Survivin、Livin共沉默对前列腺癌细胞的联合促凋亡作用

目的：研究Survivin、Livin基因共沉默对前列腺癌细胞PC-3在细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、对化疗药物敏感性、克隆形成及裸鼠体内成瘤等方面的影响以及Survivin shRNA、Livin shRNA联合促前列腺癌细胞凋亡作用。方法：运用分子克隆技术,构建以Survivin、Livin基因为靶点的、含Survivin启动子的CGM30 miR     

抑制Survivin基因对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨应用RNAi技术沉默Survivin基因对人卵巢癌SKOV3细胞的影响。方法:构建Survivin基因shRNA真核表达载体,转染人卵巢癌SKOV3细胞。RT-PCR及Western blot检测Survivin基因的表达,MTT实验、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡的变化。结果:siRNA实验组细胞Survivin蛋白及mRNA表达水平明显下降,细胞增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高。结论:应用RNAi技术沉默Survivin基因可以降低卵巢癌SKOV3细胞Survivin基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长、增殖并诱导细胞凋亡。因此,Survivin基因可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。     

Livin异构体特异性siRNA表达载体的构建及其在SPC-A1细胞中的稳定表达

目的：利用基因转染和RNA干涉（RNA interference．RNAi）技术在肺腺癌SPC-A1细胞株中分别建立2种Livin异构体的基因沉默体系，旨在进一步体外观察两种异构体基因沉默诱导SPC-A1细胞凋亡效应。方法：构建Livin两种异构体小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）表达载体；以电穿孔法转染SPC-A1细胞，经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆；通过半定量RT-PCR和Western blot验证Livin异构体在SPC-A1细胞中的基因沉默效率，建立高效Livin异构体基因沉默体系。结果：成功获得Livin异构体siRNA表达载体，经基因转染以及G418抗性筛选，成功建立Livin异构体特异基因沉默SPC-Al细胞克隆。结论：RNAi能高效特异阻断两种Livin异构体表达，为进一步研究其不同的抗凋亡生物学功能，探讨其作为诱导肺癌细胞凋亡治疗分子靶点以及提高肺癌细胞放化疗敏感性打下基础。     

靶向Survivin的siRNA对胰腺癌细胞PC-2的放射增敏作用

目的采用RNA干扰技术阻断Survivin基因的表达,观察其诱导胰腺癌细胞凋亡及对放射的增敏作用。方法构建靶向Survivin的siRNA真核表达载体,采用lipofectamineTM2000转染胰腺癌细胞PC-2,采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞Survivin基因表达的变化;采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡及对放射的增敏作用。结果靶向Survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制PC-2细胞Survivin基因的表达,在mRNA水平其表达抑制率为81.25%;在蛋白质水平其表达抑制率为74.24%;转染靶向Survivin的siRNA真核表达载体48h后可以诱导7.03%的细胞凋亡;阻断Survivin基因的表达,可以显著提高PC-2细胞对放射的敏感性,靶向Survivin的siRNA联合放射可以诱导14.58%的细胞凋亡。结论本研究所构建的靶向Survivin的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断Survivin基因的表达,阻断Survivin基因的表达可以诱导一定程度的PC-2细胞的自发凋亡,并显著增强其对放射的敏感性。靶向Survivin的RNA干扰技术在胰腺癌的基因治疗中具有重要的潜在价值。     

Livin基因RNAi表达载体的构建及其沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并观察该载体对Livin基因表达的沉默效应.方法:设计并合成4个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pGCL-GFP慢病毒表达载体,转化,扩增后测序.以含有Livin基因的质粒为模板,扩增Livin基因cDNA序列的特异性片段,连接,克隆入真核表达载体pdsRED2-N1-3FLAG.将构建好的Livin基因过表达克隆质粒和不同靶点的RNAi表达载体质粒,经lipfectamine2000包裹,共转染人人293T细胞,Western blot和荧光显微镜检测Livin蛋白的表达情况,判断不同靶点的干扰效果.结果:Livin基因RNAi的表达载体pGCL-GFP-shLivin和Livin基因过表达载体pdsRED2-N1-Livin的阳性克隆序列正确.人293T细胞Livin蛋白表达90%被阻断.结论:成功构建高效阻断Livin基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究Livin基因的生物学功能奠定基础.     

沉默Livin基因表达对结肠癌LoVo细胞生物学特性的影响

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默结肠癌细胞株LoVo中Livin基因的表达,研究Livin对LoVo细胞增殖和凋亡等生物学特性的影响.方法:构建针对Livin基因的干扰质粒pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,转染LoVo细胞,通过RT-PCR、Wes...     

Livin异构体特异性基因沉默诱导肺腺癌SPC-A1细胞凋亡

目的:利用基因转染和RNA干涉(RNAi)技术,在SPC-A1细胞中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系,探讨其在诱导SPC-A1细胞凋亡效应中的不同作用及价值。方法:在肺腺癌SPC-A1细胞中稳定表达Livinα β、Livinα和Livinβ特异性小干涉RNA(siRNA),观察SPC-A1细胞形态、增殖等生物学行为的改变,TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:Livinα β、Livinα和Livinβ基因沉默后,SPC-A1细胞克隆形成能力较对照组显著下降(P<0.05);转染后SPC-A1细胞发生凋亡,TUNEL法显示细胞凋亡指数分别为(9.20±1.90)%、(6.75±1.20)%和(4.82±1.20)%,(流式细胞仪检测)细胞凋亡率分别为(7.48±1.30)%、(5.50±0.90)%和(4.16±0.70)%。结论:Livinα和β两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点,Livin基因沉默靶向诱导肺癌细胞凋亡可能作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。     

转染Livin基因后骨肉瘤细胞系的多药耐药性研究

目的:探讨转染Livin基因后人骨肉瘤细胞的多药耐药变化.方法:采用基因重组技术构建Livin 基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin ,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Livin基因的表达载体转染人骨肉瘤细胞U-2OS,RT-PCR检测基因转录水平;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞在不同化疗药物作用下的细胞耐药性.结果:经酶切鉴定和基因测序分析证明真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin 构建成功.将该表达载体转染U-2OS细胞后,Livin基因的表达水平与野生型U-2OS细胞和转染空载体的U-2OS/neo细胞相比显著提高(P<0.01) .与U-2OS细胞和U-2OS/neo细胞相比,U-2OS/Livin细胞对ADM、CTX、MMC和DDP等化疗药物的耐药性也明显增强(P<0.01).结论:Livin基因高表达是人骨肉瘤多药耐药的原因之一.     

靶向Bcl-xL基因siRNA在前列腺癌细胞增殖和凋亡中的作用

目的研究Bcl-xL基因特异性RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞株体外增殖能力和凋亡的影响。方法构建靶向Bcl-xL的小干扰RNA(siRNA)表达载体,转染PC-3细胞后,采用半定量RT-PCR和Western blot法检测转染前后Bcl-xL mRNA及蛋白表达水平的改变;采用噻唑兰(MTT)法检测细胞生长增殖情况;TUNEL试剂盒测定细胞的凋亡情况。结果靶向Bcl-xL的序列特异性的siRNA可以有效地抑制PC-3细胞Bcl-xL基因的表达。转染靶向Bcl-xL的siRNA表达质粒可以显著抑制PC-3细胞的增殖（P<0.001）,诱导细胞凋亡（P<0.001）。结论Bcl-xL基因特异性RNA干扰可以显著抑制前列腺癌PC-3细胞的体外增殖并诱导细胞凋亡。     

Livin异构体特异性shRNA对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的：应用构建成功的Livin异构体（BIRC71，BIRC72）短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）真核表达载体转染Hela细胞，探讨其对Livin基因的沉默效应及诱导Hela细胞凋亡的作用。方法：采用脂质体转染法转染Hela细胞，荧光实时定量PCR、Western blotting检测转染前后宫颈癌Hela细胞Livin基因拷贝数和蛋白表达的变化，将shRNA表达载体流式细胞术检测不同时间（24、48、72h）的细胞凋亡率。结果：真核表达载体的转染效率48h较24、72h高；转染pGenesil-1-BIRC71、pGenesil-1-BIRC72后Hela细胞中Livin拷贝数明显减少（P〈0．05），蛋白质表达水平显著降低（P〈0．05）；流式细胞术检测24、48、72h凋亡率，转染LivinshRNA组细胞的凋亡率显著高于对照组（P〈0．05），随时间延长（24→72h）凋亡率相应增加。结论：靶向Livin的shRNA真核表达载体可以有效特异地阻断Livin基因的表达，明显诱导宫颈癌细胞凋亡。     

Impact of Co-transfection with Livin and Survivin shRNA Expression Vectors on Biological Behavior of HepG2 Cells

Objective: To construct short hairpin RNA (shRNA) eukaryotic expression vectors targeting Livin andSurvivin genes, and to explore the impact of co-transfection of Livin and Survivin shRNA expression vectors onthe biological behavior of HepG2 cells. Methods: shRNA eukaryotic expression vectors pSD11-Livin and pSD11-Survivin were designed and constructed then transfected into HepG2 cells separately or in combination. mRNAand protein expression in transfected cells was assessed by quantitative fluorescence PCR and Western blotting,respectively. Cell proliferation was measured by MTT assay and cell apoptosis by TUNEL assay. Results: TheLivin and Survivin shRNA eukaryotic expression vectors were successfully constructed and transfected intoHepG2 cells. The relative mRNA expression levels of Livin and Survivin in HepG2 cells co-transfected withpSD11-Livin and pSD11-Survivin were 0.12 ± 0.02 and 0.33 ±0.13, respectively, which was significantly lower thanlevels in cells transfected with either pSD11-Livin or pSD11-Survivin (P<0.05). The relative protein expressionlevels of Livin and Survivin in the co-transfected cells were also significantly decreased compared to singletransfection(P<0.05). The inhibition rate of cell growth in the co-transfection group was higher than that in thesingle-transfection groups at 48 h, 60 h, or 72 h after transfection (P<0.01). The apoptotic rate increased to thegreatest extent in the co-transfection group relative to any other group (P<0.05). Conclusions: Co-transfectionwith pSD11-Livin and pSD11-Survivin was more efficient than transfection with either vector alone in reducingthe mRNA and protein expression of Livin and Survivin genes in HepG2 cells. Co-transfection also inhibited theproliferation of transfected cells more than the other groups, and induced cellular apoptosis more effectively.     

Livin靶向siRNA对大肠癌细胞凋亡的诱导作用

目的:构建Livin靶向小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,观察其诱导大肠癌细胞的凋亡效应.方法:构建Livin靶向siRNA重组表达栽体并转染结肠癌细胞,RT-PCR和蛋白质印迹法检测Livin的表达,MTT法检测siRNA对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测细胞的凋亡效应.结果:经酶切鉴定和测序结果证实,Livin靶向sirNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Livin mRNA和蛋白的表达抑制率分别为30.18%和28.88%,P<0.05,肿瘤细胞的生长受到明显抑制,细胞凋亡率为(13.36±1.45)%,P<0.05.结论:Livin靶向siR-NA重组表达载体构建成功,能有效抑制Livin基因表达并能显著诱导肿瘤细胞凋亡.     

RNA干涉技术抑制骨肉瘤细胞MG63中Survivin基因表达的研究

目的：构建人Survivin基因的si RNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63中Survivin基因表达的干涉作用。方法：应用pSilencer3.0-H1neo构建Survivin特异性RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞。HE染色观察细胞形态学变化,透射电镜观察细胞超微结构。应用RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等方法检测Survivin的mRNA和蛋白水平变化。流式细胞仪检测细胞周期变化。结果：成功构建了Survivin基因si RNA真核表达载体PsvA和PsvB,获得了稳定转染的MG63细胞。与野生型MG63、阴性对照和MG63/PsvA细胞相比,MG63/PsvB细胞增殖反应明显减弱,差异有统计学意义,P〈0.01。MG63/PsvB细胞中Survivin mRNA和蛋白表达减少。与野生型MG63、阴性对照和MG63/PsvA细胞相比,MG63/PsvB凋亡率增加7倍（P〈0.01）。结论：特异性si RNA能够明显抑制Survivin基因在MG63细胞中的表达,为进一步研究survivn在MG63细胞中的生物学功能和作用机制奠定了基础。     

Livin靶向siRNA诱导大肠癌细胞调亡的作用

Objective:To construct siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene and observe the apoptosis induction effecl of it in human colon cancer cells.Methods:SiRNA recombinant expression vector targeting Livin gene was constructed and transfected into human colon cancer cell.The effect of siRNA recombinant expression vector was detected by RT-PCR,Westem blot,MTT reduction assay and flow cytometry.Results:It was confirmed by restriction endonuclease and sequence analysis that siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene was constructed successfully.Inhibition ratio of Livin siRNA at mRNA and protein levels were 30.18% and 28.88%.The growth of cancer cells was inhibited significantly and the apoptotic ratio was 13.36±1.45%.Conclusion:The siRNA recombinant expression vector targeting Livin gene has been constructed successfully.It not only can inhibit the expression of Livin gene but also can induce apoptosis in human colon cancer cells remarkably.     

RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法:用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果:重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.01)。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论:成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的：运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法：用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果：重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达（P〈0.01）。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论：成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

食管鳞癌ECA109细胞中Survivin通过ERK信号通路调控c-myc基因表达的机制

目的：探讨在食管鳞癌ECA109细胞中Survivin对c-myc基因的调控作用。方法：将食管鳞癌ECA109细胞分为Survivin shRNA干扰组、阴性质粒对照组（Control shRNA）和空白细胞株（未加任何处理的食管癌ECA109细胞）,将2μg Survivin shRNA质粒、2μg Control shRNA质粒分别转染ECA109细胞,48 h后收集各组细胞,采用RT-PCR法检测各组Survivin、c-myc mRNA的表达,Western blot法检测Survivin、c-myc蛋白及p-ERK蛋白的表达;采用ERK、p38、JNK、JAK/STA3、PI3K/Akt信号传导通路的特异性抑制剂分别阻断ECA109细胞中关键激酶的表达,RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达。结果：与阴性质粒对照组和空白细胞组比较,Survivin shRNA组Survivin表达下调,c-myc mRNA及蛋白的表达降低,差异均具有统计学意义（P均 < 0.05）;采用ERK、p38、JNK、JAK/STA3、PI3K/Akt信号通路抑制剂分别作用于食管癌ECA109细胞,PD98059（ERK信号通路阻断剂）组c-myc mRNA及蛋白表达降低（P < 0.05）;Survivin shRNA干扰沉默Survivin基因后ERK磷酸化蛋白表达降低（P < 0.05）。结论：Survivin对c-myc具有正向调控作用,可能通过ERK信号传导通路调控c-myc的表达。