although it was significantly higher in patients with 3 good-quality embryo transferred. Conclusion In an effort to achieve the ideal pregnancy rate without the risk of multiple pregnancies, it is desirable to employ a single good-quality embryo transfer for patients aged 〈30 years and 2 good-quality embryos for patients aged 330. As older women （aged 335 years）, this is important, need to abstain from poor-quality embryo transferred by increasing the number of embryos transferred in an effort to improve the rate of clinical pregnancy, if the patients have had enough 2 high-quality embryos.     

As_2O_3对体外培养胚胎致畸作用时效关系研究

本实验采用ＷＥＣ技术（ｗｈｏｌｅｅｍｂｒｙｏｃｕｌｔｕｒｅ，全胚胎培养）探讨了Ａｓ２Ｏ３不同时间对大鼠胚胎的致畸作用，染毒剂量为３．０μｇ／ｍｌ。结果表明：作用６ｈ、１６ｈ对胚胎的生长发育和器官形态分化无明显影响；作用２６ｈ，反映胚胎生长发育和器官形态分化各指标伍均明显降低（Ｐ＜０．０５），４１．７％的胚胎出现畸形；作用４８ｈ，改变更加明显，畸胎率达１００％；畸形主要表现为前肢芽小或无、前后神经管未闭、无耳泡等。电镜观察可见ＶＹＳ（脏层卵黄囊）上皮细胞顶端微绒毛变短、排列不规则和数量减少、线粒体肿胀、溶酶体数量减少等改变，提示ＶＹＳ超级结构的改变可能与砷的致畸机制有关。     

聚丙烯网片非感染状态下生物相容性的病理及超微结构研究

目的:观察非感染状态下医用聚丙烯网片在动物体内1～6个月生物相容性的病理改变及超微结构变化.方法:在6只清洁级新西兰家兔腹部皮下植入10 mm ×40 mm的医用聚丙烯网片各10条,共计60条;按随机数字表分为3组,分别于术后30 d(A组)、90 d(B组)及180 d(C组)取出网片及同周围组织,以家兔假手术部位的...     

兔骺软骨细胞体外培养及其甲状腺素T_3诱导转化

目的 :探讨兔骺软骨细胞体外培养的方法、条件及甲状腺素 T3 诱导其转化的可行性。方法 :借鉴软骨细胞培养法进行兔骺软骨细胞体外培养 ,利用 T3 使其在体外发生转化 ,采用组织学、电镜、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况。结果 :兔骺软骨细胞生长良好 ,合成了大量的软骨基质 ,同时也证实了 T3 可以诱导骺软骨细胞体外转化。结论 :兔骺软骨细胞可以体外培养 ,甲状腺素具有体外诱导转化作用     

归芎药对对小鼠离体子宫收缩活动的影响

目的观察归芎药对不同配比、不同提取方法对小鼠离体子宫平滑肌收缩活动的影响,并探讨当归与川芎的配对组合规律。方法采用3种方法分别提取7个不同配比的归芎药对;应用小鼠离体子宫收缩模型评价它们对小鼠离体子宫收缩活动的影响。结果50%醇提、先水提再醇提方法和当归-川芎(1.5∶1、1∶1)配比药对对小鼠离体子宫收缩活动的影响较为显著。结论不同配比、不同提取方法的归芎药对对小鼠离体子宫平滑肌收缩效应的影响强度不同,其产生作用变化的物质基础有待进一步的研究。