组织工程化软骨对兔膝关节全层软骨缺损的修复效果

目的 观察同种异体软骨细胞复合人胎盘Ⅰ型胶原蛋白海绵对兔膝关节股骨髁间窝全层软骨缺损的修复效果.方法取2周龄新西兰兔软骨细胞体外培养传代,选择生长状态相对较好的第2代细胞作为种子细胞,并与人胎盘Ⅰ型胶原蛋白海绵复合.取雄性8月龄新西兰兔54只,制作股骨髁间窝全层软骨缺损模型,随机分为3组：分别为对照组、种子细胞组及种子细胞＋支架材料组.后两组分别植入相应成分.于术后12周、24周、36周分别取其膝关节,观察修复效果. 结果 术后12周种子细胞组缺损区可见少量白色半透明组织覆盖,组织结构粗糙,可见多数针尖样结构;复合支架材料组表面相对光滑,亦可见半透明白色组织形成.24周,种子细胞组缺损区可见较多白色组织形成,透明度较前降低,呈半软骨半纤维样组织;复合支架材料组修复明显较种子细胞组快,表面光滑,呈半透明状覆盖于缺损区,与周围组织有较好吻合,但仍未完全修复软骨缺损.36周,种子细胞组可见更多白色组织覆盖,透明度较前更低;复合支架材料组则修复完好,高度基本与周围组织平齐,呈半透明样软骨组织.空白对照组随着时间的推移,呈现不同程度的纤维组织样修复. 结论 关节软骨自身修复能力有限,只能实现纤维样修复;软骨细胞可部分修复关节软骨缺损,但随着修复时间的推移,逐渐去分化而出现纤维样改变;而软骨细胞复合Ⅰ型胶原蛋白海绵则可以较好地修复关节软骨缺损,且随着时间的延长,关节软骨可基本实现完全修复.     

壳聚糖与Ⅰ型胶原制备组织工程复合支架材料的扫描电镜研究

【目的】通过扫描电镜观察壳聚糖和Ⅰ型胶原在不同温度下以不同比例制备成冻干状组织工程复合支架材料的微观结构，以获得最佳浓度、比例、温度匹配组合，制备理想的组织工程复合支架材料。【方法】在-5℃、-20℃和-80℃将不同浓度的壳聚糖、Ⅰ型胶原以及它们不同比例的混合液冷冻12h后冻干24h．扫描电镜观察不同材料表面和内部的微观结构，并计算其平均孔径和孔隙率。【结果】壳聚糖、Ⅰ型胶原以及它们的混合液冻干后都形成白色海绵状固体，冷冻温度越低冻干后材料的孔径越小，孔隙率越低；材料的浓度越高冻干后孔径越小，孔隙率越低；壳聚糖-Ⅰ型胶原混合液中壳聚糖含量越高，材料冻干后孔径越小，孔隙率越低。【结论】壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架的孔径和溶液浓度、二者配比以及冻干前的冷冻温度密切相关。     

Ⅰ型胶原-糖胺聚糖模板的制备与检测

目的：制备胶原-糖胺聚糖模板,并检测其作为半月板组织工程重建的相关种子细胞载体的可行性。方法：采用Yannas法以大鼠尾作为原料提取I型胶原,加入糖胺聚糖后首当其冲干成为I型胶原-糖胺聚糖模板,体外加入经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β1（TGF-β1）协同刺激后的兔骨髓间充质干细胞增养2周后,行组织学及电镜检测。结果：培养2周后所制备的胶原-糖胺聚糖模板显微及超微结构保持良好。对骨髓间充质干细胞无毒害作用。结论：本实验方法所制备的胶原-糖胺聚糖模板适合用作半月板组织工程重建的种子细胞生物载体。     

新型纳米支架并MSCs修复兔桡骨缺损影像学观察

目的 采用富含血小板血浆(PRP)的新型纳米活性组织工程支架复合骨髓基质干细胞(MSCs)修复兔桡骨中段骨-骨膜缺损,通过影像学手段评价其成骨能力。方法 取健康成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组(A组,8只)、对照组(B组,8只)和空白组(C组,4只)。建立双侧桡骨骨缺损模型。A组将PRP纳米支架与MSCs在体外复合培养后植入兔的骨缺损中,B组将PRP纳米支架植入骨缺损处,C组不植入任何材料。分别于术后4、8、12周通过大体观察、X线检查及影像学评分等方法观察骨缺损修复情况。结果 A组复合材料有良好的诱导成骨能力,治疗4周即有明显的成骨反应和新骨形成,治疗12周基本修复骨缺损;B组修复能力较A组差;但A、B组均优于C组。A组和B组对工程支架无明显异物反应。结论 新型纳米活性组织工程支架是修复兔骨缺损的良好移植材料,复合MSCs后能促进骨缺损的修复。     

壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料的制备及其性能的研究

目的：探讨壳聚糖／Ⅰ型胶原复合物作为软骨组织工程支架材料的物理性能和生物学特性。方法：将壳聚糖溶液与Ⅰ型胶原溶液混合,梯度冷冻后通过冷冻干燥法制备成复合支架。以纯壳聚糖支架材料作为对照。扫描电镜检测支架材料的形貌,检测支架材料的孔径、孔隙率和吸水率。酶消化法培养滑膜细胞,将第3代滑膜细胞接种于支架材料中,检测滑膜细胞在支架材料中的粘附情况,并通过噻唑蓝（MTT）法检测支架材料对滑膜细胞增殖的影响。结果：制备的支架材料呈孔隙分布均匀的海绵状。支架材料的平均孔径为（119．32±38．67）μm,孔隙率为（91．40±1．41）％,吸水率为（69．10±5．61）水g／支架于重g。滑膜细胞在壳聚糖／Ⅰ型胶原支架材料中的粘附率为98．73％,并且该支架材料对滑膜细胞的增殖具有明显促进作用。结论：壳聚糖／Ⅰ型胶原支架材料可作为细胞载体应用于软骨组织工程。     

外源性Ⅰ型胶原对人胚骨膜成骨细胞生物学特性的影响

目的　研究 型胶原对人胚骨膜来源成骨细胞生物学特性的影响 ,为 型胶原在组织工程人工骨中的应用提供依据。方法　在不同浓度 型胶原涂层上培养成骨细胞 ,用细胞计数法研究成骨细胞粘附情况 ,3 H- Td R掺入实验观察成骨细胞增殖能力 ,通过检测成骨细胞胶原、骨钙素和碱性磷酸酶的合成情况 ,以不涂层 型胶原为对照组 ,比较骨膜来源成骨细胞成骨能力的改变。结果　 型胶原对成骨细胞发挥以下作用 :1增加粘附细胞数量 ,且在 2 5 μg/ m l浓度达最大效应 ;2减弱成骨细胞增殖能力 ,且以 12 .5 μg/ ml以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 ) ;3轻度减弱成骨细胞 型胶原合成能力 ,以 2 5 μg/ ml以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 ) ;4增加骨钙素合成 ,以6 .2 5 μg/ m l以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 ) ,2 5 μg/ m l浓度达最大效应 ;5增加成骨细胞碱性磷酸酶活性 ,以 12 .5 μg/ml以上浓度作用显著 ( P<0 .0 5 )。结论　 型胶原能促进成骨细胞的粘附与分化 ;支架材料上复合 型胶原涂层可增强成骨细胞的成骨能力 ; 型胶原最佳复合浓度为 2 5 μg/ ml     

活血止痛膏对兔骨骼肌急性钝挫伤后Ⅱb型MHC、Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

目的:观察活血止痛膏剂对兔骨骼肌钝挫伤后内源性IIb型肌球蛋白重链(MHC)、Ⅰ型及III型胶原mRNA表达的影响。方法:63只大白兔随机分为活血止痛膏高、中、低剂量组与青鹏膏对照组、外伤对照组,每组12只。另取3只为正常对照组。各实验组采用"重物自由落体打击法"制作大白兔骨骼肌急性钝挫伤模型。受伤第1天即于伤处贴敷相应药物。各组伤后3、10、20、27天各处死大白兔3只,取腓肠肌标本,共6个。RT-PCR技术检测内源性Ⅱb型MHC、Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA。结果:①伤后第3、10、20天活血止痛膏高、中剂量组和青鹏膏组内源性Ⅱb型MHCmRNA表达量高于外伤组和低剂量组(P<0.05);第10、20天活血止痛膏高剂量组内源性IIb型MHCmRNA表达高于中剂量组(P<0.05);②内源性I型胶原mRNA表达量:第3天各组比较无统计学意义(P>0.05);第10、20天活血止痛膏高、中剂量组和青鹏膏组表达量低于外伤组、低剂量组(P<0.05);第10、20天中剂量组高于高剂量组(P<0.05)。③内源性Ⅲ型胶原mRNA表达量:第3、10、20天活血止痛膏高、中剂量组和青鹏膏组内源性Ⅲ型胶原mRNA表达低于外伤组和低剂量组(P<0.05);第3、10、20天高剂量组和青鹏膏组表达量明显少于中剂量组(P<0.05)。三个检测指标各个时间点青鹏膏组和高剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:活血止痛膏可有效促进骨骼肌急性钝挫伤后Ⅱb型MHCmRNA表达,减少Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达,其作用与青鹏膏相当。     

bFGF、IGF-Ⅰ对兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insuline-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）单独及联合应用对体外培养多次传代的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。探讨传代多次的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：第3、5、7代体外培养的兔关节软骨细胞，以常规培养组作为对照组，bFGF（5ns／m1）或和IGF-Ⅰ（100ng/ml）单独刺激及联合刺激作为实验组，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的定性表达，并通过图像分析作半定量分析。结果：对照组细胞第5代以后无阳性表达。第3、5、7代细胞在bFGF或IGF-Ⅰ刺激下。Ⅱ型胶原表达强度显著高于对照组（P〈0．01）；bFGF和IGF-Ⅰ联合作用下，Ⅱ型胶原表达强度均显著高于单独以bFGF或IGF-Ⅰ刺激组（P〈0．05）。结论：bFGF、IGF-Ⅰ能促进多次传代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，且联合应用时促进作用更为明显。多次传代软骨细胞在生长因子刺激下，仍有再分化的能力。而有成为软骨组织工程种子细胞的可能。     

壳聚糖与Ⅰ型胶原制备组织工程复合支架材料的扫描电镜研究

【目的】通过扫描电镜观察壳聚糖和Ⅰ型胶原在不同温度下以不同比例制备成冻干状组织工程复合支架材料的微观结构,以获得最佳浓度、比例、温度匹配组合,制备理想的组织工程复合支架材料。【方法】在-5℃、-20℃和-80℃将不同浓度的壳聚糖、Ⅰ型胶原以及它们不同比例的混合液冷冻12h后冻干24h,扫描电镜观察不同材料表面和内部的微观结构,并计算其平均孔径和孔隙率。【结果】壳聚糖、Ⅰ型胶原以及它们的混合液冻干后都形成白色海绵状固体,冷冻温度越低冻干后材料的孔径越小,孔隙率越低;材料的浓度越高冻干后孔径越小,孔隙率越低;壳聚糖-Ⅰ型胶原混合液中壳聚糖含量越高,材料冻干后孔径越小,孔隙率越低。【结论】壳聚糖-Ⅰ型胶原复合支架的孔径和溶液浓度、二者配比以及冻干前的冷冻温度密切相关。     

扩张兔皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原的变化

目的：探讨兔皮肤扩张后皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原的改变。方法：选用2～3kg新西兰大白兔64只分为2大组，快速扩张组和常规扩张组，每组32只，每大组再分为4组，为扩张完成后即时、1周、12周、24周组，每组8只，其中4只为实验组，另4只植入扩张器不扩张作为对照组。通过免疫组化的方法观察扩张后即时，1，12，24周真皮中胶原含量、Ⅰ、Ⅲ型胶原比例的变化。结果：扩张后即时Ⅰ型胶原染色的基底膜连续性破坏。排列无规律，多呈碎片状。胶原束间隙增大、Ⅲ胶原合成增加，快速扩张组比常规扩张组明显；后期胶原纤维重叠。结论：胶原Ⅰ、Ⅲ是扩张后皮肤的挛缩的直接原因之一。     

硅胶膜管联合组织工程骨修复兔桡骨缺损实验研究

目的:探讨硅胶膜复合组织工程骨修复兔桡骨缺损的效果.方法:在新西兰大白兔左、右侧桡骨中段制作长1.5 cm的骨与骨膜缺损,左侧采用硅胶膜包裹组织工程骨修复缺损为实验组,右侧单纯用组织工程骨修复缺损为对照组;术后3、6、9个月通过肉眼观察,组织学观察和生物力学检测,评价硅胶膜复合组织工程骨修复兔桡骨缺损的效果.结果:术后3个月实验组可见局部成熟的成骨区域,优于对照组;实验组6个月成熟成骨区域增大,可见明显血管;实验组9个月成骨区域基本上都是成熟胶原纤维,且结构排列规则,血管明显;生物力学检测发现实验组的压缩刚度、抗扭转刚度、三点弯曲最大载荷、抗折弯刚度都明显优于对照组.结论:硅胶膜包裹组织工程骨修复骨缺损效果良好,不但能促进骨组织的生长和成熟,并且能明显提高骨组织的力学性能;硅胶膜除了可以限制纤维组织的长入,还可以引导血管的长入和其他营养物质聚集在组织工程骨内,很好地发挥屏障和引导作用.     

海藻酸钙/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料修复兔桡骨缺损

目的 探讨海藻酸钙/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料植入动物体内的成骨能力.方法 用18只3月龄健康新西兰大白兔制备兔桡骨中段15 mm骨缺损模型.将每只兔子的左右前肢按随机数字表法分为实验组和对照组.在实验组兔桡骨缺损部位植入海藻酸钙/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料,对照组为空白对照,骨缺损部位不植入任何材料.分别于术后4、8、12周采用X线和组织学方法检测缺损部位的成骨情况.结果 18只模型兔均进入结果分析.X线结果显示,4周时实验组桡骨缺损区可见明显的骨生成影像,呈云雾状分布,随时间的延长骨量增多,至12周时,植入体已与缺损处断端骨性愈合,皮质骨连续性较好.对照组12周时显示骨断端骨质硬化,骨缺损区尚未修复.组织学结果表明,4周时实验材料内部可见骨形成细胞集中,随时间的延长骨量增多,并相互连接成片,到12周时,材料内骨小梁成熟,网孔间新生骨小梁相互连接成板状.结论 海藻酸钙/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料具有良好的成骨能力.     

外源性Ⅰ型胶原对人胚骨膜成骨细胞生物学特性的影响

OBJECTIVE: To study the influence of type I collagen (COL I) on the cell behavior of human periosteous osteoblasts (OB) and the application of type I collagen in constructing bioactive artifical bone. METHODS: OB were cultured on dishes coated with bovine type I collagen in different final concentrations. The cell adhesion was examined by the methods of cell count, the proliferation of OB was studied by 3H-TdR, and the osteoblastic ability was assessed by the synthesis of collagen, osteocalcin and alkaline phosphatase (ALP). RESULTS: OB cultured on type I collagen layer had the following characteristics: 1. The amounts of adhesive cells were maximal top in 25 micrograms/ml final concentration; 2. The proliferation of OB was decreased above 12.5 micrograms/ml final concentration (P < 0.05); 3. The synthesis of type I collagen was reduced slightly (above 25 micrograms/ml, P < 0.05); 4. The secretion of osteocalcin was increased markedly (above 6.25 micrograms/ml, P < 0.05, which reached maximally in 25 micrograms/ml); 5. The ALP activity was also increased (above 12.5 micrograms/ml, P < 0.05). CONCLUSION: Type I collagen promotes the expression of osteoblastic phenotype and cell adhesion. When the scaffold materials for bone tissue engineering are coated with type I collagen, the osteogenesis of OB is enhanced to accelerate the transformation course from artificial bone to biological bone, the best final concentration is 25 micrograms/ml.     

构建中空纤维聚砜膜/Ⅰ型胶原支架中3个胶原浓度的比较

目的 Ⅰ型胶原对中空纤维聚砜膜和鼠肾小管上皮细胞NRK-52E粘附的影响.方法 按照中空纤维聚砜膜和0.20%、0.25%和0.30% 3种浓度的Ⅰ型胶原制备支架,分为4组,用原子力显微镜评价其表面的粗糙度,植入鼠肾小管上皮细胞NRK-52E培养7天,观察细胞在材料表面的生长情况,AO-EB染色荧光显微镜观察增殖细胞数目,扫描电镜观察细胞形貌.结果 0.20%、0.25%和0.30% 3种浓度的Ⅰ型胶原制备支架粗糙度均比聚砜膜组明显增加(P<0.05),3组支架上NRK-52E生长增殖的数目均比聚砜膜组明显增加(P<0.01),0.20%、0.25%和0.30%浓度Ⅰ型胶原3组间无显著性差异(P>0.05),细胞形态结构良好.结论 较低浓度(0.20%)Ⅰ型胶原构建的中空纤维聚砜膜/Ⅰ型胶原制备支架是可行的,能增加NRK-52E粘附、生长和增殖.     

基于脂肪干细胞Ⅰ型胶原凝胶PLGA-β-TCP支架的新型仿生骨组织工程复合体的构建及生物学性能

目的:尝试构建基于脂肪干细胞、Ⅰ型胶原凝胶以及PLGA-β-TCP支架的新型仿生骨组织工程复合体,并对其生物学性能进行研究.方法:取3 mo龄日本大耳白兔皮下脂肪,获得脂肪干细胞,经体外成骨诱导分化鉴定后使用Ⅰ型胶原凝胶将其悬浮并与三维多孔支架PLGA-β-TCP复合,从而构建成脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP骨组织工程复合体,体外成骨诱导培养2 wk,实验以脂肪干细胞/PLGA-β-TCP材料复合体作为对照.扫描电镜观察复合情况,并对脂肪干细胞的增殖以及成骨诱导分化情况进行检测.结果:Ⅰ型胶原凝胶将rADSCs均匀悬浮于材料孔隙中,碱性磷酸酶活性以及细胞外基质矿化程度检测显示Ⅰ型胶原凝胶能显著促进rAD-SCs的成骨分化.结论:脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-B-TCP复合体的构建成功为骨组织工程复合体的设计提供了一条新的思路.     

尼尔雌醇对去卵巢大鼠骨组织中Ⅰ型胶原代谢及组织蛋白酶K表达的影响

目的观察尼尔雌醇对去卵巢大鼠骨组织中Ⅰ型胶原蛋白代谢及组织蛋白酶K表达的影响。方法27只雌性SD大鼠随机分成三组：假手术组为阴性对照组，模型组为阳性对照组，尼尔雌醇组给予尼尔雌醇（每日0．1mg／kg）治疗12周。测定大鼠全身骨密度和尿Ⅰ型胶原氨基束端交联肽／肌酐（NTx／Cr）比值，采用免疫组织化学法测定Ⅰ型胶原蛋白和组织蛋白酶K的含量。结果12周后，尼尔雌醇可以增加去卵巢大鼠的全身骨密度（P〈0．05），且使Ⅰ型胶原的表达升高。组织蛋白酶K的表达及尿中NTx／Cr水平明显下降。结论尼尔雌醇可能通过促进大鼠骨组织中Ⅰ型胶原蛋白的合成、抑制其水解吸收．从而提高大鼠骨密度、改善骨质量。     

不同频率牵拉对兔跟腱组织学表现和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的 观察不同频率牵拉对兔跟腱组织学表现和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响,探讨牵拉频率与腱病之间的关系.方法 45只雄性新西兰大白兔随机分成3组,其中一组作为对照组未施加电刺激,另两组施加电刺激腓肠肌以牵拉跟腱,电刺激频率分别为0.17和1 Hz.光镜下观察兔跟腱组织学变化,免疫组化检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达情况.结果...     

同种异体骨髓间充质干细胞复合胶原海绵修复兔桡骨缺损的实验研究

目的：了解兔骨髓间充质干细胞（BMscs）同种异体移植的存活分布情况及同种异体兔BMscs复合胶原海绵（CS）情况,观察其对兔桡骨1.5 cm缺损的修复效果,为将来的进一步应用奠定实验基础。方法：采集、培养、纯化扩增新西兰大白兔BMscs,用eGFP荧光标记BMscs,与胶原海绵联合培养,植于同种异体动物臀大肌,观察存活及分布情况。建立兔桡骨缺损（1.5 cm）模型,45只新西兰大白兔随机分为3组：同种异体BMscs/CS组（A组）,单纯胶原海绵组（B组）,空白对照组（C组）。术后分阶段行X线、组织学检查及生物力学检查,评价其修复效果。结果：eGFP标记的BMscs异体移植存活时间超过3周。X线示12周A组大白兔5只中有4只达到骨性连接。新生骨量呈A组-C组递减,至12周无一愈合。随着时间推移,A组编织骨髓腔和骨小梁增多,修复过程优于B、C组。A组生物力学指标均低于健侧正常对照组,但各指标能达到正常组的80%～90%。结论：同种异体MSCs复合CS可以修复1.5 cm兔桡骨缺损。     

胶原/透明质酸复合多孔组织工程支架的构建及评价

目的制备胶原/透明质酸复合多孔海绵支架材料,评价支架的形貌、性能及其生物学性能。方法将胶原和透明质酸用溶液法混合后冷冻干燥,经干热和化学交联制得多孔支架材料。考察其物理化学性质和细胞毒性,并评价细胞在支架上的黏附和生长情况。结果较高离子强度的NaCl可避免正电荷性的胶原与负电荷性的透明质酸形成聚离子复合物,得到均匀的混合溶液。冷冻干燥后经干热和化学交联,得到的支架材料孔径可控,孔径分布均匀,具有良好的生物相容性。细胞在支架材料内部具有良好的黏附性能,生长状况明显优于单纯胶原制备的多孔支架材料。结论胶原/透明质酸多孔支架材料具有开放的多孔结构,生物相容性良好,适合细胞的分布和生长,可以作为一类优良的组织工程支架材料。     

新型纳米活性组织工程支架复合BMSCs修复兔大段桡骨缺损血管化观察

目的探讨新型纳米活性组织工程支架复合骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复兔大段桡骨缺损的血管化进程及骨缺损修复能力。方法将44只成年新西兰大耳白兔制备成双侧桡骨中段15mm的骨-骨膜缺损模型,随机选取4只白兔不植入任何材料作为空白组;剩余的40只白兔在其右侧桡骨缺损处植入复合BMSCs的新型纳米活性组织工程支架作为实验组,在其左侧植入新型纳米活性组织工程支架作为对照组。术后2、4、6、8周分批处死动物,行组织学观察,并检测各组血管化程度。结果组别和时间对血管化程度影响存在交互作用(F=78.137,P<0.01)。对照组和实验组组内任意两个时间点血管化程度比较,差异均有统计学意义(F=79.225、7 803.609,P<0.01)。组间两两比较显示,第2、4周,实验组的血管化程度高于对照组,第6周实验组的血管化程度低于对照组,差异有统计学意义(t=10.244~25.036,P<0.01);第8周两组血管化程度比较差异无显著性(P>0.05)。结论新型纳米活性组织工程支架能够较快发生血管化,复合BMSCs的新型纳米活性组织工程支架成骨能力较单纯支架材料强。