hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。     

生长分化因子5基因转染诱导骨髓基质干细胞分化的研究

目的 探讨人生长分化因子5(GDF5)基因转染对骨髓基质干细胞(BMSCs)生长及分化的影响.方法 采用脂质体介导法将GDF5基因导人人BMSCs,通过MTT法和流式细胞仪分别检测细胞增殖能力和细胞周期,在光镜和电镜水平观察细胞形态,用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法榆测GDF5和Ⅱ型胶原mRNA和蛋白质的表达.柠檬酸铅法检测细胞碱性磷酸酶活性,RT-PCR法检测骨钙素mRNA表达.结果 GDF5在转染细胞内得到稳定表达,转染细胞的增殖能力和细胞周期与未转染细胞基本一致.光镜下转染细胞中多角形细胞相对增多,排列方式不规则.电镜下转染细胞核呈不规则形,细胞器丰富.转染细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达阳性,骨钙素mRNA表达阴性.结论 GDF5基因脂质体法转染BMSCs成功,转染细胞仍保持正常生长增殖特性.GDF5可诱导BMSCs向软骨表型分化,GDF5基因修饰的BMSCs可作为软骨组织上程的候选种子细胞.     

TGF-β1基因转染对间充质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对间充质干细胞(MSCs)增殖、向成软骨方向定向分化等生物学行为的调控作用及其机制。方法 体外将具有促进MSCs增殖分化及抑制多种炎性介质活性等多重生物学效应的TGF-β1基因以不同剂量转入MSCs，通过免疫组化、R3T-PCR、水貂肺上皮细胞生长抑制法、^3H-TdR、Na2^35SO4掺入法、流式细胞仪Ⅱ型胶原原位杂交及透射电镜等系列方法检测TGF-β1基因转染的瞬时和稳定表达情况，分析TGF-β1基因转染对MSCs增殖和向成软骨方向定向分化的调控及其作用机制.结果 TGF-β1基因转人MSCs能获得瞬时及稳定表述．表达产物具有生物活性；3μl脂质体介导1μg TGF-β1基因转染能获得最佳促MSCs增殖及蛋白多糖，Ⅱ型胶原合成效应；TGF-β1基因转染能显著抑制IL-1对羟脯氨酸合成的降解作用，结论 MSCs能作为基因治疗的受体细胞并可稳定高效表达具有生物学活性的TGF-β1；通过增强增殖细胞核抗原表达来提高S期细胞DNA含量，促进软骨特异性细胞外基质合成,从而促进MSCs增殖并调控其向成软骨方向定向分化、抑制多种炎性介质生物学活性以保护关节软骨．使提高关节软骨缺损的修复质量成为可能．     

血管内皮生长因子重组腺病毒转染鼠骨髓基质细胞及其产物促内皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165(VEGF165)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后对VEGF基因的转录、表达及其产物生物活性的影响。方法体外培养4只大鼠骨髓基质细胞,用携带VEGF165基因的重组腺病毒转染培养细胞;通过逆转录聚合酶链反应、免疫印记法和酶联免疫吸附法检测VEGF在转染细胞内的转录、表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞增殖实验测定转染VEGF165基因后的BMSCs培养上清中VEGF蛋白的生物活性。结果腺病毒介导VEGF165基因转染BMSCs后可以获得有效的转录及表达,其分泌于培养上清中的表达产物可明显促进大鼠主动脉血管内皮细胞的增殖(P<001),具有很强的生物学活性。结论腺病毒可安全、有效地转染BMSCs,VEGF165基因转染的鼠BMSCs可有效表达具有生物活性的VEGF蛋白。     

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

骨保护蛋白基因转染成骨细胞后的表达及对其生物学行为的影响

目的 将人骨保护蛋白(OPG)基因转入体外培养的人成骨细胞,研究OPG基因在转染成骨细胞中的表达,并分析OPG基因转染对成骨细胞生物学行为的影响.方法 首先行人成骨细胞体外培养,然后用质粒peDNA3.1-hOPG转染成骨细胞,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测转染细胞OPG mRNA和蛋白质的表达.观察OPG基因转染后成骨细胞的增殖情况,对成骨细胞表达的碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的含量进行检测,观察转基因细胞的生物学特性.结果 RT-PCR和Western blot检测结果表明在OPG基因转染后,成骨细胞表达的OPGmRNA和蛋白质含量均较未转染组增加.在OPG基因转染后,可明显促进成骨细胞的增殖,成骨细胞表达的ALP和BGP的含量均显著上升,而且在量效图中可以观察到随着OPG基因转染剂量增加,其增加程度也增加.结论 成骨细胞可作为转基因的受体细胞,成功表达目的 基因.转染OPG基因的成骨细胞可稳定、高效的表达OPG.OPG基因转染成骨细胞生物学特性稳定,而且可明显促进转染成骨细胞的成骨特性的表达.     

大鼠骨髓间充质干细胞经低氧诱导因子-1α基因转染后的生物学特性

目的 评价大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)经低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染后的生物学特性.方法 将构建好的HIF-1α基因表达载体(pcDNA3.1-HIF-1α)运用电穿孔法转染入第3代BMSCs中得到稳定表达HIF-1α的BMSCs( BMSCs-HIF-1α细胞).以单纯BMSCs和电转染pcDNA3.1的BMSCs( BMSCs-pcDNA3.1细胞)作为对照.采用免疫细胞化学法鉴定HIF-1α基因表达载体是否转染成功;低氧培养后,采用Western blot法测定HIF-1α表达;流式细胞术对转染后细胞进行周期与凋亡的检测,记录G1期、G2期和S期细胞比例,计算增殖指数(PI);MTT法绘制细胞生长曲线,记录细胞数目.结果 BMSCs-HIF-1α细胞核内充满蓝紫色深染颗粒,其余两种细胞未见深染颗粒.与BMSCs和BMSCs-pcDNA3.1细胞比较,BMSCs-HIF-1α细胞HIF-1α表达上调,细胞凋亡率降低,S期和G2期细胞比例和PI升高,G1期细胞比例降低,细胞数目增多(P＜0.05).BMSCs和BMSCs-pcDNA3.1细胞上述各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HIF-1α基因成功转染入大鼠BMSCs.     

抑癌基因MTS1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学影响

目的：探讨多肿瘤抑制基因1（MTS1）对人瘢痕疙瘩成纤维细胞在生长增殖、DNA合成代谢及胶原合成量等方面的影响。方法：将外源性MTS1基因导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞后，通过MTT法测定细胞的生长曲线，通过^3H-胸腺嘧啶核苷（^3H-TdR）及^3H-脯氨酸掺入的方法测定细胞的DNA合成量及胶原合成量，来分别比较转染前后细胞的生物学变化。结果：在转染MTS1后瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖受到明显的抑制，同时其DNA合成量及胶原合成量也明显降低，而转染空载体组及正常组细胞均未出现上述变化。结论：外源性多肿瘤抑制基因1(MTS1）能明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞在生长增殖、DNA合成及胶原合成等方面生物学功能，为瘢痕疙瘩的临床治疗提供了新的思路。     

重组人BMP-7真核表达质粒的构建及转染软骨细胞后的表达

[目的]构建重组人骨形成蛋白-7（rhBMP-7）基因真核表达质粒，转染兔关节软骨细胞，探讨外源性人rhBMP-7基因在转染软骨细胞中的表达情况及对细胞生物学性状的影响。[方法]采用PCR技术扩增rhBMP-7基因，将其插入真核表达载体pcDNA3．1中，体外分离培养兔关节软骨细胞，然后用构建的rhBMP-7质粒转染软骨细胞，经G418筛选、免疫组化染色和逆转录PCR检测其表达，同时检测表达产物对维持软骨细胞表型的作用。[结果]经过PCR及酶切鉴定证实获得了BMP-7真核表达质粒pcDNA3．1-rhBMP-7，通过免疫组化染色和逆转录PCR鉴定证实rhBMP-7在转染后的软骨细胞中得到了表达，其表达产物促进软骨细胞表型的维持。[结论]外源性rhBMP-7基因转染软骨细胞可以获得高效表达，并具有一定的维持软骨细胞表型的作用，为软骨组织工程的研究提供了改良的种子细胞。     

转染人骨形成蛋白-7基因的骨髓基质细胞异位成骨实验研究

目的 观察转染人骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7,BMP-7）基因的骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）与胶原膜（BME-10X）复合培养后的异位成骨能力。方法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC,与胶原膜复合培养后,植入裸鼠皮下,8周后取材,HE、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其异位成骨能力。结果各组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,转染组和未转染组显著高于单纯膜组,转染组又显著高于未转染组（P〈0．05）。结论转染了hBMP-7基因的BMSCs具有更强的异位成骨能力,有望成为牙周组织工程理想的种子细胞,     

融合基因骨形态发生蛋白-4/7重组腺相关病毒载体转染对骨髓基质干细胞成骨活性的作用

目的 应用高效细菌内同源重组系统pAd-Easy制备融合基因骨形态发生蛋白-4/7(BMP-4/7)基因的重组腺相关病毒(AAV),转染兔骨髓幕质干细胞(BMSCs),检测BMP-4/7的成骨活性.方法 采用RT-PCR一步法和基因重组法,从胎盘组织中克隆BMP-4和BMP-7成熟肽cDNA,获取BMP-4/7融合基因,克隆到pGEM质粒中;从pGEM-BMP-4/7质粒中切取BMP-4/7融合基因克隆到穿梭载体,在大肠杆菌内重组,在293细胞中构建AAV-BMP-4/7重组腺相关病毒载体;采用SDS-PAGE电泳榆测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达;采用ELISA法检测融合基因BMP-4/7在BMSCB中的表达.AAV-BMP4/7转染兔BMSCs细胞7、14 d后,行碱性磷酸酶及骨钙素含量测定,观察成骨活性,以非转染组作为对照. 结果成功构建高滴度的携带BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒AAV.BMP-4/7.AAV-BMPd/7重组质粒载体转化大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳可见29～830 KD蛋白带,大多数蛋白存在于包涵体内.ELISA检测显示经AAV转染的BMSCs中BMP-4/7蛋白有表达,随着转染MOI值的增加,BMP-4/7蛋白的表达增高(P<0.01).AAV-BMP4/7转染细胞后,碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显增高,并与转染后诱导培养的时间呈正相关,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01). 结论融合基因BMP-4/7可提高BMPs表达水平,有成骨活性,通过AAV可稳定表达.     

骨髓基质干细胞转染腺病毒BMP7后的成骨改变

目的 探讨BMP7腺病毒转染对骨髓基质干细胞（BMSCs）的体外、体内成骨功能的影响。方法 用重组骨形成蛋白7腺病毒（adenovirus bone morphogenetic protein7，Adeno-BMP7）转染（M．O．I=100）70％～80％融合时的第二代的羊骨髓基质干细胞，3d后分别进行免疫印迹（Westem—blot）、钙结节染色和珊瑚、细胞复合物皮下回植。结果 Western—blot检测表明转染Adeno—BMP7后的BMSCs有BMP7蛋白水平上的表达；钙结节染色表明转染Adeno—BMP7后的BMSCs可形成较大的钙结节。转染Adeno—BMP7的BMSCs可明显促进皮下新骨的形成。结论 Adeno—BMP7转染可促进BMSCs的体外成骨定向分化，Adeno—BMP7转染后的BMSCs具有更强的体内成骨能力。     

腺病毒介导hVEGF编码基因转染骨髓基质干细胞的实验研究

目的应用携带hVEGF基因的重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),观察hVEGF的表达情况。方法体外培养大鼠骨髓基质干细胞,含hVEGF基因的重组腺病毒转染骨髓基质干细胞,转染后在荧光显微镜下观察并采用ELISA法检测hVEGF的表达水平。结果 rAd-hVEGF转染骨髓基质干细胞后,ELISA检测发现转染组上清液中hVEGF蛋白分泌量明显高于对照组(P<0.01)。结论 rAd-hVEGF转染大鼠骨髓基质干细胞能够表达并分泌hVEGF,为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供可行性研究。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

LMP-1基因慢病毒重组体对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖影响及其表达

目的：探讨LMP-1重组慢病毒载体体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的方法,并检测LMp-1基因对BMSC增殖能力的影响及表达。方法：选取清洁级4周龄SD大鼠6只（雌雄不限）,无菌条件下提取骨髓间充质干细胞并培养至第3代,设立空白对照组（未经特殊处理,只有第3代骨髓间充质干细胞）、慢病毒载体转染组（在未经特殊处理的第3代骨髓间充质干细胞中加入PGC-FU-GFP及转染试剂Polybrene）和重组基因转染组（在未经特殊处理的第3代骨髓间充质干细胞中加入PGC-FU-LMP．1-GFP及转染试剂Polybrene）进行转染。转染48h后,通过免疫荧光显微镜观察荧光表达,流式细胞仪检测慢病毒的转染效率,采用MTY法评价慢病毒转染对BMSC增殖的影响;WesternBlot检测转染后基因的表达情况。结果：①成功培养出第3代SD大鼠BMSC,以100的感染复数（MOI）转染,48h后免疫荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率达67％;②不同时间点慢病毒载体转染组和重组基因转染组,与空白对照组细胞增殖比较差异无统计学意义;③WestemBlot检测示重组基因转染组72kDa处有条特征带,其大小与LMP－l融合蛋白（～50kDa＋28kDa=78kDa）基本吻合。结论：经LMp-1基因慢病毒重组体转染大鼠骨髓间充质干细胞对其增殖活力没有影响并可有效表达LMP－1。     

增强型绿色荧光蛋白转染活细胞效率的研究

目的 研究影响增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒表达系统转染活细胞效率的主要相关参数,建立一种稳定高效的活细胞EGFP标记技术.方法 培养、扩增携带EGFP逆转录病毒载体的包装细胞PGl3,分别于12h、24h、36 h和48 h收集病毒液,转染骨髓基质细胞(BMSCs),通过流式细胞仪和荧光显微镜检测不同时间点病毒转染效率.选择转染率最高时间点的病毒液,连续转染BMSCs两次,小剂量嘌呤霉素筛选6h,观察病毒转染率及细胞活力.再以上述方法转染脂肪基质细胞(ADSCs)和成纤维细胞(FBs),观察这种方法标记其他干细胞或成熟分化细胞的可行性.结果 根据流式细胞仪及荧光显微镜观察结果,24h收集的病毒液转染BMSCs效率最高(64.56±2.53)％,36 h次之(56.98±3.22)％,12 h(47.39+1.82)％与48 h(37.84±1.77)％相对较低.连续转染两次并经短暂筛选后,BMSCs转染率可达80％以上,且细胞活力不受影响.采用相同方法转染脂肪基质细胞(ADSCs)和成纤维细胞(FBs),转染率均能达到80％,且细胞形态、增殖能力均未见明显改变.结论 本实验建立了一种稳定高效的活细胞EGFP转染技术,为研究组织工程种子细胞的体内、外转归及细胞间相互作用提供了稳定且直观的检测手段.