改良三维条件下人胚胎干细胞向内皮细胞的分化及功能

目的建立一种改良的三维分化无血清方法,对人胚胎干细胞(hESCs)向内皮细胞进行分化,并对这种方法得到的人胚胎干细胞来源内皮细胞(hESC-ECs)进行功能检测。方法在低附着培养皿中培养未分化的H9 hESCs12 d,使其形成类胚体(EBs),12 d后将已形成的EBs收集起来,用浓度为1.5 mg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原重悬,加入六孔板中,在37℃待胶原凝固后加入EGM-2培养基培养3 d,获得出芽类胚体后用0.25%胶原酶Ⅰ和0.56 U/ml LiberaseBlendzyme消化芽生类胚体各20 min,采用流式技术分选出其中CD31阳性的细胞,并用乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)摄取实验和成管实验验证这部分细胞的内皮细胞功能。结果建立了一种基于胶原培养环境的三维分化方法,采用这种方法能够将hESCs向内皮细胞分化的效率提高到18%,最终获得的hESC-ECs具有和人脐带静脉内皮细胞(HU-VECs)相似的细胞表面标志物,并在乙酰化LDL吞噬实验和血管新生实验中表现出良好的内皮细胞功能。结论建立的改良三维分化方法能够明显提高hESCs向内皮细胞的分化效率,是一种简单高效的分化方法,同时无血清培养方法为将来hESC-ECs的临床应用提供了可能。     

诱导小鼠胚胎干细胞分化获取血管平滑肌和内皮细胞

目的 探讨从诱导分化的小鼠胚胎于细胞中获取体外构建组织工程化血管种子细胞的可行性.方法 利用Flk-1作为小鼠胚胎干细胞分化来源的血管前体细胞标志,流式细胞仪分选分化的类胚体中Flk-1阳性细胞,分别添加血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF),诱导血管前体细胞向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分化.免疫荧光染色鉴定诱导分化后细胞的相关标志表达;流式细胞仪分析诱导分化后细胞的分化效率和纯度.结果 流式细胞仪分析显示,在分化第4天类胚体中有50%左右的细胞表达Flk-1,经分选的Flk-1阳性细胞通过进一步诱导,可以得到(95.9±3.5)% α-SMA阳性的血管平滑肌细胞和(59.1±4.8)%CD31阳性的血管内皮细胞.结论 成功应用流式细胞分选法从诱导分化的小鼠胚胎干细胞中获取血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实验为组织工程化血管构建中种子细胞来源提供了新途径.     

诱导小鼠胚胎干细胞分化获取血管平滑肌和内皮细胞

目的 探讨从诱导分化的小鼠胚胎于细胞中获取体外构建组织工程化血管种子细胞的可行性.方法 利用Flk-1作为小鼠胚胎干细胞分化来源的血管前体细胞标志,流式细胞仪分选分化的类胚体中Flk-1阳性细胞,分别添加血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF),诱导血管前体细胞向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分化.免疫荧光染色鉴定诱导分化后细胞的相关标志表达;流式细胞仪分析诱导分化后细胞的分化效率和纯度.结果 流式细胞仪分析显示,在分化第4天类胚体中有50%左右的细胞表达Flk-1,经分选的Flk-1阳性细胞通过进一步诱导,可以得到(95.9±3.5)% α-SMA阳性的血管平滑肌细胞和(59.1±4.8)%CD31阳性的血管内皮细胞.结论 成功应用流式细胞分选法从诱导分化的小鼠胚胎干细胞中获取血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实验为组织工程化血管构建中种子细胞来源提供了新途径.     

鼠尾胶原三维诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为甲状腺类似细胞的初步研究

目的 在体外贴壁诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的基础上,不改变诱导因子,探索鼠尾胶原三维结构体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性。方法 E14小鼠胚胎干细胞半固体培养基悬浮培养6d生成拟胚体,随后在鼠尾胶原三维结构中继续诱导分化11d,全程添加诱导因子促甲状腺素及胰岛素,第14天时开始添加碘化钾。结果 拟胚体在鼠尾胶原上生长状态良好,分化细胞贴壁后逐渐陷入鼠尾胶原;电镜下诱导细胞高尔基体、内质网丰富,部分诱导细胞胞质内见不典型分泌颗粒,与人成体甲状腺细胞超微结构类似。结论 胚胎干细胞在鼠尾胶原三维结构中可以分化为甲状腺类似细胞,并具备合成、分泌的功能;三维结构为体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞提供了新的方法。 [关键词] 胶原; 胚胎; 干细胞 ;细胞分化; 甲状腺     

FGF和VEGF在血管生成中的作用

血管生成因子,诸如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)是目前研究的一大热点.人们试图通过抑制它们来抑制疾病中病态的血管形成,例如癌症中的血管形成.FGF和VEGF是通过特异性地结合于那些表达在细胞表面上的受体而发挥作用,这些受体都具有酪氨酸激酶活性.这些受体激酶活性的活化使得它们与下游的信号转导途径偶联,而这些途径调节着内皮细胞的增殖、迁移和分化.对FGF和VEGF介导的信号转导途径的抑制剂目前正在进行临床试验.本文主要对现在已知的FGF和VEGF介导的信号转导途径作一,这些途径均导致特定的生物学效应.此外,还将讨论目前已知的这些途径调节血管生成的方式.     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子（LIF）的关系。方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养。扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志（CD9、SSEA1和Flk-1）的表达情况。分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达。将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力。Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率。结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1。残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志。残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤。单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力。结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力。     

羟基红花黄色素A抑制异常增殖血管内皮细胞的机制研究

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)抑制异常增殖血管内皮细胞的作用机理。方法建立人结肠腺癌细胞LS180上清液和人脐静脉内皮细胞ECV304体外共培养模型,通过实时荧光定量PCR检测ECV304细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(KDR)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)及其受体(b FGFR)、HSPG2、p53、c-myc mRNA水平的表达;ELISA法检测细胞培养上清VEGF、VEGFR(KDR)、b FGF、b FGFR蛋白的表达。结果在共培养细胞模型中,0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR和癌基因c-myc及与细胞增殖相关蛋白多糖HSPG2的mRNA表达具有抑制作用;对抑癌基因p53 mRNA的表达具有促进作用。0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR的蛋白表达具有抑制作用。结论 HSYA抑制新生血管的生成、抑制共培养模型中血管内皮细胞的异常增殖,其可能的作用机理是通过调控VEGF及其受体、b FGF及其受体、HSPG2、c-myc和野生型p53的表达发挥抗肿瘤作用,揭示HSYA可能是潜在的肿瘤血管生成抑制剂。     

胚胎干细胞来源的内皮细胞构建内皮化血管支架

目的探索胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞,并用于构建内皮化血管支架,为临床心血管疾病治疗提供实验基础。方法采用改良后单层分化体系,血管内皮生长因子（VEGF）作为独立诱导因子定向诱导胚胎干细胞分化为血管内皮细胞,用RT-PCR法检测分化时程各时间点内皮特异性标志的表达,用免疫荧光法检测分化体系中的内皮细胞蛋白标志。将分化成熟的内皮细胞种植于支架表面,构建内皮化血管支架。结果胚胎干细胞全能性分子标志Oct3／4,早期内皮标志Flk-1,Tie-2,PECAM-1,以及成熟内皮标志VE-cadherin在胚胎干细胞分化体系中呈现一定的转录时序性;免疫荧光结果显示分化细胞Flk-1,VE-cadheiin阳性,血管支架被表达VE-cadherin的内皮细胞覆盖。结论我们改良了胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的方法,并用于探索内皮化血管支架的构建。     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子(LIF)的关系.方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养.扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志(CD9、 SSEA1和Flk-1)的表达情况.分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、 Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达.将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力.Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率.结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1.残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志.残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤.单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力.结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力.     

体外诱导小鼠胚胎干细胞血管形成

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞向内皮细胞分化的条件,模拟体内血管生成和血管新生过程,为研究新血管的形成提供一种新思路.方法体外培养小鼠胚胎干细胞诱导形成胚胎小体,将11 d的胚胎小体种植到胶原中诱发出芽性血管新生;通过免疫组织化学染色方法检测胚胎小体及其出芽向内皮细胞和功能血管的分化.结果胚胎干细胞在体外能自发形成胚胎小体,其内部含有血管样结构,并伴有平滑肌的分化;种植到胶原中的胚胎小体能再现出芽性血管新生.结论胚胎干细胞在体外不但能定向分化成内皮细胞,还能再现体内血管生成、血管新生及动脉生成过程.     

血小板内皮细胞黏附分子的剪接体在胚胎干细胞血管形成过程中的表达

目的探讨血小板内皮细胞黏附分子(PECAM)1的剪接体在胚胎干细胞分化过程中的表达规律。方法体外培养胚胎干细胞,在细胞因子的作用下形成胚胎样小体(EB);然后将EB种植到胶原中,在细胞因子的作用下诱导出芽性血管新生。分别利用免疫组织化学、流式细胞术、逆转录聚合酶链反应等方法检测胚胎干细胞及其分化过程中PECAM1、Oct4及胚胎阶段特异性抗原(SSEA)1的表达。应用克隆分析的方法检测不同的PECAM1剪接体在EB形成和出芽性血管新生过程中的表达分布。结果PECAM1主要表达在胚胎干细胞细胞连结部位。随着胚胎干细胞的分化,Oct4及SSEA1表达下降。胚胎干细胞表达8种PECAM1的剪接体,包括全长、Δ12、Δ14、Δ15、Δ12&14、Δ12&15、Δ14&15、Δ12&14&15,其中Δ15和Δ14&15表达水平最高。在胚胎干细胞形成EB和出芽性血管新生过程中,剪接体表达水平发生变化,其中Δ12&14&15的表达明显上升,Δ15表达下降。结论未分化的胚胎干细胞表达PECAM1,剪接体的表达变化可能参与了胚胎干细胞的血管形成。     

十全大补汤对小鼠原发性肝癌的生长及血管生成的影响

目的：研究十全大补汤对小鼠原发性肝癌生长以及其血管生成的影响。方法通过小鼠肝癌细胞CT-26接种小鼠,构建荷兰裸鼠原发性肝肿瘤模型,随机分为对照组和研究组,其中对照组给予生理盐水治疗,研究组给予十全大补汤治疗。治疗10 d后取小鼠血液分析其中小鼠血清中血管内皮生长因子、血管抑素和内皮抑素水平,并测量2组小鼠的肿瘤大小和质量,免疫组织化检测转移瘤微血管密度及细胞增殖。结果与对照组相比,研究组小鼠血清中血管内皮生长因子表达降低（P<0.05）,血管抑素和内皮抑素表达上调（P<0.05）,肿瘤组织Ki 67明显降低（P<0.05）,转移瘤微血管密度明显降低（P<0.05）,并且研究组小鼠的肿瘤质量和尺寸均小于对照组（P<0.05）。结论十全大补汤能够抑制小鼠原发性肝癌肿瘤的生长,扰乱小鼠血清内血管内皮生长因子、血管抑素和内皮抑素的表达水平,抑制肿瘤血管的生成,对原发性肝癌小鼠的治疗具有一定的临床价值。     

子宫内膜异位症患者腹腔液血管内皮生长因子与内抑素的表达

OBJECTIVE: To investigate the relationship of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin with endometriosis. METHODS: The levels of vascular endothelial growth factor and endostatin were measured using ELISA in 50 women with endometriosis (stage I-II26 cases and stage III-IV 24 cases) in comparison with 42 women without endometriosis. RESULTS: The VEGF, endostatin concentrations and VEGF/endostatin ratio in endometriosis group were significantly higher than the mean value in the control group (P<0.01). The VEGF and endostatin levels in stages III and IV were both significantly higher than those in stages I and II(397+/-81 pg/ml vs 315+/-64 pg/ml, 125+/-62 ng/ml vs 66+/-40 ng/ml, P<0.01). However, the VEGF/endostatin ratio was lower in the advanced stages. There was no significant difference between follicular phase and luteal phase except that the VEGF level in follicular phase was higher than that in luteal phases. CONCLUSIONS: Both VEGF and endostatin may play a role in the regulation of angiogenesis of endometriosis, and the balance of angiogenic stimulators and inhibitors may be critical to the development of endometriosis.     

卵泡液中VEGF水平对卵母细胞成熟及早期胚胎发育的影响

目的:探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)和卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)周期中血管内皮生长因子(VEGF)水平与卵母细胞成熟及早期胚胎质量的关系。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测78例接受IVF和ICSI助孕治疗的患者采卵日卵泡液中VEGF的水平,实验室观察同一卵泡腔内对应的卵母细胞的成熟度及其受精后胚胎发育情况,并结合临床上患者的年龄、促排卵方案等情况,分析两者之间的关联。结果:①卵泡液中VEGF的水平与卵母细胞成熟度研究表明:中间型及成熟型卵母细胞与未成熟型比较,差异有显著性(P<0.05),而其它型之间差异没有显著性差异(P>0.05)。②卵泡液中VEGF的水平与早期胚胎发育研究表明:优质胚胎(Ⅰ、Ⅱ级)与非优质胚胎(Ⅲ、Ⅳ级)差异有显著性(P<0.05)。③卵母细胞成熟度处于中间型和成熟型组,年龄>35岁接受治疗的患者卵泡液中VEGF水平相比于年龄低于35岁的患者,差异有显著性(P<0.05)。结论:①卵泡液中VEGF浓度在一定范围内对卵母细胞成熟有促进作用,可作为评估卵母细胞质量、胚胎质量的有效指标之一。②在IVF和ICSI周期中,卵泡液中VEGF的水平可以作为筛选优质卵母细胞质量的参考指标,并可以作为指导及预测妊娠结局的有效指标之一,但是要注意患者年龄的因素。     

血管抑素体外对兔视网膜微血管内皮细胞增生的抑制

目的 观察血管抑素对体外培养的兔视网膜微血管内皮细胞生长的抑制作用及对细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)活化的影响。方法 利用L-Lysine耦联的Sepharose 4B亲和层析柱从血浆中分离和纯化血管抑素。原代培养兔视网膜微血管内皮细胞，MTT法检测不同浓度的血管抑素对其生长的抑制作用，Western blot检测血管抑素对血管内皮细胞生长因子刺激的视网膜微血管内皮细胞ERK-1水平的影响。结果 血管抑素在体外能显著抑制视网膜微血管内皮细胞增生，其ED50约为160μg／ml。VEGF刺激兔视网膜微血管内皮细胞后，ERK-1被迅速激活，而血管抑素能使其表达量降低35．6％。结论 血管抑素有望成为极有临床价值的防治视网膜新生血管形成的新药。     

重组人血管内皮抑制素联合TACE治疗对肝癌血管的影响

目的 探讨重组人血管内皮抑制联合肝动脉化疗栓塞术(TACE)对原发性肝癌内皮生长因子(VEGF)表达和肿瘤微血管密度(MVD)的影响. 方法 46例中晚期原发性肝癌患者随机分为对照组(20例)和治疗组(26例),对照组单纯给予TACE治疗,治疗组给予重组人血管内皮抑制素联合TACE治疗.利用免疫组化法检测治疗前、后VEGF的表达变化和MVD.ELISA法检测治疗前后血清VEGF的表达水平,并进行比较. 结果 治疗组术后7d、30d血浆VEGF水平(292.34±70.74)pg/ml、(189.49±72.66)pg/ml与对照组(371.36±81.20)pg/ml、(319.24±70.54)pg/ml比较呈明显降低,差异有显著性(t=2.149,P＜0.05).术后30d治疗组和对照组的VEGF表达强度分别为(158.4±38.9)和(60.75±14.0),和MVD分别为(56.6±15.1)和(21.7±6.1),两组比较差异有显著性(t1=2.576、t2=2.328、P均＜ 0.05).结论 TACE联合重组人血管内皮抑制素治疗明显降低肝癌VEGF表达和MVD,对肿瘤再生血管有一定抑制的作用,巩固和加强了TACE的治疗.     

非小细胞肺癌气虚血瘀证患者血清血管内皮生长因子及内皮抑素的表达及意义

目的观察非小细胞肺癌气虚血瘀证患者外周血血清中血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和内皮抑素(endostatin)的表达情况。方法用抽签法随机抽取ⅡB～Ⅲ期非小细胞肺癌患者82例,将入选患者严格按照中医气虚血瘀证诊断标准,分为气虚血瘀证组(41例)和非气虚血瘀证组(41例),采用酶联免疫法检测2组患者血清中VEGF和内皮抑素含量。结果气虚血瘀证组患者的血清VEGF和内皮抑素表达均高于非气虚血瘀证组患者,差异有统计学意义(P<0.01)。结论检测血清VEGF和内皮抑素可作为非小细胞肺癌气虚血瘀证的微观辨证依据;非小细胞肺癌气虚血瘀证患者较非气虚血瘀证患者可能存在更大的转移风险。     

非那雄胺对前列腺增生组织中微血管密度调控的机制探讨

目的 探讨非那雄胺对前列腺增生症组织中微血管调节因子表达的影响及意义.方法 取正常前列腺(NP)5例,前列腺增生症服用非那雄胺者(BPH+Finas)10例,前列腺增生症未服用非那雄胺者(BPH)30例的前列腺组织标本,采用免疫组化检测微血管调节因子内皮生长抑素(endostatin)、血管生长抑素(angiostatin)、血管形成因子-2(an-giopoietin-2)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,图像分析系统测量表达强弱.结果 BPH组endostatin、angiostatin表达较NP组明显减弱,而BPH+Finas组表达较BPH组明显增强;BPH组VEGF表达较NP组明显增强,而BPH+Finas组表达较BPH组明显减弱.endostatin阳性细胞计数(个/10Hp)在NP、BPH、BPH+Finas 3组分别为(129.00±10.68)、(34.00±15.38)、(142.10±12.22);angiostatin阳性细胞计数(个/10Hp)分别为(151.00±21.64)、(54.63±28.93)、(162.30±21.81);VEGF(灰度值)分别为(139.38±8.90)、(83.81±25.73)、(108.094-7.77),以上3组测值NP组和BPH+Finas组与BPH组比较差异均有显著性意义(均P<0.01).angiopoietin-2阳性细胞计数(个/10Hp)分别为(16.40±2.19)、(15.03±2.82)、(13.90±3.00),差异无显著性意义.结论 微血管调节因子endostatin、angiostatin、VEGF作用于局部组织的微循环,可能在前列腺增生症的病理生理过程中起重要调节作用.非那雄胺通过影响局部组织微血管调节因子,而发挥抑制前列腺增生的作用.     

内皮抑素与肺发育关系的研究进展

微血管和肺泡的发育在肺发育过程中起着重要作用,而微血管的发育受生长调节因子血管内皮生长因子和内皮抑素的调节。内皮抑素是一种内源性的血管生成抑制因子,抑制新生血管的生成,影响肺发育的成熟,与某些肺疾病的发生密切相关。现就内皮抑素的作用机制,对肺发育及肺疾病的影响及其临床应用前景予以综述。