脂氧素A4受体样蛋白基因的克隆与转染及其在Hela细胞的表达

目的：构建脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)基因的真核表达载体，克隆后转染Hela细胞，观察LRLP基因在Hela细胞中的表达。方法：应用PCR方法．以小鼠睾丸cDNA为模板，扩增出LRLP基因片段，插入质粒pGEM—T中，转化人大肠杆菌JM109。扩增阳性重组质粒，经酶切后纯化并测序鉴定目的片段。构建含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP／LRLP，转化人大肠杆菌JM109扩增．酶切后再测序鉴定目的片段，抽提质粒后瞬时转染Hela细胞，置激光共聚焦显微镜下照像。结果：测序鉴定表明．克隆的LRLP序列与GenBank中LRLP原序列100％．符合，激光共聚焦显微镜下见Hela细胞中LRLP基因表达。结论：成功地构建了真核表达载体pEGFP／LRLP，并转染了Hela细胞。     

IkB—α基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆IkB-α基因，构建IkB-α的真核表达载体，方法：RT－PCR扩增IkB-α的cDNA，然后将其克隆入真核表达载体pShuttle，并转入大肠杆菌JM109。结果：通过PCR和重组质粒酶切分析等方法，筛选出重组阳性克隆。结论：此重组质粒可用于真核表达等进一步研究。     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

rhIL-12逆转录病毒双亚基共表达载体的转化和鉴定

目的以人白细胞介素-12（IL—12）双亚基共表达载体pL35P40SN转化大肠杆菌DH5α，并对转化载体进行鉴定。方法以构建好的IL-12双亚基共表达载体pL35P40SN及其对照载体pLXPXSN转化大肠杆菌DH5α，氨苄抗性平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒并对其进行酶切及PCR鉴定。结果以XhoI酶切后鉴定，对照载体和IL-12共表达载体的条带分别在6490bp和8800bp的位置，以IL-12p35和P40引物PCR扩增后电泳鉴定，在700bp和1000bp处可见清亮电泳条带。结论含IL-12p35和p40双亚基基因的pL35P40SN载体成功转入大肠杆菌DH5α，经多项鉴定结果正确。为以其转染细胞并对IL-12的功能研究打下良好基础。     

转FasL基因卵巢癌HO-8910细胞系的建立

目的建立表达转FasL基因卵巢癌细胞系,为以FasL为靶点治疗卵巢癌提供理想细胞模型。方法应用分子克隆技术,将人FasL cDNA片段正向插入逆转录病毒载体pLXSN构建重组质粒pL(hFasL)SN,转染包装细胞PA317收获假病毒上清,磷酸钙法转染卵巢癌HO-8910细胞筛选建系,酶切PCR鉴定、流式细胞仪(FCM)法检测。结果酶切鉴定证实重组质粒pL(hFasL)SN中存在FasL,PCR方法从转染细胞HO-8910-FasL基因组中扩增出0．86kb片段,FCM检测显示FasL表达增加40．32％,HL-60细胞与HO-8910-FasL细胞共培养HL-60细胞凋亡增加25．65％。结论应用逆转录病毒法建立了稳定高表达FasL并具功能的HO-8910-FasL细胞系。     

含脂氧素A4受体同源基因真核表达载体的构建与转染系膜细胞

目的构建小鼠脂氧素A4受体同源基因(LRHG)的真核表达载体,克隆后转染小鼠肾小球系膜细胞,观察LRHG编码的脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)在系膜细胞中的表达.方法应用PCR方法,以小鼠睾丸cDNA为模板,扩增出LRHG基因片段,插入质粒pGEM-T中,转化入大肠杆菌JM109.扩增阳性重组质粒,经酶切后纯化并测序鉴定目的片段.构建含6×组氨酸(His)基因的真核表达载体pcDNA3.1/LRHG-his,转化入大肠杆菌JM109扩增,酶切后再测序鉴定目的片段,抽提质粒后转染系膜细胞,进行Western blot鉴定LRLP的表达.结果测序鉴定表明,克隆的LRHG序列与GenBank中LRHG原序列100%符合,应用抗6×His抗体进行Western blot鉴定系膜细胞中有LR-LP的表达.结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/LRHG-his,并转染了肾小球系膜细胞,获得了稳定的表达.     

慢性粒细胞白血病MGMT基因的克隆及逆转录病毒表达载体的构建

目的：从慢性粒细胞白血病病人外周血中克隆人MGMT基因，并进行逆转录病毒表达载体的构建。方法：用RT－PCR方法从慢性粒细胞白血病病人外周血白细胞中克隆得到长为684bp MGMTcDNA。将该片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，进行限制性内切酶酶切分析、PCR及测序鉴定。再将MGMTcDNA亚克隆到GlNa逆转录病毒载体EcoRI和xhoI位点之间，并进行酶切、PCR鉴定。结果：成功克隆了人MGMT基因，经酶切分析、PCR初步筛选及测序鉴定证实序列正确，并成功构建到逆转录病毒载体上。结论：通过克隆人MGMT基因，并构建逆转录病毒载体GlNa-MGMT，为探讨将耐药基因导入造血干细胞对烷化剂类化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

人IL-16在大肠杆菌中的融和表达

目的 将人IL－16 cDNA克隆至原核融合表达载体Pinpoint^TM Xa-3上，并进行表达研究。方法 含IL－16 cDNA的质粒IL－16／PGEM－3ZF（＋）和Pinpoint^TM Xa－3原核融合表达载体经酶切消化、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作，获得重组质粒Pinpoint^TM－IL－16，将质粒Pinpoint^TMXa-IL-16转化至大肠杆菌JM109，用IPTG诱导表达JM109工程菌，Western blotting检测表达产物。结果 IL－16 cDNA成功克隆至融合表达载体Pinpoint^TM Xa-3,Western blotting检测经诱导含有Pinpoint^TM Xa－IL－16质粒的JM109细菌，有IL－16融合蛋白的表达。结论 成功地表达了IL－16融合蛋白。     

野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型ｐ５３基因逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体介导，将野生型ｐ５３基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１ｄ后观察其对新生内膜形成的影响，并检测ｐ５３蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型ｐ５３基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中表达；用逆转录病毒载体转导野生型ｐ５３基因至大鼠球囊损伤的颈动脉，免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型ｐ５３蛋白，且与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４４％。结论人野生型ｐ５３基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用     

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体.方法利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES-EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1-IRES-EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP E86和PA317,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;"乒乓球"法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT-PCR法分别检测细胞荧光和Delta1 mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能.结果酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1-IRES-EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9.7×105 CFU/ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT-PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化.结论逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达.     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.     

人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定

目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231，观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231细胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA，所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组质粒poDNA3K5，脂质体法将其转染MDA—MB—231，G418筛选阳性克隆，PCR鉴定，RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞，MTT、法检测其增殖情况，并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确，将其转染MDA-MB-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确，并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞后，其存活率降低；转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA-MB-231细胞后，其分泌产生的有生物学活性的K5，呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用，而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定

目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫ｃＤＮＡ文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫ｃＤＮＡ文库基因的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转染大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经抗生素及呈色底物Ｘ－ｇａｌ粗筛,再用限制性内切酶及ＰＣＲ方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中４个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中,获得４个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。     

BDNF基因逆转录表达载体的构建和在淋巴细胞中的表达

【目的】构建含脑源性神经营养因子基因(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNFgene)逆转录表达载体并了解其在淋巴细胞中的表达,探讨治疗基因的非损伤性脑内转移的新途径。【方法】用RT-PCR方法从大鼠海马组织总RNA中扩增(cDNA)BDNF片段,应用基因重组技术将大鼠(cDNA)BDNF克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒进行鉴定,采用LipofectAMINE将重组大鼠(cDNA)BDNF导入PA317细胞,获取高滴度的病毒上清转染大鼠淋巴细胞,应用流式细胞仪(FCM)检测大鼠淋巴细胞BDNF的表达,噻唑蓝(MTT)法检测淋巴细胞培养上清对PC12细胞增殖的影响。【结果】扩增出大鼠(cDNA)BDNF片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pLXSN-BDNF,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达BDNF蛋白,其培养上清能促进PC12细胞增殖。【结论】成功构建了BDNF基因逆转录表达载体,BDNF基因修饰的大鼠淋巴细胞能高表达和分泌具有生物活性的BDNF蛋白,为治疗基因的非损伤性脑内转移奠定了一定基础。     

日本血吸虫14-3-3蛋白epsilon亚型基因扩增及表达载体的构建

目的　扩增日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建其表达载体 ,以研究其在血吸虫信号转导以及免疫预防和诊断方面的作用。方法　以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,设计合成引物 ,用PCR法扩增 1 4 3 3蛋白epsilon亚型基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,双酶切和以质粒为模板的PCR鉴定后 ,将基因片段亚克隆入表达载体pBK CMV ,转染大肠杆菌BL2 1 ,经双酶切后鉴定。结果　RT PCR扩增出一条约 753bp的特异性条带 ,TA克隆重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT PCR扩增出大小相同条带 ,pBK Sj1 4 3 3表达载体经双酶切后也同样获得了一条约 753bp的特异性条带。 结论　在体外成功的扩增了日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建了 pBK Sj1 4 3 3表达载体 ,为进一步的免疫预防和免疫诊断研究提供了条件。     

幽门螺杆菌CagA基因的克隆

目的 为在大肠杆菌表达幽门螺杆菌ＣａｇＡ蛋白,建立ＥＬＩＳＡ法检测ＣａｇＡ抗体,克隆幽门螺杆菌ｃａｇＡ基因片段。方法 根据ｃａｇＡ基因序列,设计引物ＰＣＲ扩增ｃａｇＡ基因片段,用Ｔ－Ａ克隆的方法将ＰＣＲ产物克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ,并转化大肠杆菌ＪＭＩ１０９。结果 经蓝白斑筛选,ＰＣＲ及限制性内切酶酶切分析,获得ｃａｇＡ基因片段的克隆,序列测定结果与文献报道一致。结论 ＰＣＲ产物可采用Ｔ－Ａ法克     

小鼠24p3基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠24p3基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH3T3细胞中24p3/SIP24蛋白的表达情况,初步鉴定24p3/SIP24蛋白介导铁向细胞内转运的生物学功能.方法RT-PCR自小鼠肺组织中克隆24p3 cDNA.用基因重组技术构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体并行酶切和测序鉴定.脂质体DOTAP方法转染NIH3T3细胞,48 h后用G418筛选阳性克隆并培养扩增至21 d.对阳性克隆的培养基上清中24p3/SIP24蛋白的表达用ELISA和Westernblot分析,进一步用原子吸收分光光谱观察其介导铁向NIH3T3细胞内转运的生物学功能.结果成功克隆24p3cDNA并构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体,筛选出稳定表达24p3/SIP24蛋白的NIH3T3细胞株,24p3/SIP24蛋白在NIH3T3细胞上清中获得表达,并能介导铁向NIH3T3细胞内转运.结论24p3基因在NIH3T3细胞中获得表达,有良好的生物学活性,为进一步研究24p3/SIP24蛋白介导铁转运的生物学功能及作用机制奠定了基础.