腺病毒介导的RNAi技术抑制Peroxiredoxin Ⅰ的表达

目的:为深入研究PeroxiredoxinⅠ(Prx-Ⅰ)基因与肿瘤细胞放射敏感性的关系,构建基于腺病毒的抑制Prx-Ⅰ基因表达的RNAi载体。方法:从质粒载体pAVU6-Prx切下包含U6启动子在内的表达盒,连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack,然后在大肠杆菌中重组为完整腺病毒DNA,并将其转染293包装细胞制备腺病毒颗粒,再利用腺病毒感染目的肿瘤细胞,干扰其Prx-I基因的表达。结果:成功地将U6表达盒连接到穿梭载体,获得重组的腺病毒DNA,并制备出高滴度病毒。将病毒感染肿瘤细胞SW480以后可以明显抑制Prx-Ⅰ基因的表达,并使细胞受辐射后的细胞凋亡比例增大。结论:基于腺病毒的RNAi干扰是有效的,这为进一步在体内探讨肿瘤放疗增敏机制奠定了基础。     

突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响

目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-ras^V12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-ras^V12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-ras^V12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-ras^V12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-ras^V12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-ras^V12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-ras^V12对人肺腺癌细胞K-ras^V12表达的影响。结果:成功构建K-ras^V12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-ras^V12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-ras^V12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。     

RNAi载体构建及其对PLC/PRF/5细胞突变p53基因抑制作用的实验研究

目的利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，以突变p53基因为靶基因，构建干扰载体，并观察载体对肿瘤细胞生长周期的影响，为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础。方法设计具有小发夹结构的两条DNA序列，经退火成为互补双链，再克隆至干扰载体中，转化TOP10菌株，提取质粒行酶切鉴定，稳定转染PLC／PRF／5细胞，Western blot检测p53蛋白，MTT法观察细胞生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期变化。结果成功构建针对突变p53的特异性RNA干扰载体，此干扰载体转染PL／PRF／5细胞后，p53蛋白表达水平降低，肿瘤细胞生长速度减慢，G1期细胞分布明显增多。结论成功构建针对突变p53的RNA干扰载体，此干扰载体可以有效降低p53蛋白表达水平，导致突变p53基因沉默，进而延缓PLC／PRF／5细胞生长速度，阻滞肿瘤细胞停滞于G1期。     

腺病毒介导的RNAi技术抑制Peroxiredoxin Ⅰ的表达

目的：为深入研究PeroxiredoxinⅠ（Prx—Ⅰ）基因与肿瘤细胞放射敏感性的关系，构建基于腺病毒的抑制Prx—Ⅰ基因表达的RNAi载体。方法：从质粒载体pAVU6-Prx切下包含u6启动子在内的表达盒，连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack，然后在大肠杆菌中重组为完整腺病毒DNA，并将其转染293包装细胞制备腺病毒颗粒，再利用腺病毒感染目的肿瘤细胞，干扰其Prx—Ⅰ基因的表达。结果：成功地将U6表达盒连接到穿梭载体，获得重组的腺病毒DNA，并制备出高滴度病毒。将病毒感染肿瘤细胞SW480以后可以明显抑制Prx—Ⅰ基因的表达，并使细胞受辐射后的细胞凋亡比例增大。结论：基于腺病毒的RNAi干扰是有效的，这为进一步在体内探讨肿瘤放疗增敏机制奠定了基础。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的:构建VEGF-C基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法:以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果:经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及检测

目的构建携带融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc表达载体。方法提取SLC-HP基因及含Fc段基因的质粒构建携带目的基因的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMVSLC-HP-Fc,经酶切线性化后转入含有pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183中进行同源重组,得到重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc。线性化后的病毒表达载体通过脂质体Lipofectamine 2000转染293细胞,通过包装扩增并经PCR鉴定后得到大量复制病毒并纯化保存。结果得到重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc,成功转染293细胞出现细胞病变反应,经酶切及PCR法确定目的基因的表达。结论成功构建了SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体,并建立了重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc种子病毒库和工作病毒库,为进一步研究该融合基因与肿瘤相关作用奠定了实验基础。     

干扰iASPP基因对转染MCF-7细胞凋亡变化的观察

目的:观察iASPP基因干扰RNA转染乳腺癌细胞MCF-7后的干扰效果及细胞凋亡变化。方法:设计特异性siRNA序列,将序列克隆至PGCsilencerTM H1/Neo/GFP质粒中,用脂质体将重组子转染至MCF-7细胞中,用RT-PCR方法检测i ASPP的表达,蛋白质印迹法检测蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果:iASPP干扰质粒转染MCF-7细胞后,iASPP的mRNA表达和蛋白表达减少40%～50%;p53蛋白相对表达量由转染阴性质粒的0.37增加到转染干扰质粒的0.64;细胞凋亡率由原来的17.8%和16.2%分别增加到53.5%和51.3%。结论:抑制内源性i ASPP能有效地恢复乳腺癌细胞MCF-7中p53的抑癌功能,为乳腺癌的治疗提供新的思路。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用.方法: 根据 GenBank数据库提供的 CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl 设计原则,设计选择双链小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA ) ,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定.结果: 经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达.结论: CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功.     

RNA干扰53BP1基因表达对食管癌放射敏感性的影响

背景与目的:细胞周期检测点激酶53BP1在细胞周期调控方面发挥着重要的作用,对体细胞的正常生长没有明显的调节作用,但在DNA损伤发生后被激活,引起细胞周期阻滞。本研究利用RNA干扰技术降低食管癌细胞ECA109细胞53BP1基因表达,观察其对放射线照射后细胞周期和放射敏感性的影响。方法:针对53BP1 mRNA序列,设计合成3对有效的干扰序列(siRNAl、siRNA2和siRNA3)和阴性对照序列,与载体pSIH1-H1-copGFP连接形成重组质粒,瞬时转染细胞,实时PCR(real-time PCR)和Western blot检测53BP1的表达,筛选有效干扰序列,与慢病毒包装质粒混合物共同转染293T细胞,收集病毒液,感染ECA109细胞,获得稳定转染细胞系,命名为ECA109/B,转染空载体组命名为ECA109/N。采用real-time PCR和Western blot测定53BP1在mRNA水平和蛋白水平的表达。采用MTT、流式细胞术和克隆形成实验检测RNA干扰53BP1基因对ECA109细胞放射敏感性的影响。结果:成功构建p53BP1-shRNA质粒,3对干扰序列对人53BP1基因的表达在mRNA和蛋白水平显著低于阴性对照组和空白对照组,尤以siRNA1组效果最明显,取干扰效果最好的siRNA1,利用慢病毒包装系统,共同转染293T细胞,收集病毒液,感染ECA109细胞,荧光显微镜下挑取阳性克隆,扩大培养,获得稳定转染细胞株ECA109/B,53BP1基因在mRNA和蛋白表达水平亦低于对照组;MTT结果表明53BP1低表达对细胞的增殖无明显影响,用流式细胞术分析显示5 Gy射线照射后,ECA109/B的G2/M期比例明显低于阴性对照组和空白对照组;克隆形成实验的结果显示ECA109、ECA109/N、ECA109/B细胞的D0值分别为3.06、2.90和2.07 Gy;SF2值分别为0.91、0.89和0.79;Dq值分别为1.59、1.47和1.21,可见ECA109/N、ECA109放射敏感性未见明显差异,而ECA109/B细胞的放射敏感性高于ECA109/N、ECA109。结论:RNA干扰技术可以有效地抑制食管癌细胞ECA109中53BP1基因的表达,从而增强ECA109细胞的放射敏感性。     

Effect of RNA interference of iASPP on the apoptosis in MCF-7 breast cancer cells

ASPP family is proved to be apoptotic specific regulators of p53. Among them, iASPP acts as an inhibitor of p53. To investigate the effect of the iASPP RNAi on the apoptosis of breast cancer cell MCF-7, we transfected the recombinant plasmid PGCsilencer H1/Neo/GFP/RNAi into MCF-7. The iASPP expression was analyzed by RT-PCR and Western blot. The cell apoptosis was detected by FCM. The results show that the expression of iASPP is descended and the apoptosis rate is increased after transfection. Therefore, we conclude that inhibition of expression of iASPP may resume the ability of p53 to induce apoptosis in MCF-7 cells.     

化学修饰的siRNA对乳腺癌细胞VEGF基因表达抑制及凋亡的诱导作用

目的：体外水平探讨化学修饰的小干扰RNA（siRNA）介导的RNAi治疗乳腺癌的可行性。方法：选用阳离子脂质体Lipofectamine2000^TM作为转染试剂,将化学修饰的针对人VEGF基因的siRNA转染人类乳腺癌细胞株MCF-7。半定量RT—PCR和蛋白印迹试验分别检测转染前后细胞中VEGF、Bcl2和baxmRNA和蛋白水平表达的变化,Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡。结果：与未转染的正常细胞组相比,靶向VEGF基因的siRNA转染MCF-7后,细胞中VEGF及Bcl-2mRNA和蛋白表达水平显著降低,P〈0．01。bax基因的表达未发生明显变化,Bcl-2和bax比值下降。Hoechst33258荧光染色显示转染siRNA72h后细胞内可见凋亡小体。结论：化学修饰的siRNA介导的RNAi下调靶基因VEGF的表达,并对MCF-7细胞有明显的凋亡诱导作用。     

siMDR1重组慢病毒载体的构建及其对A549和A549／DDP细胞的影响

背景与目的:肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的最主要原因,也是癌症术后复发及转移的主要原因.本研究旨在探讨MDR1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒对人肺腺癌A549细胞和对顺铂耐药的A549/DDP细胞的MDR1基因的抑制作用.方法:设计获得针对MDR1的短发卡状RNA(small hair pin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列,退火后插入线性化的pSUPER载体(H1启动子下游).把构建获得的载体转染A549细胞,RT-PCR法检测其对MDR1的干扰作用,筛选确定MDR1基因RNAi有效靶序列;合成靶序列的01igo DNA,与含启动子和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的PTM载体连接产生PTM-siMDR1慢病毒载体;用重组慢病毒体外感染A549和A549/DDP细胞.结果:成功构建可以表达针对MDR1的发卡状RNAi,能有效的下调MDR1的表达.成功构建获得针对MDR1基因的慢病毒载体PTM-siMDR1,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为0.5×109TU/mL.感染PTM-siMDRI的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性明显提高,逆转倍数达3.81倍.结论:siiDR1重组慢病毒载体感染A549/DDP细胞,能明显改善其对顺铂的耐药性.     

乳腺癌耐药蛋白重组腺病毒干扰载体构建及其干扰作用的观察

目的:观察腺病毒加载的RNAi对乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的多药耐药的逆转。方法:构建干扰BCRP mRNA的腺病毒载体,采用细胞毒性实验和外排实验检测pAd-BCRP感染后,耐药细胞后的逆转情况。结果:pAd-BCRP可将B37/MX细胞对米托蒽醌的耐药指数从978降低至75(92.3%逆转)。外排实验结果显示,感染pAd-BCRP和未感染的B37/MX细胞外排1 h后细胞内的米托蒽醌的荧光强度分别为56.4和12.8。结论:pAd-BCRP能显著降低B37/MX细胞中BCRP的表达并抑制BCRP的功能。     

下调VEGF表达对人乳腺癌细胞凋亡相关基因影响的研究

目的:研究下调VEGF基因的表达对人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡及相关基因表达的影响,探讨敲减VEGF后乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制.方法:体外化学合成针对VEGF基因的siRNA序列,在脂质体Li-pofectamine2000TM 介导下转染MCF-7细胞,RT-PCR检测VEGF、Survivin及wtP53表达水平,比色法检测Caspase-3的活性,免疫组织化学法检测Survivin蛋白的表达,并用图像分析软件分析蛋白表达强度.结果:靶向VEGF的siRNA转染MCF-7后,明显促进了细胞凋亡,VEGF mRNA表达明显减少;Survivin基因mRNA及蛋白水平表达下调(P<0.01);p53的mRNA表达上调,Caspase-3活性增高.结论:敲减VEGF基因可促进MCF-7细胞的凋亡,其主要途径可能是下调Survivin的表达,活化Caspase-3来实现.     

特异性siRNA抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6基因的表达

目的:研究RNAi技术抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6癌基因的表达以及对细胞生物学特性的影响。方法:构建真核细胞表达特异性shRNA的pGENESIL-1/E6(PS6)重组质粒,脂质体转染细胞后用半定量RT-PCR技术检测CaSKi细胞中E6mRNA水平的变化,然后用western blotting检测RNA干扰前后p53和p21蛋白的表达来验证RNAi效应。用透射电子显微镜观察CaSKi/PS6细胞形态变化;应用流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,最后利用细胞计数和裸鼠成瘤实验测定CaSKi/PS6细胞增殖能力。结果:成功构建了真核细胞表达特异性siRNA的PS6重组质粒;在RNA干扰24、48和72小时后CaSKi/PS6细胞中E6mRNA分别下降了21.50%、52.60%和65.60%;CaSKi/PS6细胞出现凋亡的特征性改变;RNA干扰24h、48h和72h后CaSKi/PS6细胞的凋亡率分别为27.94%、31.95%和56.63%,细胞生长周期停滞于S期。结论:应用RNA干扰技术能有效地、特异地抑制宫颈癌细胞中HPV16 E6基因的表达,为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制、临床治疗和干预性预防提供了新的方法。     

Ad.smac腺病毒的构建及其体外抗肿瘤效应的初步研究

目的 通过细菌内同源重组，制备表达全长smac基因的腺病毒，初步观察其体外对肿瘤细胞的杀伤作用。方法 构建含smac基因的腺病毒穿梭载体pAdTrack—smac，与骨架载体pAdEasyl在细菌内重组为pAd．smac，经293细胞包装为增殖缺陷性腺病毒。体外感染各种肿瘤细胞，用苔盼蓝拒染法观察其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 利用AdEasy^TM系统成功构建了Ad．smac及对照腺病毒Ad．GFP，多种肿瘤细胞感染Ad．smac后均出现细胞凋亡现象，对肿瘤细胞的杀伤率达30％以上。结论 利用细菌内质粒同源重组法可快速简捷地制备表达外源基因的腺病毒，Ad．smac在体外通过诱导细胞凋亡而有效地杀伤肿瘤细胞，为Smac在肿瘤治疗的应用提供了一定的试验参考依据。     

应用AdEasier-1系统高效制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒

背景及目的:自杀基因疗法的瓶颈之一是自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平低。利用肿瘤特异性启动子来调控自杀基因使其在肿瘤细胞中特异性表达已成为肿瘤自杀基因研究的热点。研究证实血管内皮生长因子在绝大多数实体瘤细胞中都有过量表达而在正常组织中不表达或表达甚微,其过量表达与血管内皮生长因子启动子(vascularendothelialgrowthfactorpromoter,VEGFP)活性上调有关。为研究VEGFP可否提高TK自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平,本研究应用一种高效的重组腺病毒构建系统,即AdEasier-1系统制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒。方法:VEGFP自pEGFP-1-SV-VEGFP切下后插入pAdtrack载体上构建pAdtrack-VEGFP。用HindⅢ/XbaⅠ自pREP8-TK切出带polyA加尾信号的TK基因,亚克隆到pAdtrack-VEGFP中构建转移质粒pAdtrack-VEGFP-TK。PmeⅠ酶线性化转移质粒pAdtrack-VEGFP-TK,转化含腺病毒基因组质粒pAdEasy-1的细菌AdEasier-1,用25μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-TK,经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-TK,行酶切鉴定、PCR鉴定和测序。结果:卡那霉素抗性细菌只有两种,一种含pAdEasy-VEGFP-TK(大于33kb),另一种含pAdtrack-VE     

RNAi下调AKT1、PI3K P85表达抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖

目的：探讨RNAi（RNA interference）技术抑制乳腺癌MCF7细胞中AKT1和PI3K P85亚基的表达对MCF7细胞增殖和侵袭等的影响。方法：将包含AKT1、PI3K P85两种siRNA开放阅读框的短发夹RNA（shRNA）重组腺病毒质粒表达载体rAd5siAKT1siPI3K转染至乳腺癌MCF7细胞。应用realtime PCR和Western blotting检测转染后目的基因mRNA和蛋白的表达水平,并用Western blotting检测目的基因被沉默后PCNA、cyclin D1和P53的表达情况。应用MTT法、流式细胞术、2D和3D Matrigel实验检测MCF7细胞转染前后的细胞增殖周期和侵袭能力。结果：重组腺病毒质粒表达载体rAd5siAKT1siPI3K介导的靶向〖STBX〗AKT1, PI3K P85 shRNA可以有效抑制目的基因AKT1和PI3 Kp85的mRNA和蛋白表达;下游相关因子PCNA、cyclin D1的表达亦下调,P53表达则上调。MTT法结果显示rAd5siAKT1siPI3K组细胞生长抑制率>50%,与未转染组和rAd5siCtrl转染组比较,出现明显的G1/G0细胞周期阻滞;2D和3D Matrigel实验显示,未转染组和rAd5siCtrl转染组细胞呈正常形态,而rAd5siAKT1siPI3K 转染组细胞贴壁生长能力明显减低,细胞团块明显缩小。结论：靶向AKT1、PI3K P85亚基的shRNA技术可以抑制MCF7细胞中AKT1、PI3K P85亚基的表达,抑制MCF7细胞的体外增殖。