信号传导通路与肿瘤侵袭和转移机制的研究进展

侵袭和转移是恶性肿瘤的生物学特性之一,涉及癌基因和抑癌基因的激活或失活,许多癌基因和抑癌基因位于不同信号传导通路的不同部位,对肿瘤的发生、发展、侵袭和转移具有重要的作用.JAK-STAT、MAPK、Wnt、Notch信号传导通路与肿瘤侵袭转移的分子机制具有密切的关系.因此,深入研究信号传导通路与肿瘤侵袭和转移的机制必将为肿瘤靶向性基因治疗提供新的分子靶点和途径.     

三阴性乳腺癌发生机制的信号传导通路

三阴性乳腺癌(TNBC)具有易转移与侵袭等特点，预后差，目前以化疗为主。TNBC的发生与多种信号通路有关，信号通路的激活参与了肿瘤发生、发展、侵袭和转移等多个环节。准确识别TNBC靶向治疗的有效靶点是临床科研中亟待解决的问题。因此，研究TNBC相关的信号通路对提高患者生存率具有重要意义。笔者着重介绍几种与TNBC发生机制相关的主要信号传导通路。     

pcDNA3．1-asHpa对高转移性人乳腺癌细胞系侵袭力和黏附力的影响

目的：探索pcDNA3．1-asHpa对高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S侵袭力和黏附力的作用。方法：以质粒pcDNA3．1为载体，将乙酰肝素酶信号密码的DNA片段反向插入得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体(pcDNA3．1-asHpa)，以脂质体共转染人乳腺癌细胞MDA-MB-435S，以Boyden侵袭小室实验检测癌细胞侵袭力的变化，以细胞贴壁能力的变化检测其黏附力的变化。结果：与正常对照组(侵袭率为54．3%，贴壁细胞数为22.91视野)及空载体转染组(侵袭率为47．6％，贴壁细胞数为19．17视野)相比，经pcDNA3．1-asHpa转染的细胞侵袭力(16．3%)受到一定的抑制，黏附力(贴壁细胞数为11．36视野)没有明显的变化。结论：pcDNA3．1-asHpa对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S的侵袭力有一定的抑制作用，对黏附力无显著影响。     

上皮钙黏着蛋白对人炎性乳腺癌细胞系生物学特性的影响

目的 研究上皮钙黏着蛋白（E-cadherin）对人炎性乳腺癌细胞系SUM149的生长、侵袭等生物学特性的影响。方法 应用脂质体法基因转染技术,将编码E-cadherin基因显性负调控突变体（H-2k^d-E-cadherin）质粒导入SUM149中,应用RT-PCR、流式细胞分析法筛选、鉴定出E-cadherin基因显性负调控突变体高表达的阳性克隆。观察转染前后人炎性乳腺癌细胞系SUM149生长、侵袭能力等特性的变化以及相关分子的改变。结果 RT-PCR及Western印迹法结果均显示,与对照组（未转染及空质粒组）相比,转染后高表达小鼠H-2k^d的阳性克隆细胞的内源性上皮钙黏着蛋白表达明显下调,其细胞生长速度增殖无明显变化,而体外侵袭能力分析显示其侵袭能力明显下降,进一步研究发现,基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-9在mRNA水平明显下调;明胶酶谱分析也显示,MMP-9明显下调。结论 在E-cadherin高表达的人炎性乳腺癌细胞系SUM149中,其表达的下调可明显抑制其侵袭能力。     

pcDNA3.1-asHpa对高转移性人乳腺癌细胞系侵袭力和黏附力的影响

目的探索pcDNA3.1asHpa对高转移性人乳腺癌细胞株MDA MB435S侵袭力和黏附力的作用。方法以质粒pcDNA3.1为载体,将乙酰肝素酶信号密码的DNA片段反向插入得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体(pcDNA3.1asHpa),以脂质体共转染人乳腺癌细胞MDA MB435S,以Boyden侵袭小室实验检测癌细胞侵袭力的变化,以细胞贴壁能力的变化检测其黏附力的变化。结果与正常对照组(侵袭率为54.3%,贴壁细胞数为22.91/视野)及空载体转染组(侵袭率为42.6%,贴壁细胞数为19.17/视野)相比,经pcDNA3.1asHpa转染的细胞侵袭力(16.3%)受到一定的抑制,黏附力(贴壁细胞数为21.36/视野)没有明显的变化。结论pcD NA3.1asHpa对人乳腺癌细胞株MDA MB435S的侵袭力有一定的抑制作用,对黏附力无显著影响。     

RhoC表达与体外乳腺癌细胞系侵袭行为的相关性

目的研究RhoC在不同转移能力乳腺癌细胞系中的表达及其与乳腺癌侵袭行为的相关性。方法利用逆转录-聚合酶链反应、Western blot、细胞爬片免疫组织化学和免疫荧光组织化学染色检测乳腺癌低转移细胞系MCF-7和高转移细胞系MDA-MB-231中RhoC mRNA和蛋白表达水平。构建RhoC真核表达载体,并转染乳腺癌低转移细胞系MCF-7;利用Matrigel穿膜侵袭实验检测转染后细胞的体外侵袭能力,划痕修复实验检测运动迁移能力,组织化学染色检测微丝骨架结构的变化,并利用Western blot检测Akt磷酸化水平变化。结果RhoC在不同转移能力的乳腺癌细胞系中呈不同程度表达,在高转移细胞系MDA-MB-231中高表达,在低转移细胞系MCF-7中低表达,差异有统计学意义(P<0.01)。基因转染过表达RhoC后,乳腺癌细胞的体外侵袭能力明显增强,正义转染组穿膜细胞数(56.88±4.18)与其相应空载体组(23.77±3.64)、反义组(23.12±3.22)和未转染对照组(28.44±2.48)比较,明显增多(P<0.01);运动迁移能力明显增强,正义转染组24 h划痕修复率(58.28%±2.14%)明显高于转染空载体组(28.23%±2.62%)、反义组(22.36%±2.73%)和未转染对照组(30.18%±2.86%),差异有统计学意义(P<0.01);组织化学染色显示,正义转染组细胞内肌动蛋白多聚体减少,微丝骨架重构;此外,RhoC正义转染组细胞p-Akt水平升高。结论RhoC过表达促进乳腺癌细胞的体外侵袭能力,并与乳腺癌细胞系转移潜能正相关,有望成为阻断乳腺癌转移的新靶点。     

WNT信号传导通路与胃癌

Wnt信号传导通路与肿瘤的发生、发展密切相关。目前已知有十几种恶性肿瘤与Wnt信号传导通路的失调密不可分。文章探讨Wnt信号传导通路中各组成成分及其相互作用及其与胃癌发生、发展的关系。     

去甲斑蝥素对人胆囊癌GBC-SD细胞系增殖及侵袭的影响

目的　探讨去甲斑蝥素 (NCTD)对人胆囊癌GBC SD细胞系增殖、侵袭的影响及其机制。方法　应用细胞培养技术培养GBC SD细胞 ;以MTT法检测NCTD对GBC SD细胞的杀伤抑制率 ;以Matrigel侵袭实验、过河实验和SABC法检测NCTD对GBC SD细胞的侵袭力和对PCNA、Ki 6 7、MMP2 、TIMP2 蛋白表达的影响。结果　NCTD可明显抑制GBC SD细胞的增殖和生长 ,且随浓度提高或时间延长作用增强 ,呈剂量 时间效应关系 ;IC50 为 5 6 .18μg/ml,最强抑制作用时间为第 4 8小时。Matrigel侵袭、过河实验显示 ,NCTD在 5 μg/ml时 ,即能抑制GBC SD细胞的体外侵袭和运动能力 ,随浓度提高 ,过膜细胞减少 ,过膜死亡细胞增多 ,过河时间延长 (P <0 .0 1)。免疫组化测定显示 ,NCTD(IC50 )作用 4 8h后 ,GBC SD细胞PCNA、Ki 6 7、MMP2 表达下降 ,TIMP2 表达上升 ,MMP2 /TIMP2 比值下降 (P <0 .0 5 )。结论　NCTD可抑制人胆囊癌GBC SD细胞的生长 ,低浓度下也能抑制其体外侵袭能力 ;其机制可能与直接抑制GBC SD细胞迁移运动 ,干扰GBC SD细胞增殖相关基因蛋白PCNA、Ki 6 7和细胞基质溶解相关基因蛋白MMP2 、TIMP2 的表达有关。     

5-aza-2''''deoxycytidine联合trichostatin A抑制乳腺癌细胞增殖能力的研究

背景与目的：晚近报道应用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2’deoxycytidine（AZA）联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A（TSA）作用于多种肿瘤，可以达到治疗肿瘤的目的。本文在此探讨通过AZA联合TSA作用，抑制乳腺癌细胞株增殖能力。方法：联合应用两种药物作用于肿瘤细胞，应用RT—PCR的方法检测MDA—MB-435细胞株p21和p27的mRNA转录水平的改变。通过WST方法来检测乳腺癌细胞的增殖能力变化，将MDA—MB-435细胞根据药物处理共分四组：①对照组；②AZA＋TSA组；③AZA＋TSA＋4-OH TAM组；④4-OH TAM组。并且采用流式细胞仪来分析肿瘤细胞周期分布的改变，将MDA—MB-435分成另外四组：①对照组；②AZA＋TSA组；③AZA＋TSA＋E2组；④AZA＋TSA＋E2＋4-OH TAM组。结果：TSA以及AZA联合应用能使肿瘤细胞MDA—MB-435的p27的mRNA水平增加，而p21mRNA水平略减弱。增殖分析的四个组中：AZA＋TSA组细胞增殖能力减弱（P〈0．01），同时出现细胞阻滞于S期，加入雌激素后细胞阻滞稍减弱。AZA＋TSA＋4-OH TAM组增殖能力进一步减弱（P〈0．01）。4-OH TAM组增殖能力没有改变。细胞周期分析的四个组中：AZA＋TSA组出现细胞阻滞于S期，AZA＋TSA＋E2组细胞阻滞稍减弱。AZA＋TSA＋E2＋4-OH TAM组细胞阻滞再次提高。结论：两种药物联合应用能使得乳腺癌肿瘤细胞增殖能力下降，对于肿瘤细胞有一定抑制作用。     

瘦素对乳腺癌生长细胞动力学和形态学影响的研究

目的：研究瘦素对乳腺癌细胞株MCF-7细胞生长的作用。方法：分别使用0、25、50、100和200nmol／L瘦素作用于细胞株MCF-7细胞，同时在上述作用后24、48和72h采用光学显微镜观察细胞形态学改变，采用MTT比色方法，观察不同浓度瘦素对MCF-7细胞生长刺激的剂量、时间效应，比较在相对应剂量胰岛素情况下，二者对细胞增殖刺激作用的强弱。结果：加用瘦素各组细胞比未加瘦素细胞密度增加，形态变异。与正常对照组相比，各浓度瘦素（25、50、100和200nmol／L）均可明显促进MCF-7细胞增殖，其中50、100和200nmol／L瘦素作用24、48和72h后差异均有统计学意义，P〈0．05。瘦素对MCF-7细胞的增殖作用呈现一定的时间和剂量依赖效应。胰岛素各相对应组之间与瘦素比较，细胞增殖刺激作用差异无统计学意义，P〉0．05。结论：瘦素对乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖有刺激作用，且这种作用呈现一定的剂量、时间依赖效应，结果提示瘦素是促进乳腺癌细胞增殖的因素之一。     

雌激素对人乳腺癌细胞株MCF7增殖的促进作用

目的：观察雌二醇对乳腺癌细胞增殖的促进作用和可能的机制。方法：经不同浓度的雌二醇处理乳腺癌细胞株MCF7后，用MTT比色试验观察雌二醇对MCF7增殖活性的影响，免疫印迹法测量多种与细胞周期、抑癌、增殖、凋亡相关的蛋白质。结果：经MTT比色试验检测，雌二醇能增加MCF7细胞株的增殖活性，细胞周期素-D1明显增加。但雌二醇对抑癌基因：PTEN的蛋白表达没有明显影响，以及对具有抗细胞凋亡作用的PKB蛋白量也无明显作用。结论：雌二醇可促进乳腺癌细胞的增殖，可能通过细胞周期素-D1介导的分子机制，而不涉及PKB抗凋亡作用。     

食管癌细胞系CSEC的建立及其生物学特性

目的建立人食管癌细胞系为潮汕沿海地区食管癌研究提供实验模型。方法采用胶原酶消化法建立人食管癌细胞系CSEC。研究培养细胞的形态特点、生长特征、对Scid小鼠的致瘤性、细胞遗传学特点及肿瘤相关标志物（AE3、p53）的表达。结果细胞系CSEC在体外持续稳定生长超过13个月，已传至80代以上，群体倍增时间为39．6小时。CSEC细胞具有鳞状细胞的形态和结构特点，胞浆富含张力原纤维束，细胞间可见桥粒。Sdd小鼠移植瘤的组织学形态与患者的原发肿瘤一致。细胞系CSEC呈近四倍体核型，染色体结构改变常见而且复杂。肿瘤相关标志物（AE3、p53）呈强阳性表达。结论人食管癌细胞系CSEC是一分化较高且生物学特性稳定的鳞状细胞癌细胞系，可为食管癌的发病机制和治疗研究提供有价值的实验模型。     

乙酰肝素酶基因转染SKOV3细胞对细胞增殖、黏附、侵袭能力的影响

背景与目的：乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是能降解细胞外基质和基底膜的β-D-葡萄糖醛酸内切酶。HPA在人类正常组织局限于胎盘和免疫器官有表达，但在许多恶性肿瘤中有高水平的表达，促进了肿瘤的侵袭和转移。本文探讨乙酰肝素酶基因转染卵巢癌SKOV3细胞后对细胞生长、黏附、侵袭能力的影响。方法：以携带HPA基因的质粒（pCDNA3．0-HPA）经脂质体介导转染SKOV3细胞。RT—PCR法检测转染后HPAmRNA表达水平；MTT法检测SKOV3细胞生长曲线及细胞与细胞外基质的黏附；同质黏附试验和细胞分离试验检测细胞间的黏附和分离能力；利用transwell小室检测卵巢癌细胞SKOV3细胞的侵袭能力；流式细胞仪测细胞周期；免疫组化法检测卵巢癌细胞中HPA蛋白表达。结果：与对照组和空载组比较，转染组HPA mRNA水平上调，差异有显著性（t=-128．726，-96．959，P〈0．01）；细胞周期中S期指数明显增多；细胞生长曲线显示细胞生长速度增快；对细胞外基质的黏附率明显升高（t=11．824，11．234，P〈0．01）；同质黏附率降低（t=-14．455，-18．348，P〈0．01）；细胞分离率增强（x^2=869．847^b，796．068^b，P〈0．01）；穿透重组基底膜的细胞数目显著增高（t=11．964。12．263，P〈0．01）；细胞浆中的HPA蛋白表达显著上升。结论：转染HPA基因可以促进卵巢癌细胞的生长增值，增强卵巢癌细胞的侵袭转移能力。     

人大细胞肺癌多药耐药株H460/cDDP的建立及其生物学特性

目的：建立人大细胞肺癌多药耐药株H460/cDDP．并对其生物学特性进行测定。方法：以人大细胞肺癌细胞株H460为亲本细胞．采用顺铂大剂量问歇诱导法建立多药耐药细胞株H460／cDDP。光镜下观察其形态学变化；MTT法测定药物敏感性；锥虫蓝拒染实验测定细胞生长曲线、倍增时间；进行染色体核型分析；棵鼠成癌实验测定其体内成瘤活性。结果：历时近6个月建成人大细胞肺癌多药耐药株H460／cDDP．经鉴定其对顺铂的耐药指数为10．21，对5-氟尿嘧啶，多柔比星(阿霉素)、依托泊苷(足叶乙甙)、甲氨蝶呤有不同程度的交叉耐药。H460／cDDP较亲本细胞分裂高峰延迟，倍增时间由20．78小时延长至3646小时．细胞形态改变，染色体变化不突出。经过反复冻存．复苏．上述特性保持稳定．并具有体内成瘤活性，成瘤时间较亲本细胞有所延迟。结论：新建大细胞肺癌多药耐药株H460／cDDP呈中等度耐药、多药耐药表型稳定且具有体内成瘤活性，可用于下游实验。     

原花青素诱导人肺癌细胞A549凋亡作用研究

目的研究原花青素对人肺癌细胞株A549凋亡的影响并探讨其抗癌机制。方法以不同浓度的原花青素与人肺癌细胞株A549细胞共同培养,MTT法测定细胞增殖;Hoechst 33258/PI染色荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化;DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡特异性梯状DNA条带;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-3和Bcl-2表达的变化。结果原花青素可体外抑制肺癌A549细胞生长,抑制率呈浓度、时间依赖性,药物浓度达25 mg/L时作用48小时,A549细胞皱缩、细胞核碎裂成碎片,呈现典型凋亡改变;琼脂糖凝胶电泳可见凋亡细胞典型的梯状DNA条带;Western blot检测结果显示,Caspase-9、Caspase-3蛋白表达量与药物浓度的增加呈增加趋势,Bcl-2与药物浓度呈负相关。结论原花青素能通过诱导细胞凋亡进而抑制人肺癌细胞增殖,其凋亡机制可能与线粒体通路有关。     

CD40配基化对乳腺癌细胞株和血管内皮细胞的作用

目的:研究CD40配基化对乳腺癌细胞株和血管内皮细胞的作用。方法:间接免疫荧光法检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231(简称M231)、EVC细胞、新鲜乳腺癌细胞表面的CD40、CD40L的表达。与CD40L、多柔比星等共培养72小时,MTT法检测细胞增殖。AnnexinV-PI标记以流式细胞仪分析细胞周期。结果:CD40高表达于乳腺癌细胞株M231、乳腺癌新鲜标本及血管内皮细胞,上述3种细胞基本不表达CD40L。CD40配基化能明显抑制乳腺癌细胞株使乳腺癌细胞处于凋亡和死亡;使血管内皮细胞处于早期凋亡而非死亡。与多柔比星相结合有协同作用。结论:CD40配基化对乳腺癌有双重治疗作用:抑制乳腺癌细胞的同时抑制肿瘤新生血管。     

p27kip1高表达乳腺癌细胞株MCF-7基因表达谱的差异分析

目的:利用基因芯片技术筛选p27kip1转染乳腺癌MCF-7细胞的差异表达基因,探讨p27kip1调控肿瘤细胞增殖和细胞周期的分子机制。方法:将含p27cDNA的质粒在脂质体介导下体外转染乳腺癌MCF-7细胞,利用Affy-metrix公司的人类基因组基因芯片U133A分别检测表达p27kip1蛋白和空载体的乳腺癌细胞株的基因表达谱,用生物信息学软件进行比较分析,对差异表达基因进行功能分类。结果:在含22277个基因cDNA的芯片上差异表达的基因有1379条,其中表达谱发生明显变化(2倍以上)的基因173条,占总检测基因的0·78%。157条基因表达明显上升(SLR>1),占总检测基因的0·705%;16条基因表达明显下降(SLR<-1),占总检测基因的0·072%。基因表达差异主要集中在物质代谢、细胞增殖、细胞周期调控、细胞分化与凋亡、免疫反应、信号传导、蛋白转运、调节转录等方面。结论:多基因共同参与了p27kip1抑制肿瘤细胞过度增殖以及促进细胞凋亡的作用。对于p27kip1相关基因群的研究有助于认识p27kip1蛋白在细胞周期调控乃至整个细胞癌变过程中作用的分子机制。     

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖.本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响.方法:将含有mfn2 cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Western blot法检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化.结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP.MTT实验提示转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2 cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2 2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P＜0.05).mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4 h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6 4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4 2.8)%(P＜0.05).结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性.