TGF-β_1对不同阶段哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用

目的探讨TGF-β1对不同阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的作用。方法建立2周、6周哮喘大鼠模型,分别以1μg/L、10μg/L和100μg/LTGF-β1干预ASMCs生长。采用流式细胞仪、MTT法检测ASMCs增殖情况,观察不同浓度TGF-β1对ASMCs增殖的影响。结果 2周和6周哮喘组ASMCs的S期比例、A值分别为(34.31±1.41)%、(35.96±3.46)%;(0.546±0.005)、(0.559±0.009)与对照组(12.24±2.64)%、(0.289±0.009)比较均显著增高(均P0.01)。2周、6周哮喘模型组的各TGF-β1干预组ASMCs的S期比例、A值与各自哮喘组比较均显著升高(均P0.01),10μg/L和100μg/LTGF-β1组比1μg/LTGF-β1组对ASMCs增殖作用明显增加(P0.01),10μg/LTGF-β1组和100μg/LTGF-β1组相比,ASMCs增殖细胞占细胞总数的百分比无明显变化,两种浓度增殖作用无有明显差别(P0.05)。而2周和6周哮喘组相比,加入不同浓度TGF-β1干预后的差别不大(P0.05)。结论与正常鼠相比,2周和6周哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖明显,处于S期的细胞比例明显增高,6周哮喘大鼠气道平滑肌较2周哮喘大鼠增殖更明显。经TGF-β1干预后,2周和6周哮喘哮喘大鼠气道平滑肌细胞处于S期的细胞比例增加,增殖增强,提示TGF-β1可能在哮喘早期阶段即可促进大鼠气道平滑肌细胞增殖,并促进各阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞持续增殖。     

CONSTRUCTING ADENO-ASSOCIATED VIRUS-TGFβ3 AND COMPARING ITS BIOLOGICAL EFFECT ON PROTEOGLYCAN SYNTHESIS IN DEDIFFERENTIATED NUCLEUS PULPOUS CELLS WITH ADENOVIRUS-TGFβ1

Objective To construct adeno-associated virus (AAV) expression system for transforming growth factor β3 (TGFβ3) and detect its biological effect on proteoglycan synthesis of the earlier and later dedifferentiated rabbit lumbar disc nucleus pulpous (NP) cells, which was compared with that of adenovirus (AV) expression system for TGFβ1. Methods TGFβ3 gene was obtained using PCR. Its upstream contained restriction enzyme site Kpn Ⅰ, and its downstream contained restriction enzyme site SalⅠ. Using the restriction enzyme sites of PCR product of TGFβ3 and the corresponding multiple cloning site (MCS) in plasmid AAV, TGFβ3 was subcloned into AAV. The recombinant plasmid AAV-TGFβ3 was transfected into H293 cells with LipofectamineTM 2000, and the expression of TGFβ3 gene was detected using immunofluorescent analysis. After AAV-TGFβ3 virus particle with infectious activity was packaged, TGFβ3 expression in NP cells was detected by immunoblotting, and its biological effect on proteoglycan synthesis was detected by antonopulos method and compared with that of AV-TGFβ1 in the earlier and later dedifferentiated NP cells. Results For the earlier dedifferentiated NP cells, AAV-TGFβ3 slowly and stably enhanced proteoglycan synthesis, but AV-TGFβ1 rapidly and transiently enhanced its synthesis. For the later dedifferentiated NP cells, AAV-TGFβ3 stably enhanced proteoglycan synthesis, but AV-TGFβ1 inhibited its synthesis. Conclusion AAV expression system can mediate TGFβ3 gene to be expressed stably, and AAV-TGFβ3 can enhance proteoglycan synthesis of the earlier and later dedifferentiated NP cells.     

转化生长因子β1在CIN和宫颈癌的表达及其临床意义

目的探讨转化生长因子β_1在宫颈癌发生发展中的意义。方法应用免疫组化SABC技术对正常宫颈、宫颈上皮肉瘤样病变(CIN)Ⅱ～Ⅲ、宫颈浸润癌上皮细胞或癌细胞和细胞外基质中TGFβ_1的表达进行分析。结果 TGFβ_1在正常宫颈上皮细胞、CIN上皮细胞、宫颈浸润癌细胞表达的阳性率分别为100％、54.4％、27.6％(P<0.05),TGFβ_1在正常宫颈、CIN、宫颈浸润癌的细胞外基质表达的阳性率分别为36.4％、63.6％、86.2％(P<0.01)。结论 TGFβ_1在CIN上皮细胞和宫颈癌细胞中表达的明显减少,提高TGFβ_1的缺乏可能是宫颈癌恶性转化的早期标志,细胞外基质中(TGFβ_1)增多对宫颈癌的浸润和转移具有重要的意义。     

转化生长因子β1在哮喘豚鼠气道壁中的表达及牛磺酸干预的研究

目的 :初步探讨转化生长因子 β1(TGF - β1)在哮喘豚鼠气道壁中的表达和细胞来源及牛磺酸的干预效果。方法 :采用卵蛋白腹腔注射法复制哮喘豚鼠模型。实验动物分三组 :哮喘组 (A组 ) ,牛磺酸组 (B组 ) ,盐水对照组 (C组 ) ,比较三组豚鼠气道壁中TGF - β1的含量 ,粘膜下TGF - β1阳性细胞数 (mm2 )和上皮细胞TGF - β1阳性百分比。结果 :三组豚鼠气道壁中均有广泛的TGF - β1阳性表达。与C组相比 ,A组豚鼠气道壁TGF - β1含量增高显著 (P <0 .0 1) ;气道上皮细胞TGF - β1阳性百分比差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;粘膜下TGF - β1阳性细胞数差异非常显著 (P <0 ,0 1) ;B组豚鼠气道壁TGF - β1含量显著下降 (P <0 .0 1)。结论 :TGF - β1存在于正常豚鼠及哮喘豚鼠的气道壁中 ,但哮喘时含量明显增多 ,可能主要来源于粘膜下的嗜酸细胞 ;牛磺酸能下调气道壁中TGF - β1的含量。     

血清生长因子β1对肝硬化的诊断意义

目的　探讨肝硬化患者血清转化生长因子 β1(TGFβ1)水平的变化。 方法　采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定。结果　肝硬化患者血清TGFβ1水平为 4 0 .38± 5 .8ng/L ,明显高于正常对照组 2 0 .37± 3.0ng/L(P <0 .0 0 1)。结论　肝硬化患者血清TGFβ1水平明显升高 ,TGFβ1在肝硬化发病机制中起着关键作用。     

全反式维甲酸抑制TGF-β1诱导的大鼠肾系膜细胞纤维连接蛋白表达及Smad 2,3,4核转位

目的 采用转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）在体外刺激大鼠肾系膜细胞表达纤维连接蛋白（fibronectin）,观察全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,atRA）对它的作用及对TGF-β1的Smad通路的影响.方法 用Western blot方法检测TGF-β1诱导的肾系膜细胞纤维连接蛋白表达,Smad 2的磷酸化,磷酸化Smad 2、总Smad 2/3和Smad 4的核转位,以及atRA对TGF-β1的这些作用的影响.结果 atRA能抑制TGF-β1诱导的肾系膜细胞纤维连接蛋白表达.atRA对TGF-β1引起的Smad 2的磷酸化无明显作用,但atRA能部分阻断TGF-β1引起的磷酸化Smad 2、Smad 2/3和Smad 4核转位.结论 atRA体外拮抗TGF-β1的致纤维化效应可能是由其减少磷酸化Smad 2、Smad 2/3、Smad 4的核转位所致.     

TGF-β1对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响研究

目的：探究TGF-β1对哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖的影响,进一步揭示哮喘的发病机制。方法建立大鼠慢性哮喘模型,原代分离培养大鼠ASMC,将细胞分为正常组、哮喘组、TGF-β1组和TGF-β1＋PD-98059组,以CCK-8法检测细胞增殖,Western blot法检测caveolin-1和p- ERK1/2蛋白表达。结果 TGF-β1组细胞增殖较正常组和哮喘组明显（均P＜0.01）;TGF-β1＋PD-98059组细胞增殖较TGF-β1组减低,但较哮喘组仍明显（均P＜0.05）。TGF-β1组p- ERK1/2表达量较正常组和哮喘组增加;TGF-β1＋PD-98059组p- ERK1/2表达量较TGF-β1组减少,但较哮喘组表达量仍有所增加（均P＜0.05）。TGF-β1组caveolin-1表达量较正常组和哮喘组减少（均P＜0.05）;TGF-β1＋PD-98059组caveolin-1表达量较TGF-β1组增加（P＜0.05）。结论 TGF-β1可以下调caveolin-1蛋白的表达量,激活ERK通路,从而促进哮喘大鼠ASMC的增殖,引起气道重塑。     

钙库操纵的钙内流在转化生长因子-β1促进气道平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨钙库操纵的钙内流(SOCE)在转化生长因子-β1(TGF-β1)促进气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖中的作用.方法:体外培养大鼠ASMCs,以Fluo-3/AM为细胞内钙离子浓度示踪剂,观察ASMCs在TGF-β1作用后,细胞内基础钙离子浓度、钙释放和SOCE的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定TG...     

大蒜素通过增强转化生长因子β1的表达抑制平滑肌细胞增殖

目的观察大蒜素是否能够通过增强转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的表达抑制血管平滑肌细胞的增殖。方法构建表达TGF-β1 siRNA的载体、转染平滑肌细胞,通过RT-PCR和Western Blot观察TGF-β1的表达情况;通过MTT比色法检测空白组、TGF-β1 siRNA、大蒜素10μg/ml＋TGF-β1 siRNA组和大蒜素10μg/ml组在24 h,48 h和72 h内对平滑肌细胞增殖的影响;通过Western Blot检测各组在48 h后TGF-β1、激活蛋白-1（AP1）及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达情况;通过对细胞内活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）生成的检测观察各组在作用48 h后血管壁氧化应激反应情况。结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示TGF-β1 siRNA明显下调TGF-β1的表达;与其他组相比Allicin组细胞的生长显著降低（P〈0.05）,并且随时间的延长抑制作用明显加大,抑制率分别为25.13%、33.12%和43.05%;Western blot检测结果显示与其他组相比大蒜素组TGF-β1表达明显增强,而增殖相关基因AP1和PCNA的表达明显被抑制;作用48 h大蒜素组细胞内ROS为64,与其他组相比大蒜素组ROS生成明显降低。结论大蒜素可以通过增强TGF-β1的表达抑制平滑肌细胞增殖。     

高糖对原代培养人系膜细胞表达TGF—β1的影响

目的了解高糖对原代培养的人肾小球系膜细胞表达TGF—β1的影响,并进一步探讨糖尿病肾病的发病机制。方法取自愿水囊引产的胎儿肾并解剖取肾皮质剪碎,应用肾皮质组织块法合优生选择法培养人肾小球系膜细胞。以ELISA方法检测TGF-β1的表达。结果与正常组相比较,高糖组TGF-β1在24、48、72h均显著升高（P〈0．05或P〈0．01）。结论高糖能够升高系膜细胞TGF—β1分泌,这可能与肾小球系膜细胞细胞外基质积聚和糖尿病肾病发病密切相关。     

肾纤复元胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化的抑制作用及机制探讨

目的观察肾纤复元胶囊对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型的治疗作用并探讨其机制。方法将48只SD大鼠随机分为假手术（SOR）组、UUO模型组、氯沙坦治疗组（LOS组）和肾纤复元胶囊治疗组（SXFYC组）。后三组采用经典的单侧输尿管梗阻术建立肾间质纤维化大鼠模型。观察术后第7、14天各组大鼠血尿生化指标变化、肾组织病理变化，检测转化生长因子β1（TGF—β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）和纤维连接蛋白（FN）在肾组织中的表达及TGF-β1、α-SMA、ColⅠ和FN在基因水平的表达情况。结果不同组大鼠术后第7、14天24小时尿蛋白总量差异无显著性（P〉0．05），两治疗组血肌酐明显低于UUO模型组（P〈0．05），两治疗组间差异无统计学意义（P〉0．05）；光镜下肾组织病理切片显示两治疗组与同一时间点UUO模型组相比，肾间质纤维化程度显著降低（P〈0．05），两治疗组间差异无统计学意义（P〉0．05）；免疫组化和RT—PCR结果表明，两治疗组各时间点TGF—β1、α—SMA、ColⅠ和FN的表达均低于UUO模型组（P〈0．05），两治疗组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论肾纤复元胶囊可从一定程度上减轻UUO大鼠肾间质纤维化程度，其作用机制可能与下调TGF—β1和α—SMA表达、抑制ColⅠ和FN的合成有关。     

低氧对肺血管周细胞转化生长因子TGF—β1 mRNA及蛋白表达的影响

应用细胞培养、核酸分子原位杂交、免疫细胞化学、图像分析技术研究低氧对肺血管周细胞转化生长因子ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ及蛋白表达的影响,探讨低氧条件下肺血中细胞增殖、向平滑肌样细胞分化的机制。结果发现低氧（Ｈ）组周细胞内ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ及蛋白表达量分别是常氧（Ｎ）组的１．３５倍和１．２３倍,差异均有显著意义（均为Ｐ〈０．０１）。研究表明,低氧可促进肺血管周细胞ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ及蛋白表达增高     

W nt／β-连环蛋白信号通路在诱导气道平滑肌细胞外基质蛋白沉积中的作用

目的探讨Wnt／β‐连环蛋白信号通路在TGF‐β1诱导人气道平滑肌细胞（HASMC）细胞外基质（ECM ）蛋白沉积中的作用。方法将原代培养的 HASMC用于实验。用Western blot的方法来分析蛋白表达量,用实时荧光定量PCR的方法来分析ECM蛋白的基因表达。结果用TGF‐β1刺激体外培养的 HASMC ,可以引起胶原蛋白Ⅰα1（P＜0．01）及ECM 蛋白mRNA （包括胶原蛋白Ⅰα1、纤连蛋白、多功能蛋白聚糖、层粘连蛋白α2及核心蛋白多糖）表达增加（P＜0．01）。TGF‐β1可以引起β‐连环蛋白（P＜0．05）及其mRNA表达显著增加（P＜0．01）。TGF‐β1通过抑制糖原合酶激酶3（GSK3）β活化（P＜0．01）而引起非磷酸化的β‐连环蛋白表达增加（P＜0．01）。此外,用Wnt信号通路药理学抑制剂PKF115‐584可以明显抑制TGF‐β1诱导的胶原蛋白Ⅰα1（P＜0．01）及ECM蛋白（包括胶原蛋白Ⅰα1、纤连蛋白及多功能蛋白聚糖）的基因表达（P＜0．01）。结论 HASMC中Wnt／β‐连环蛋白信号通路的活化,参与了TGF‐β1诱导的ECM蛋白沉积。     

Fibulin-2调控的TGF-β/Smad信号通路在VSMCs凋亡中的作用

目的:了解腓骨蛋白-2(Fibulin-2,FBLN2)在急性Stanford A型主动脉夹层患者主动脉壁的表达情况并研究FBLN2调控的TGF-β/Smad信号通路在血管平滑肌细胞凋亡中的作用。方法:通过免疫组化染色和Western Blot检测急性Stanford A型主动脉夹层手术切除的主动脉标本FBLN2表达,并以重组FBLN2作用于体外培养的小鼠主动脉血管平滑肌细胞,通过Western Blot检测TGF-β1、Smad2/3和磷酸化Smad2/3的表达改变,同时使用A83-01阻断TGF-β1信号,观察平滑肌细胞凋亡情况。结果:FBLN2在急性Stanford A型主动脉夹层患者主动脉壁中表达显著升高(P<0.01),主要分布在主动脉中层。重组FBLN2可上调小鼠主动脉平滑肌细胞TGF-β1、pSmad2/3的表达(P<0.01),并抑制小鼠主动脉平滑肌细胞的凋亡(P<0.01)。当TGF-β1的作用被A83-01阻断时,重组FBLN2对主动脉平滑肌细胞凋亡的抑制作用显著减弱(P<0.05)。结论:FBLN2在急性Stanford A型主动脉夹层患者主动脉壁中层表达上调,并通过调控TGF-β/Smad信号通路抑制血管平滑肌细胞凋亡。FBLN2有可能参与急性Stanford A型主动脉夹层的发生。     

caveolin-1抑制转化生长因子-β1诱导的哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖

目的 探讨TGF-β1对哮喘气道平滑肌细胞增殖的影响及caveolin-1在TGF-β1诱导的哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的抑制作用.方法 离体培养大鼠气道平滑肌细胞并进行分组,用CCK-8法检测1、10、100μg/L的TGF-β1作用后及ERK通路特异性抑制剂PD98059干预后各组ASMCs的增殖情况,用Western blot法检测PD98059及β-环糊精干预后caveolin-1、p-ERK1/2蛋白表达的情况.结果 10μg/L的TGF-β1刺激ASMCs增殖的作用最为显著（P＜0.05）,PD98059干预后,ASMCs增殖明显减少（P＜0.05）.TGF-β1刺激ASMCs增殖过程中,caveolin-1蛋白表达量减少,p-ERK1/2的表达增加（P＜0.05）;使用β-环糊精破坏微囊的结构后,caveolin-1表达量减少,而p-ERK1/2表达量增加（P＜0.05）.结论 caveolin-1可以抑制TGF-β1诱导的ASMC增殖,这种抑制作用可能是通过抑制ERK1/2通路来实现的.     

碱性成纤维细胞生长因子受体的调节

检测转化生长因子β１，ＡＣＴＨ对碱性成纤维细胞生长因子受体的影响作用。方法：肾上腺皮质束网状带细胞的基础培养：＾１２５－Ｉ－ｂＦＧＦ－受体特异性结合标记；Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析。结果；２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１处理细胞２４ｈ，每个细胞上高亲和力受体６５００个，低亲和力受体数１４００００个。     

转化生长因子β1的表达与肺放射性损伤关系初步研究

目的：研究转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）在血清及组织中的表达与正常肺组织放射损伤的关系。方法：采用ＥＬＩＳＡ、免疫组化、ＨＥ染色和ＶＢ染色等方法观察血清和组织中ＴＧＦβ１的表达与放射损伤的关系。结果：照射后血清中ＴＧＦβ１平均水平均高于照射前，差别意义显著（Ｐ〈０．０５），２０Ｇｙ，３０Ｇｙ组血清ＴＧＦβ１平均水平亦高于照射前，差别意义显著（Ｐ〈０．０５），ＨＥ染色见各组均有支气管粘膜坏死脱落，２     

大鼠TGF-β1基因shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)基因短发卡RNA干扰慢病毒载体,并通过感染大鼠原代逼尿肌细胞进行鉴定。方法:根据大鼠TGF-β1基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至带荧光标签和抗性基因的慢病毒载体pHBLV上,通过转化至DH5α感受态细胞,提取阳性克隆后用DNA测序进行鉴定,选择序列正确的克隆大量扩增并提取重组的慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒和慢病毒包装的辅助质粒转染至293T细胞进行慢病毒包被,抗性筛选后通过荧光法对病毒进行滴度测定。用慢病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:设计的3种大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体经测序鉴定构建成功。使用该病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,qRT-PCR和Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,3种TGF-β1 shRNA感染组的细胞TGF-β1在mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调,其中TGF-β1 shRNA 2的蛋白敲低效率最好(57%)。结论:本研究成功构建了大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体,并在大鼠原代逼尿肌细胞中进行了鉴定,为进一步的基因治疗研究提供了可能性的基础。