中国东北地区HTLV-1的前病毒DNA测定及其意义

目的 了解我国东北的HTLV-1的流行情况及病毒特征。方法 从2002年起在东北地区共采取了941份标本。用免疫荧光法进行了血清抗体的检测，经PCR扩增及Southern杂交鉴定。结果 发现3例HTLV-1阳性感染病人，阳性率0．3％，没有发现HTLV-2阳性感染病人；在37例淋巴细胞白血病患者中检出2例，检出率5．4％。并对其中1例阳性感染病人的外周血单个核细胞（PBMCs）中的前病毒DNA的env基因的gp21、gp46两个碱基对核甘酸序列进行了PCR扩增，并将其克隆到T—Vector上进行DNA的核甘酸序列测定，与日本原型（ATK）病毒DNA链的相应区域的线性比较显示了很高的同源性（98．9％-100．％），没有发现碱基的插入、删除和其他显著性的变化。结论东北地区为HTLV-1的非流行区，于淋巴细胞白血病病人检出率（5．4％）较高，说明东北地区的淋巴细胞白血病与HTLV-1感染有一定的关系。     

FQ-PCR检测人巨细胞病毒方法的建立及临床初步应用

目的:建立快速、敏感、特异的人巨细胞病毒(HCMV)实时荧光定量聚合酶链(FQ-PCR)反应检测巨细胞病毒.方法:选择HCMV的IE(立早基因)片段,设计出上下游引物和对应的TaqMan探针建立FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒对体系进行优化,建立标准品并制作出标准曲线,进行重复性检测,并以其他微生物为对照进行特异性检测,最后检测50例临床乳汁标本.结果:当HCMV质粒标准品浓度在1010-106 copy/L时,相关系数R＝0.997,相关性良好,各浓度标准品的Ct值变异系数小于5％,重复性较好.其他种类的细菌、病毒均未出现特异性扩增.50例临床乳汁标本中有43例扩增出阳性,检出率为86％(43/50).结论:实时FQ-PCR检测HCMV,具有快速,灵敏,方便的特点,有助于HCMV感染的病理机制和流行病学研究.     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用

目的:探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HBV-DNA在乙型肝炎病毒(HBV)感染的诊疗中的应用价值。方法:用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法定量检测523例患者的血清HBV-DNA含量(临界值为500cop ies/m l),同时用ELISA法测定HBV血清标记物。结果:经FQ-PCR检测,116份HbsAg,HbeAg,HbcAb,ProS1-Ag都阳性的标本,HBV-DNA阳性率为98.7%,平均拷贝数为1.87×108copy/m l,显著高于其他组(P<0.05)。HbsAg,HbeAg,ProS1-Ag一项或多项阳性者的HBV-DNA阳性率和平均拷贝数显高于三项抗原全阴者。结论:FQ-PCR可以快速而准确地检测HBV-DNA拷贝数。HBV-DNA可准确、灵敏地反映HBV复制。与HBV血清标记物联合应用可使诊断更准确,治疗更合理。     

应用FQ-PCR检测宫颈病变中HPV16／18亚型DNA

目的:探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测宫颈病变人乳头瘤病毒(HPV)16/18亚型DNA的可行性,建立快速、灵敏的检测方法,指导宫颈癌的普查和治疗.方珐:选择124例阴道细胞学检测异常的宫颈脱落细胞,使用FQ-PCR方法检测HPV16/18亚型DNA,同时取宫颈病变处组织进行组织病理学检查.结果:124例样本中HPV16/18亚型DNA阳性者43例,阳性率为34.68%;DNA定量范围在5.4×102 copies/ml～6.38×107 copies/ml,平均为5.75×105 copies/ml;组织病理学检测27例阳性,阳性率为21.77%;经χ2检验,二者有显著性差异(χ2=10.2272,P＜0.05);阴性标本为0 copy/ml.结论:FQ-PCR方法检测宫颈病变HPV 16/18亚型DNA感染,具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点,对宫颈癌的普查和治疗有指导意义.     

FQ-PCR法对孕前及孕中进行HCMV检测的临床意义

目的 运用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对孕前及孕中进行人巨细胞病毒(HCMV)检测,探讨受检者孕前及孕时感染HCMV的临床意义.方法 对302例孕前妇女和620例产前孕妇均做HCMV检测,取宫颈分泌物标本用FQ-PCR法做HCMV-DNA检测,取血清标本用ELISA法做HCMV-IgM检测.结果 302例孕前妇女宫颈分泌物标本HCMV-DNA阳性96例,血清标本HCMV-DNA阳性5例;620例产前孕妇宫颈分泌物标本HCMV-DNA阳性94例,血清标本HCMV-DNA阳性7例.可见用FQ-PCR法检测HCMV-DNA的阳性率远高于用ELISA法检测HCMV-IgM,ELISA法检测HCMV感染阳性率明显偏低,说明FQ-PCR法敏感性显著高于ELISA法.结论 宫颈分泌物组和血清组有明显差异,运用FQ-PCR技术对孕前及孕时进行HCMV检测具有重要的临床意义.     

同时检测与区分HIV-1,HIV-2,HTLV-Ⅰ与HTLV-Ⅱ的复合PCR试验

聚合酶链反应(PCR)的高敏感性由于容易被扩张的物质所污染,故易产生假阳性结果。美国的Heredia等人建立了一种复合的PCR试验,用于同时扩张不同的检测物(HIV-1,HIV-2,HTLV-Ⅰ,HTLV-Ⅱ)的序列。将HIV-11的gag区,HIV-2的env,HTLV-Ⅰ的pol和HTLV-Ⅱ的tax的4对引物混合在一起,并为了避免以前PCR扩     

定量PCR检测血清HBV-DNA与血清HBV标志物关系的研究

目的 :探讨定量PCR检测血清HBV -DNA与血清HBV标志物之间的关系及其临床意义。方法 :35 2例血清标本运用荧光定量PCR检测血清HBV -DNA及放射免疫法 (ELISA)检测血清HBV标志物。结果 :经荧光定量PCR检测 94例HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性的标本 ,其血清HBV -DNA全部阳性 ,DNA测值范围 4 .8× 10 5～ 2 .8× 10 8copy/ml;81例HBsAg、HBeAb、HBcAb均阳性的标本 ,其血清HBV -DNA4 3例阳性(阳性率为 5 3% ) ,DNA测值范围 1.0× 10 4～ 1.4× 10 7copy/ml;39例HBsAg、HBcAb阳性的标本 ,其血清HBV-DNA2 4例阳性 (阳性率为 6 1% ) ,DNA测值范围 3.5× 10 3 ～ 1.6× 10 7copy/ml;10 0例HBVM全阴性的标本 ,血清HBV -DNA全部阴性。结论 :荧光定量PCR检测血清HBV -DNA准确灵敏 ,可反映乙肝患者病程变化 ,对于乙肝临床诊断、治疗方案的选择、疗效观察及预后判断有极其重要的作用。     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.     

3440例男性不同标本沙眼衣原体FQ-PCR测定

目的:探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)用于男性不同标本的沙眼衣原体(Chlamydia tracgomatis,CT)检测情况.方法:用Gene Amp 5700型荧光定量PCR仪对3 440例尿道拭子、前列腺液、精液、尿液等4种标本进行CT检测.结果:共检出CT阳性者483例,占14.04%;其中尿道拭子阳性466例,占该类标本14.4%;前列腺液阳性9例,占该类标本14.5%;精液阳性5例,占该类标本4.7%;尿液阳性3例,占该类标本7.7%.PCR定量:1.08×103 Copy/ml～1.5×109 Copy/ml.结论:尿道拭子、前列腺液标本检出CT阳性率最高,其次为尿液、精液.     

两种人乳头瘤病毒分型检测方法的比较

目的 通过比较PCR联合地高辛标记探针杂交法与实时荧光定量PCR法检测宫颈液标本中人乳头瘤病毒(HPV)感染的一致性,评价PCR联合地高辛标记探针杂交法的临床应用价值. 方法 将4型HPV(16、51、54和56)探针3′端加尾地高辛标记,检测标记探针的灵敏度和特异性.收集63例第二代杂交捕获(HC-Ⅱ)阳性和18例HC-Ⅱ阴性的宫颈液标本,采用HPV通用引物MY11/09对所有标本L1区基因序列进行PCR扩增,利用地高辛标记探针杂交法对PCR产物进行检测分型;同时利用实时荧光定量PCR对这81例标本进行检测,将两者的检测结果进行比较. 结果 地高辛标记探针杂交法检测出HC-Ⅱ阳性标本中HPV-16型40例,HPV-51型2例,HPV-56型2例,分别占HC-Ⅱ阳性标本的63.5%、3.2%和3.2%,HC-Ⅱ阴性标本中检测出HPV-16型1例;实时荧光定量PCR法检测出HC-Ⅱ阳性标本中HPV-16型39例,HPV-51型2例,HPV-56型2例,占HC-Ⅱ阳性标本的61.9%、3.2%和3.2%,HC-Ⅱ阴性标本中检测出HPV-16型1例;重复性检测显示两种方法检测4型HPV感染的变异系数(CV)为0～1.45%和0～1.50%,检测标本中4型感染的符合率为97.5% ～100%. 结论 PCR联合地高辛标记探针杂交法具有较好的灵敏度和特异性, 可能对于临床HPV分型检测有应用价值.     

荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌检测中的应用

目的 探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)在结核分枝杆菌检测中的价值.方法 收集患者痰液、灌洗液、胸水和尿液等标本,分别作涂片检测(萋纳染色和荧光染色)和FQ-PCR检测,比较两者的阳性率.结果 169例标本中,萋纳染色阳性共7例(4.1%),38例疑似标本中荧光染色阳性共15例,FQ-PCR检测结核分枝杆菌 DNA阳性共17例(10.1%),FQ-PCR与荧光染色符合率为88.2%.结论 涂片检查结核分枝杆菌阳性率较低,FQ-PCR法检测结核分枝杆菌 DNA阳性率高于涂片法,可列入结核分枝杆菌实验诊断的常规项目.     

Sybr greenⅠ实时定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的探讨

目的　选择以SybrgreenⅠ作为荧光指示剂做实时PCR (SYBR法 ) ,检测乙肝病毒 (hepatitisBvirus ,HBV )DNA ,并与国产TaqMan荧光实时定量PCR方法比较。 方法　对 189例临床血清标本DNA分别进行常规PCR和SybrgreenⅠ荧光PCR检测。 结果　使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法测得 10 6例HBVDNA阳性 ,67例阴性 ,16例判断困难。使用SybrgreenⅠ实时定量PCR方法测得 117例HBVDNA阳性 ,72例阴性 ,使用SybrgreenⅠ实时定量PCR方法测得HBVDNA阳性熔解曲线Tm值为 83 .67± 0 .95℃。其中 10 6例阳性和 67例阴性与使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法所测阴阳性一致 ,二者定量的回归系数为 0 .941。使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法判断困难的 16例中 ,11例SybrgreenⅠ实时定量PCR方法判断为阳性 ,但定量拷贝数很低 ,其中最大值为 1.68× 10 3 拷贝/ml,最小值为 4.3 7× 10 2 拷贝 /ml ,平均值为 83 9拷贝 /ml ;另 5例判断为阴性。结论　使用SybrgreenⅠ荧光素进行实时定量PCR检测HBVDNA的敏感度要高于国产TaqMan的荧光实时定量PCR方法 ,能够适合目前临床上及时有效准确检测标本的要求。     

外周血中乳腺癌细胞hMAM表达检测方法的建立及初步应用

目的建立反转录结合荧光定量PCR(FQ-PCR)检测外周血乳腺癌细胞hMAM基因表达方法,了解其监测乳腺癌细胞微转移的应用价值。方法克隆目的片段,制备标准品并做测序验证。培养乳腺癌MDA-MB453、MCF7细胞株,制成血液标本模型,GAPDH基因为内对照,反转录结合FQ-PCR检测乳腺癌细胞株血标本模型和10例乳腺癌患者外周血的hMAM表达。结果电泳和测序证实,克隆产物系预期的目的片段。FQ-PCR标准曲线的相关系数为-1.0;用103拷贝/微升标准品重复检测5次,x±s:718.9±120.5,CV值:16.7%;MDA-MB453细胞的血标本做灵敏度试验,相当于104个血细胞中含1个乳腺癌细胞可检出阳性。未检测到MCF7细胞的hMAM表达。10例乳腺癌患者,淋巴结转移的5例中,3例hMAM表达阳性、2例阴性;无淋巴结转移的5例中,1例hMAM表达阳性、4例阴性。结论本方法可有效监测外周血中微转移的乳腺癌细胞,发现不同乳腺癌细胞系hMAM表达程度差异大。     

荧光定量检测血中Tp-DNA对梅毒患者的诊断及随访研究

目的：梅毒的诊断及疗效随访寻找一个敏感性高、特异性强的早期实验室诊断方法。方法：采用荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,并以其结构和功能均已明确的polA为靶基因检测患者血中Tp-DNA。结果：Ⅰ期12例中8例Tp-DNA阳性,Ⅱ期17例均为阳性。Ⅰ期12例中6例Tp-polADNA阳性;Ⅱ期17例均为阳性。结论：建议对于RPR转阴者亦应检测Tp-DNA了解TP是否彻底清除,Tp-DNA结果可作为进一步治疗的参考。     

实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BK病毒感染

目的:建立肾移植术后患者尿液和外周血BK病毒(BKV)感染负荷的实时荧光定量PCR检测方法,并初步探讨其临床应用价值.方法:构建含有BKV VP1蛋白保守区核苷酸序列片段的质粒作为外参照品,采用TaqMan荧光探针检测技术,建立定量检测BKV DNA方法;并对112例肾移植术后患者,40例正常体检者的尿液和外周血标本BKV含量进行检测.结果:本研究建立的BKV实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异度及重复性较好,定量PCR方法最低检测下限为8×102copy/ml,测量批内差异为0.54%～3.78%,批间差异为0.62%～4.58%.112例肾移植术后患者尿液和外周血BKV DNA的检测阳性率分别为27.7%和11.6%,BKV DNA阳性者尿液和外周血BKV中位数水平分别为8.2×104copy/ml和2.4×103copy/ml.40例正常人BKV尿液和外周血阳性率为2.5%和0%;与正常体检者相比,肾移植术后患者尿液及外周血BKVDNA阳性率及水平明显升高(P＜0.01).尿液BKV阳性率较外周血明显升高(P=0.02),但尿液和外周血中BKV含量无明显相关性.结论:实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BKV感染方法简便、可靠、准确,为进一步研究BKV感染与肾移植术后移植物丢失的关系奠定了基础.     

应用荧光探针定量PCR检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型的临床应用

目的:探讨荧光探针定量PCR检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)在临床上的应用。方法:采用荧光探针定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对93例临床诊断为生殖器单纯疱疹病毒感染者检测。结果:检出56例HSVⅡ阳性,阳性率60.22%。结论:FQ-PCR在检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型的临床应用中具有快捷、特异性强的优点。     

荧光定量聚合酶链反应诊断弓形虫感染的实验研究

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）对孕妇与新生儿弓形虫（TOX）感染的诊断价值。方法以完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量PCR方法,检测了产妇的血清标本和新生儿脐血标本,同时与常规 PCR法和酶联免疫吸附法（ELISA）比较。结果 225例产妇中,FQ-PCR阳性28例,平均拷贝数值（ml-1）为 1.68×105,阳性率为12.44％,常规PCR阳性率为12.89％,TOX-IgG阳性29例,阳性率为 12.89％,IgM阳性33例,阳性率为14.67％。179例新生儿中,FQ-PCR阳性7例,平均拷贝数值（ml-1）为2.29×105,阳性率为3.91％,常规PCR阳性率为5.03％,TOX-IgG阳性11例,阳性率为6.15％,IgM阳性3例,阳性率为1.68％。结论FQ-PCR特异性比ELISA法高,可以检测TOX的真实感染和复制情况,对TOX的临床诊断、治疗方案的选择和疗效观察有较大的应用价值。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测流感病毒H1、H3亚型的研究

目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒H1、H3亚型的方法.方法 根据H1、H3亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100 copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 H1和H3亚型流感病毒的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为101.35％和113.28％,标准曲线相关系数大于99％,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H1、H3亚型流感病毒.     

荧光定量PCR技术检测女性淋病的临床价值

目的：探讨荧光定量PCR技术检测女性淋病的临床价值。方法：用荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,检测疑似淋病女性患者泌尿生殖道标本117例,并与常规的细菌培养进行比较。结果：FQ-PCR阳性检出率为48.7%（57/117）,细菌培养阳性率为36.7%（43/117）。结论：凡细菌培养阳性者FQ-PCR均阳性,表明FQ-PCR操作更简便、快速,并能准确定量。对于淋病的诊断、病情的发展和愈后监测、疗效评价、指导用药均具有很高的临床实用价值。     

NDM1基因常规PCR与荧光定量PCR检测方法的建立及其检测结果比较

目的：建立NDM1基因常规PCR和荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法,并对其检测结果进行比较。方法：设计3对NDM1基因常规PCR与FQ-PCR引物,建立常规PCR与FQ-PCR反应体系和条件,比较2种检测方法的特异性、灵敏度和对模拟临床样品的检测效果。结果：成功建立NDM1基因常规PCR和FQ-PCR检测方法;特异性检测,常规PCR与FQ-PCR检测7种常见病原菌均为阴性;灵敏度检测,常规PCR检测限为10⁶ mL^-1 ,FQ-PCR检测限为10⁴ mL^-1;模拟临床样品检测,常规PCR和FQ-PCR检测结果一致。结论：常规PCR与FQ-PCR均有很好的特异性,FQ-PCR灵敏度比常规PCR高100倍。