黄精炮制前后寡糖与单糖类成分含量变化与转化机制研究

目的:比较黄精不同炮制品中单糖(D-果糖、D-葡萄糖)和寡糖(D-蔗糖、棉子糖、蜜二糖、D-木糖)的含量,探讨其在炮制过程中的转化机制。方法:色谱柱为Ultimate HILIC-NH_2(250 mm×4.6 mm,5μm)柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱;漂移管温度为100℃;载气流速为1.8 L/min;HPLC法测定生黄精、酒蒸黄精、炆黄精中6种糖类成分的含量。制备黄精酒蒸和炆制质变糖类成分(D-蔗糖、棉子糖、蜜二糖),模拟酒蒸品与炆制品,通过已知对照品定位,分析模拟炮制品的化学成分,探讨炮制过程中质变化合物转化机制。结果:黄精经酒蒸和炆制后,D-蔗糖、棉子糖、蜜二糖含量均有不同程度降低,D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖含量明显增加;在D-蔗糖模拟炮制品中检出D-果糖和D-葡萄糖,在棉子糖模拟炮制品中检出D-果糖、D-葡萄糖、蜜二糖和半乳糖,在蜜二糖模拟炮制品中检出半乳糖和D-葡萄糖。结论:黄精经酒蒸和炆制后单糖和寡糖类成分含量发生明显变化,寡糖类成分D-蔗糖、棉子糖、蜜二糖在炮制过程中均产生质变,水解为其对应的单糖和(或)双糖。     

辅料砂仁、陈皮对熟地黄炮制前后化学成分的影响研究

目的分析不同砂仁陈皮制熟地黄炮制前后的化学成分含量变化,探讨辅料砂仁、陈皮在熟地黄加工过程中的炮制作用。方法采用HPLC法建立生地黄、砂仁陈皮制熟地黄及缺不同辅料熟地黄炮制品图谱,结合《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)、SPSS 21.0、SIMCA 14.1软件进行分析,并对7个非糖成分(梓醇、地黄苷D、5-羟甲基糠醛、益母草苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、橙皮苷)和8个糖类成分(D-果糖、葡萄糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、毛蕊花糖)进行含量测定。结果生地黄、砂仁陈皮制熟地黄与缺不同辅料砂仁陈皮制熟地黄炮制品在成分空间上存在差异;含量测定结果表明,生地黄炮制后,单糖含量增加,寡糖、苷类含量总体呈减少趋势,生、熟地黄之间以及佐以砂仁、陈皮都使地黄成分含量存在差别,且砂仁陈皮制熟地黄中D-果糖、葡萄糖、甘露三糖含量相较于砂仁陈皮制熟地黄(缺砂仁、缺陈皮)分别增加了29.24%、57.14%、44.65%。结论辅料砂仁、陈皮的加入是其化学成分含量变化的重要因素,为阐述砂仁陈皮制熟地黄的炮制机制提供依据。     

HPLC-ELSD法测定黄精炮制过程中四种糖的含量

目的:比较三种黄精炮制过程中四种糖的含量变化。方法:采用HPLC-ELSD法对三种黄精不同炮制过程中果糖、葡萄糖、蔗糖、水苏糖含量进行测定。色谱柱为奥泰PrevailTMCarbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱;流速为0.9 m L·min~(-1);柱温为35℃;漂移管温度为105℃;载气流速为2.5 L·min~(-1)。结果:果糖和葡萄糖含量随炮制时间增加而增加,蔗糖含量基本不变,水苏糖含量随炮制时间增加而减少。结论:不同炮制方法炮制过程中糖类成分的变化有差异,为进一步揭示黄精的炮制机理提供参考。     

HPLC-ELSD特征图谱分析地黄炮制过程成分变化

建立地黄及熟地黄HPLC特征图谱分析方法,并对其化学成分进行分析比较,揭示地黄炮制过程成分变化规律。采用HPLC-ELSD,色谱柱为Prevail Carbohydrate ES(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱,蒸发光散射检测器检测。对23批次地黄样品、25批次熟地黄样品及炮制动态样品进行比较。建立的特征图谱分析方法重复性、精密度、稳定性良好,从23批次地黄样品中提取8个共有色谱峰,25批次熟地黄样品中提取8个共有色谱峰,指认了7个色谱峰。地黄炮制过程成分比例发生较大变化,当相似度≥0.95,同时果糖峰面积为水苏糖2倍以上或果糖峰面积为棉籽糖20倍以上时的炮制程度符合经验鉴别要求。生地黄的3个主要寡糖成分,蔗糖受热生成果糖与葡萄糖,棉籽糖受热生成蜜二糖、蔗糖和果糖,水苏糖受热主要生成甘露三糖。单糖和寡糖类成分间的比例变化指标,可作为熟地黄炮制质量量化的判定标准。     

酒炖法制熟地黄炮制工艺优化研究

目的 对酒炖法制熟地黄的炮制工艺进行优化。方法 采用正交实验的方法,以加酒量、蒸制时间、蒸制次数及干燥温度为考察因素,以果糖、葡萄糖、蔗糖、密二糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖、毛蕊花糖苷及5-羟甲基糠醛含量的综合评分为指标,优化酒炖法制熟地黄的炮制工艺。结果 酒炖法制熟地黄的最佳炮制工艺为,生地黄以0.4倍黄酒回润后,常压蒸制2次,每次4 h,并在60℃条件下进行干燥。结论 经优化后的酒炖法制熟地黄炮制工艺切实可行,既可保证熟地黄的成品质量,又适用于工业化大生产的需求。     

丹参注射液中糖类化学成分在制备工艺条件下的转化

目的研究丹参注射液中糖类化学成分在制备工艺条件下的成分转化。方法采用大孔吸附树脂、NH2柱色谱分离和NMR技术对丹参滴注液中糖类成分进行分离及鉴定,并以HPLC法对水苏糖在不同pH条件下的水解产物进行分析。结果从丹参滴注液中共分离鉴定了4个糖类化合物,分别为葡萄糖、果糖、甘露三糖和水苏糖,其中甘露三糖是在制备工艺条件下由水苏糖水解而来。结论糖类成分是丹参滴注液中一类重要化学成分,可以作为制剂质量评价辅助指标。     

不同灭菌方法对地麦活性糖中4种糖类成分及微生物的影响

目的:考察不同灭菌方法对地麦活性糖中4种糖类成分含量及微生物数量的影响.方法:采用HPLC-ELSD方法,分别检测煮沸30、60、90、120m in,100℃流通蒸汽灭菌30min(添加或不添加防腐剂苯甲酸钠、羟苯乙酯或山梨酸)、60 min、 120 min,120℃流通蒸汽灭菌15 min,10 kGy 60Co-γ射线辐照12h前后地麦活性糖中果糖、蔗糖、棉子糖和水苏糖含量,并参照2020年版《中华人民共和国药典》微生物限度检查方法,检测需氧菌总数,霉菌和酵母菌总数,以及大肠埃希菌总数的变化.结果:煮沸30、60、90、120 min和100℃流通蒸汽灭菌30、60、120min均能明显减少微生物数量,随着灭菌时间增加,果糖含量增加,蔗糖、棉子糖和水苏糖含量降低;防腐剂对4种糖类成分含量无影响;120℃流通蒸汽灭菌15 min,果糖含量明显增加,水苏糖含量和微生物数量均明显降低;10 kGy 60Co-γ射线辐照能明显减少微生物数量,而不影响4种糖类成分含量.结论:100℃流通蒸汽灭菌30m in和10 kGy 60Co-γ射线辐照均能有效杀灭地麦活性糖中微生物,而不影响4种糖类成分含量,苯甲酸钠或羟苯乙酯可用作地麦活性糖的防腐剂.     

不同储藏年限地黄化学成分分析

目的分析不同储藏年限地黄的化学成分。方法对地黄中氨基酸含有量进行分析,硫酸-苯酚法测定地黄总多糖含有量,HPLC法测定毛蕊花糖苷、环烯醚萜苷类、单糖、寡糖含有量。结果随着储存时间增加,总氨基酸含有量下降,其中碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸幅度较大;棉籽糖、水苏糖、总多糖含有量逐年降低,果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露三糖含有量呈现先增后减的趋势,蜜二糖含有量基本平稳;单糖中半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖随着储存时间的增加含有量逐年增加,环烯醚萜苷类成分梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷随着储藏年限的延长,成分逐渐降低;毛蕊花糖苷含有量也是下降的。结论随着地黄储藏年限的增加,断面越来越黑,大多数成分含有量在储藏3年后趋于平稳。     

地黄在加工炮制过程中HPLC谱图的变化

目的 考察地黄在加工炮制过程中糖类成分的变化。方法 在加工炮制的4个不同阶段(65℃烘焙0，1和6d，以及烘干样品切片后常压蒸制4h)取样，热水提取。色谱条件为：Sugar—pak—1型阳离子凝胶柱(柱温80℃)，水为流动相(流速为0．7mL／min)，示差折光检测器检测。结果 鲜地黄中有3种主要成分，分别为水苏糖(11％～15％)、蔗糖(0．30％～0．92％)和梓醇(0．27％～0．88％)。经过加工炮制，不同阶段的HPLC色谱图发生了显著变化。烘焙1d后出现一个显著的单糖峰(保留时间为10．2min，推定为半乳糖)，生地黄中该峰更加显著，同时出现了棉子糖的色谱峰。熟地黄中，果糖和葡萄糖的色谱峰十分显著。结论 根据HPLC色谱图的变化，认为在烘焙阶段，鲜地黄中水苏糖发生了脱半乳糖反应，而在炮制熟地黄时，由于蒸制又发生了脱果糖反应。地黄加工炮制的主要目的之一可能在于使水苏糖降解，减轻胀气副作用。     

丹参提取工艺过程中糖类成分变化趋势

目的:分析5种糖类成分(葡萄糖、果糖、蔗糖、棉籽糖、水苏糖)在丹参提取工艺过程中含量的变化情况,为丹参提取工艺质量评价提供参考。方法:采用建立的超高效液相色谱-蒸发光散射检测法(UPLC-ELSD),测定丹参提取过程中提取、浓缩、醇沉、收膏工序5种糖成分含量及转移率,并对不同糖成分含量与相对分子质量相关关系进行研究。结果:对不同年份丹参提取物5种糖成分测定结果显示,总糖平均质量分数为40.5%,批次间波动较小,其中水苏糖质量分数最高,为24.70%;各工序糖成分转移率结果显示,单糖(果糖、葡萄糖)与二糖(蔗糖)总转移率分别为38.51%、36.41%、34.92%,转移情况相当,而三糖(棉子糖)和四糖(水苏糖)总转移率分别为22.69%、12.06%,下降幅度增加。醇沉方式同样影响糖成分转移。结论:醇沉工艺能够有效降低丹参提取物糖成分含量,且不同相对分子质量糖成分含量可以表征水提醇沉工艺方式差异与质量一致性评价。     

怀地黄药材HPLC指纹图谱研究

目的: 建立怀地黄药材的HPLC指纹图谱,为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。 方法: 采用HPLC梯度洗脱法,对怀地黄药材进行测定,色谱条件,Dikma DiamonsilC₁₈柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,乙腈-0.1%磷酸水系统梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,柱温35℃,检测波长205 nm。 结果: 标定了13个共有峰,建立了HPLC指纹图谱,该图谱的相关系数均在0.99以上。 结论: 该方法精确可靠,重复性好,可为控制怀地黄药材内在质量提供科学依据。     

地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶,在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。根据地黄转录组数据,克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列(GenBank登录号KU640395),并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量。结果表明,RgTyDC ORF为1 619 bp,编码509个氨基酸,相对分子质量为56.6 kDa,等电点pI 6.25。RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性最高,均为88%。RgTyDC基因在叶片(尤其是衰老的叶片)中表达量较强,在块根中表达量较低。SA和MeJA处理后显著上调表达。这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础。     

地黄地上部分中一个新苯甲醛类化合物

运用各种色谱技术对玄参科地黄属植物地黄的地上部分进行分离纯化,从中分离得到7个化合物,根据理化性质和波谱数据分别鉴定为3-hydroxy-4-(4-(2-hydroxyethyl)phenoxy)benzaldehyde(1),异香草酸(isovanillic acid,2),邻苯二酚(pyrocatechol,3),glutinosalactone A(4),金圣草黄素(chrysoeriol,5),芹菜素(apigenin,6),木犀草素(luteolin,7),其中化合物1为新化合物.     

真菌诱导子对怀地黄组培苗生长及次生代谢产物合成的影响

目的:研究分离自地黄不同部位的内生真菌诱导子对怀地黄组培苗生长及其次生代谢产物含量的影响,初步探究其促生作用。方法:以2株Alternaria属内生真菌A.alternata,Penicillium属内生真菌P.axalicum制备不同类型的诱导子,发酵液滤液和菌丝降解液,分别考察其对地黄组培苗株高、鲜重、叶绿素含量、梓醇及毛蕊花糖苷含量的影响,并用SPSS 17.0进行数据分析。高效液相色谱法测定梓醇及毛蕊花糖苷含量。结果:不同菌株制备的真菌诱导子促生作用差异明显,以Penicillium属内生真菌P.axalicum制备的真菌诱导子对怀地黄组培苗促生效果较佳,且以其发酵液滤液促生效果最好。在该培养条件下,怀地黄组培苗株高、鲜重、根长、总叶绿素、梓醇及毛蕊花糖苷含量增加率分别为27.80%,29.49%,22.08%,15.05%,35.98%和68.18%。结论:内生真菌诱导子可促进怀地黄组培苗生长,并提高其次生代谢产物含量,在今后地黄内生真菌应用中可做进一步探究。     

江西建昌帮炆制地黄中辅料作用探索(Ⅰ)

目的:建立HPLC-ELSD测定熟地黄中单糖与低聚糖含量的方法,研究江西建昌帮炊制地黄过程中炮制辅料的作用.方法:采用HPLC测定地黄中单糖和低聚糖的含量,以蒸发光散射检测器进行检测,prevail carbohydrate ES色谱柱(4.6mm ×250 mm,5μm),考察辅料对建昌帮炊制地黄的影响.结果:炊制地黄中单糖含量高于各缺辅料炆制品,但其低聚糖含量低于各缺辅料炆制品.炆制地黄、炆制地黄(缺砂仁)、炆制地黄(缺砂仁与陈皮)、炆制地黄(缺砂仁、陈皮与黄酒)、炆制地黄(缺黄酒)、炆制地黄(缺陈皮)中单糖质量分数分别为(23.46±1.07)％,(21.81±0.94)％,(15.83±1.01)％,(14.14±0.58)％,(21.91±0.76)％,(21.53±0.84)％;低聚糖质量分数分别为(3.02±0.25)％,(3.29±0.17)％,(11.73±0.64)％,(14.33 ±0.83)％,(6.17 ±0.38)％,(3.77±0.19)％.结论:建立的含量测定方法操作简便、稳定、准确;辅料砂仁、陈皮与黄酒会影响熟地黄炮制过程中化学成分的变化,为阐明其炮制机制提供实验依据.     

地黄植株体内miRNAs与其连作障碍关系的研究进展

MicroRNAs是一类内源性小分子的非编码RNA,它通过对其靶基因的降解或抑制翻译来调控基因表达,进而调控植物的生理活动。植物在遇到逆境胁迫时,miRNAs会作用于与逆境相关的基因,启动体内的抗逆机制抵抗不利因素。地黄的连作障碍也是一种胁迫,从miRNAs水平上研究,有利于解读地黄连作障碍的分子机制。该文对地黄体内miRNAs的功能及调控机制进行了综述,并对miRNAs在地黄的研究中进行了展望。     

地黄根系分泌物中毛蕊花糖苷招募的根际微生物群落结构及功能

目的 鉴定地黄根系分泌物并研究其招募的特定根际微生物种群及功能,探讨地黄-土壤反馈调节模式与其连作障碍形成间的关系。方法 通过超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析无菌条件下地黄幼苗胚根分泌物及大田地黄根际土壤中富集的根系分泌物;以相对含量较高的化合物为根系分泌物表征物进行土壤外源添加实验,采用Illumina Miseq高通量测序技术分析土壤微生物群落结构,并通过PICRUSt和FUNGuild分别进行细菌和真菌的功能预测。结果 地黄根系分泌物中存在7种苯乙醇苷类化合物,毛蕊花糖苷含量显著高于其他6种。通过外源添加根系分泌物实验发现在毛蕊花糖苷富集的土壤中细菌属水平上表现为Agromyces、Pseudomonas、Lysobacter、Sphingobium、Pseudoxanthomonas、Sphingomonas等优势种群的形成;真菌种属水平上表现为Neocosmospora、Plectosphaerella和Dactylonectria;以及Neocosmospora rubicola、Plectosphaerella cucumerina、Dactylonectria alcacerensis和Fusarium solani等物种的富集。功能预测分析发现上述细菌种群可能通过利用、降解和转化苯乙醇苷类化合物实现自身的快速增殖,而一些潜在真菌性病原菌也成为了优势种。结论 地黄根系分泌物中苯乙醇苷类化合物可通过介导特定微生物种群的根际定植建立地黄-土壤反馈调节模式。对连续单一化栽培模式下地黄-土壤反馈调节模式的转变机制进行深入研究,或将为解读其连作障碍形成过程提供新的思路。     

基于UPLC-TQ-MS的地黄中核苷类和氨基酸类成分动态积累研究

目的 分析评价地黄Rehmannia glutinosa根与叶中5种核苷与14种氨基酸类成分,揭示其动态积累规律,为其合理利用提供科学依据。方法 选取不同生长期的地黄根和叶以及不同产地（河南大封、河南温县、河南南召）的地黄叶为研究对象,采用超高效液相色谱-三重四极质谱联用技术（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry,UPLC-TQ-MS）分析不同生长期地黄根和叶以及不同产地地黄叶中核苷类与氨基酸类成分的动态变化。结果 研究发现地黄根及地黄叶中均含有5种核苷类成分和14种氨基酸类成分,2部位中不同生长期2类成分的总含量分别为3.88～16.97 mg/g和4.27～25.32 mg/g;地黄根和叶中测得的2类成分总量分别在10月中下旬和11月上中旬显著升高,达到各自峰值,其中L-谷氨酰胺与L-赖氨酸含量最高,占总含量的60%以上;大部分生长期地黄叶中核苷类和氨基酸类成分较地黄根高,尤其在10月下旬;不同产地地黄叶中以河南南召产者核苷和氨基酸含量较高,总含量最高可达30.756 mg/g。结论 阐明了地黄中核苷类和氨基酸类成分的分布和动态积累过程,为地黄药食两用特性及合理采收期提供了科学依据,提出了地黄叶可作为新的食用新资源为机体补充核苷类和氨基酸类成分的建议,为地黄叶资源价值的发现、开发和利用提供了支撑。     

根癌农杆菌介导的怀地黄遗传转化研究

目的研究适于怀地黄Rehmannia glutinosa遗传转化的激素质量浓度和潮霉素质量浓度。方法以地黄无菌苗叶片为外植体,以根癌农杆菌介导的叶盘法进行转化,分析了潮霉素和乙酰丁香酮(AS)对抗性愈伤诱导率和再生芽分化效率的影响。结果潮霉素的质量浓度对抗性愈伤和抗性芽的产生影响很大,影响抗性愈伤诱导的临界质量浓度为9 mg/L,影响抗性芽分化的临界质量浓度为6 mg/L,适宜于进行地黄遗传转化的质量浓度为12 mg/L。侵染培养基和共培养培养基中添加100μmol/L的AS可以极显著提高转化效率。PCR扩增和β-葡萄糖苷酶(GUS)染色结果表明,外源基因成功整合到地黄基因组中。结论建立了有效的怀地黄稳定遗传转化再生体系,为地黄的分子生药学研究和遗传改良奠定基础。     

不同品种地黄中毛蕊花糖苷的动态积累规律变化

目的:对大田生长期间不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量进行测定,研究道地产区不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷的积累规律。方法:以栽培地黄85-5,北京1号,沁怀,金九和白选为材料,于2015年和2016年在河南温县大田栽培,以HPLC检测不同采收期不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷的含量。并以85-5为材料,于2014年进行遮阴处理,以HPLC检测遮阴后地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量。结果:不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷含量有较大差异,块根中毛蕊花糖苷含量较高的2个品种是白选和沁怀,两年内毛蕊花糖苷含量变化分别为0.023%~0.620%和0.018%~0.796%;叶片中毛蕊花糖苷含量较高的品种为85-5和北京1号,毛蕊花糖苷含量变化分别为1.955%~5.968%和0.681%~5.941%。不同发育阶段的地黄叶片中,展开叶和衰老叶较幼嫩叶含有较高的毛蕊花糖苷。遮阴对地黄块根中毛蕊花糖苷含量有促进作用,对叶片中毛蕊花糖苷含量有抑制效应。结论:该研究为毛蕊花糖苷高含量地黄新品种的选育提供实验材料和依据,同时也为明确地黄毛蕊花糖苷积累变化的分子机制奠定基础。