p53在苯并[a]芘诱导所致p21和细胞周期蛋白改变中的作用

目的探讨在苯并[a]芘(B[a]P)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中p53蛋白对p21、cyclin D1和CDK4蛋白间相互作用的影响。方法向转染p53小干扰RNA(p53siRNA)质粒的HELF细胞即p53-H细胞组、载体CMV的HELF细胞即HELF/CMV细胞组中分别加入2μmol/L B[a]P作用24 h,向p53化学抑制剂Pifithrin-α(PFT-α)组即HELF/CMV+PFT-α细胞组中同时加入2μmol/L B[a]P和20μmol/L PFT-α作用24 h,各组同时设立不做任何处理的对照组。用免疫印迹(Western blot)法检测细胞中p53、p53-ser20以及p21、cyclin D1和CDK4蛋白水平的变化,同时利用免疫沉淀方法分析p53蛋白对p21、cyclin D1以及CDK4蛋白间相互作用的影响。结果利用PFT-α或p53 siRNA技术抑制p53蛋白后,B[a]P诱导的p53蛋白20位丝氨酸磷酸化水平和p21蛋白水平的增高受抑制,B[a]P诱导的cyclin D1水平的增加不受影响,CDK4的水平不受B[a]P的影响;免疫沉淀实验结果表明,B[a]P引起的p21和CDK4结合的增加受到抑制,B[a]P引起的p21与cyclin D1结合的增加不受影响,cyclin D1和CDK4的结合不受B[a]P的影响。结论B[a]P通过p53-ser20影响人胚肺成纤维细胞p21和CDK4的结合。     

Ku80/p53通路在石英诱导的细胞周期改变中的作用

目的 探讨在石英刺激的人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblasts,HELF)中Ku80蛋白表达的变化及Ku80/p53通路在石英诱导的细胞周期改变中的作用.方法 RNAi技术抑制Ku80蛋白表达,流式细胞技术检测细胞周期,免疫印迹技术检测Ku80、p53、p21蛋白的表达及p53-ser15磷酸化水平,并用Image-Pro plus 6.0软件对条带光强度进行半定量分析.结果 Ku80蛋白表达与石英刺激呈剂量-反应和时间-反应关系;石英刺激阴性对照H-NC细胞,G1期细胞所占比例从89.28%±2.19%下降到68.93%±3.79%;抑制Ku80蛋白表达的HELF细胞(H-Ku80)的G1期细胞所占比例进一步减少,从85.16%±3.73%下降到59.92%±3131%,差异均有统计学意义(P<0.05);抑制Ku80蛋白表达后,石英引起的p53、p21蛋白及p53-ser15磷酸化水平增高受抑制.结论 Ku80对p53、p21蛋白表达及p53-ser15磷酸化水平起调节作用,Ku80/p53通路可能参与了石英诱导的细胞周期改变.

Abstract：

Objective To study the roles of Ku80/p53 pathway in silica-induced cell cycle changes in human embryo lung fibroblasts (HELF). Methods Ku80 siRNA expression vectors were transfected into HELF by lipofectamine. Flow cytometry was used to detect the distributions of cell cycle and western blot assay was used to determine the expression level of Ku80, p53 and p21 proteins or the phosphorylation levels of p53-serl5 after cells were exposed to silica. Results The expression levels of Ku80 protein increased in concentration-dependent and time-dependent manners after cells were exposed to silica. The proportion of G1 phases in H-NC cells (controls) decreased from 89.28%±2.19% to 68.93%±3.79% after exposure to silica, and the proportion of G1 phases in HELF cells (H-Ku80) decreased from 85.16%±3.73% to 59.92%±3.31% after exposure to silica (P<0.05). The expression levels of Ku80, p53 protecns or p21 proteins or phosphorylation level of p53-serl5 were obviously suppressed in H-Ku80, as compared with H-NC. Conclusion Ku80/p53 pathway plays a role in the cell cycle charges induced by silica in human embryo lung fibroblasts.     

石英诱导细胞cyclin D1-CDK4蛋白表达的降低及其影响因子

目的 探讨石英暴露的人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast,HELF)中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)-细胞周期依赖蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白的表达水平,同时探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)、JNK、p38和核转录因子(AP-1)等信号蛋白在石英诱导eyelin D1-CDK4蛋白表达改变中的作用.方法 石英刺激HELF后,收获细胞,检测cyclin D1和CDK4蛋白表达.选用特异化学抑制剂或分子抑制剂抑制ERK、JNK、p38或AP-1的活性后,分别采用免疫细胞化学和免疫蛋白印迹方法检测HELF中cyclin D1和CDK4蛋白表达变化.结果 HELF暴露于石英粉尘2h后,cyclin D1和CDK4蛋白表达水平分别为(7.91±0.29)x103和(5.17±0.28)x104,均明显低于HELF组,差异有统计学意义(P＜0.05).用ERK的化学抑制剂或分子抑制剂抑制ERK的活力后,能够防止石英诱导的cyclin D1和CDK4蛋白表达降低.用SP600125抑制JNK的活力后,可以防止cyclin DI和CDK4蛋白表达降低.但是抑制p38的活力对石英诱导的cyclin D1和CDK4蛋白表达降低均没有作用.用姜黄素抑制AP-1的活性后,只能防止石英诱导的CDK4的表达降低,而对cyefin D1表达降低没有影响.结论 石英诱导HELF中cyclin D1和CDK4蛋白表达降低与ERK和JNK蛋白激酶有关.AP-1与石英诱导的CDK4蛋白表达降低有关.     

石英致MAPK/cyclinD1-CDK4信号转导通路的活化

目的探讨石英诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)/细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin D1-CDK4)信号转导通路的活化。方法两种处理方式:(1)石英刺激细胞2h后,收获细胞;(2)石英长时间(2个月)作用于细胞,使细胞具有部分转化细胞的特征(S-HELF),检测信号蛋白因子和细胞周期的变化。分别采用Western blot、免疫细胞化学和流式细胞术方法检测细胞内信号蛋白和细胞周期的改变。选用特异化学抑制剂或分子抑制剂抑制上游激酶,检测下游激酶的变化。结果HELF暴露于石英粉尘2 h后,可以导致MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK1/2 3个亚家族的磷酸化水平升高。在S-HELF中,只有细胞外调节蛋白激酶(ERK)和C-Jun氨基末端激酶[JNK1(p46)]较未处理的HELF磷酸化水平增高,而JNK2(p54)的磷酸化水平没有变化,p38的磷酸化水平反而下降。cyclin D1和CDK4蛋白在S-HELF中较HELF中表达增多。抑制ERK和JNK活化或者抑制核转录因子活化蛋白1(AP- 1)的活化后,S-HELF中cyclin D1和CDK4蛋白过表达得到控制。而抑制p38的活性不能改变cyclin D1和CDK4蛋白过表达。结论石英刺激HELF2h后可诱导ERK、JNK和p38的活化,而S-HELF中ERK、JNK活化,p38没有被活化。S-HELF中,cyclin D1和CDK4蛋白质过表达与ERK、JNK和AP-1活化有关。     

p53蛋白在苯并(a)芘诱导的p21、E2F-1表达及细胞周期改变中的作用

目的 探讨p53蛋白在苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞周期改变中的作用及其与p21、E2F-1的关系.方法 转染p53 siRNA质粒(p53-H)和载体CMV的HELF细胞(HELF/CMV)无血清培养48 h后,加入2 μmol/L B(a)P作用24 h.用流式细胞仪检测细胞周期的变化.用Western blotting检测细胞中p53、p21蛋白含量的改变,利用细胞核、细胞浆分离技术观察其亚细胞定位.用免疫荧光法观察E2F-1蛋白含量及细胞核、细胞浆分布.利用p53 siRNA质粒和化学抑制剂pifithrin-α(PFT)抑制其表达,观察p53与p21、E2F-1的上下游关系以及其在B(a)P引起的细胞周期改变中的作用.结果 2 μmol/L B(a)P作用24 h后,G1期细胞比例由(71±5)%减少为(39±4)%;p53、p21以及E2F-1蛋白含量增加,并且主要分布在细胞核内.用p53 siRNA质粒和PFT抑制p53表达后,B(a)P诱导的p21高表达被抑制,细胞核内的含量明显减少;B(a)P诱导的E2F-1蛋白含量增加以及细胞周期的改变没有明显变化.结论 B(a)P通过p53非依赖的信号通路引起HELF细胞周期的改变;p53对p21的表达具有调节作用,而对E2F-1的表达不具有调节作用.     

p53表达在石英诱导的细胞周期改变及DNA损伤修复中的作用

目的 探讨p53表达在石英致人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞周期改变及DNA双链断裂(DNA double strand breaks,DSBs)修复中的作用.方法 3种方式分组处理细胞:(1)不同浓度(0、25、50、100、200、300、400μg/ml)的石英刺激HELF细胞12 h;(2)200 μg/ml石英刺激HELF细胞O、1、2,6、12、24 h;(3)200μg/ml石英刺激H-CMV和H-p53细胞O、12、24 h.用中性彗星试验检测石英所致的DSBs损伤强度,并计算DNA修复能力(DNA repair compentence,DRC),用免疫印迹法检测蛋白表达和磷酸化水平,用流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 (1)200μg/ml的石英作用HELF细胞不同时间,p53表达及p53-Ser15磷酸化水平随着作用时间的延长逐渐升高,12 h达峰值,24 h较12 h略有降低;不同浓度的石英作用HELF细胞12 h,随着石英浓度的增加,p53表达及p53-Ser15磷酸化水平逐渐增强,呈现剂量-反应关系.(2)石英作用于p53 siRNA的阴性对照细胞H-CMV,DRC为57.19%:石英作用沉默p53表达的H-p53细胞后,DSBs的修复能力增强,DRC为87.68%.(3)石英作用p53siRNA的阴性对照细胞24 h后,S期细胞比例由(24.3±3.8)%增加到(31.8±1.1)%,差异有统计学意义(P<0.05);沉默p53表达后,石英诱导的HELF细胞S期细胞比例[(41.4±0.6)%]与同期对照组[(25.4±1.9)%]相比有明显增加.差异有统计学意义(P<0.05).结论 石英可诱导p53表达及磷酸化水平的增加,p53表达上调可抑制石英所致S期细胞百分比的增加及石英所致DNA双链断裂的修复.     

活化蛋白-1和细胞周期蛋白在石英诱导的细胞周期改变中的作用

目的 探讨在石英刺激的人胚肺成纤维细胞(HELF)中AP-1/细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)通路在细胞周期改变中的作用.方法 建立稳定转染空载体PXJ的HELF系(HELF-PXJ)及空载体PXJ与反义cyclin D1质粒或反义细胞周期蛋白依赖激酶(CDK4)质粒分别共转染的HELF系(简称anti-D1和anti-K4),将HELF-PXJ、anti-D1和anti-K4细胞分为对照组和石英刺激组(共6组),各对照组不加任何处理,石英刺激组用200 μg/ml石英处理细胞24h.检测AP-1对石英诱导的cyclin D1、CDK和E2F-4表达改变的影响.AP-1的化学抑制剂姜黄素(curcumin) 20μmol/L预处理细胞1h后,200 μg/ml石英刺激24 h,将HELF分为4组,分别为HELF对照组、HELF+石英组、HELF+curcumin对照组、HELF+curcumin+石英组.用免疫印迹(Western blot)法和免疫荧光法检测cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达;运用反义RNA技术证明通路的上下游关系;用流式细胞术检测细胞周期变化.结果 200 μg/ml石英处理HELF细胞,cyclin D1和CDK4蛋白表达升高,E2F-4蛋白表达明显降低,而E2F-1蛋白的表达没有明显改变.HELF-PXJ+石英组G1期细胞所占比例下降,S期细胞所占比例升高,与HELF-PXJ对照组的差异有统计学意义(P＜0.05).抑制cyclin D1或CDK4表达后,与对照组比较,anti-D1+石英组和anti-K4+石英组G1期细胞和S期细胞百分比无明显变化.抑制AP-1活性,与HELF+石英组比较,HELF+curcumin+石英组cyclin D1和CDK表达均减低,E2F-4表达增多.结论200μg/ml石英可诱导cyclin D1和CDK4蛋白表达增高,E2F-4蛋白表达减少,并通过AP-1/cyclin D1通路诱导细胞周期改变.     

苯并芘诱导人胚肺成纤维细胞cyclinD1、CDK4和E2F-1/4的表达改变

目的建立苯并芘诱导的具有转化细胞部分特征的人胚肺成纤维细胞(T-HELF)模型,并观察T-HELF细胞中cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达的改变。方法以200、100、50、25、5、1μmol/L的苯并芘处理人胚肺成纤维细胞(HELF)24小时,用噻唑蓝(MTT)比色法测定苯并芘的细胞毒性。根据MTT结果确定以100和200μmol/L苯并芘给HELF细胞染毒3次,染毒结束后培养6周观察细胞的形态变化,培养12周后观察其形态变化及软琼脂中细胞克隆的生长。用流式细胞仪检测T-HELF细胞周期的变化,用Western blot检测T-HELF细胞中cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达的改变。结果MTT结果显示苯并芘浓度在25~200μmol/L之间时,细胞存活率为78%~80%。苯并芘200μmol/L组染毒4周后细胞死亡。100μmol/L组染毒结束后培养6周,观察到细胞变大,核增大或多核;12周后,在软琼脂中可以生长为细胞克隆,说明HELF细胞具有了转化细胞的部分特征。T-HELF细胞在无血清培养时,细胞周期没有停滞。用Western blot检测发现和正常HELF细胞相比T-HELF细胞的cyclin D1表达明显增加,CDK4、E2F-1和E2F-4的表达没有明显变化。结论建立了苯并芘诱导的具有转化细胞部分特征的人胚肺成纤维细胞模型,可用于苯并芘致癌的分子机制研究。无血清培养时,T-HELF细胞周期没有停滞,和正常HELF细胞相比T-HELF细胞cyclin D1表达明显增加,cyclin D1可能与T-HELF细胞的快速增殖有关。     

Cyelin D1和CDK4正性调节苯并(a)芘所致人胚肺成纤维细胞周期改变

目的 研究苯并(a)芘[B(a)P]对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期分布及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白表达的影响,并探讨两种蛋白含量改变与细胞周期效应之间的关系.方法 将反义cychn D1质粒和反义CDK4质粒导入HELF细胞内.建立两种质粒稳定转染的细胞模型.用0.1、0.5、2.5和12.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h.用蛋白印迹方法检测cvclin D1和CDK4蛋白表达水平;利用流式细胞技术检测B(a)P处理对HELF细胞及两种稳定转染细胞系细胞周期的影响.结果 成功建立了反义cyelin D1和反义CDK4稳定转染的细胞系.不同剂量B(a)P处理可引起cvclin D1蛋白表达的显著增加,但对CDK4蛋白表达无明显影响;2.5/μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h后,引起其细胞周期G1期显著下降,S期显著增加;2.5μmol/L的B(a)P处理反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的HELF细胞24h后,对其细胞周期的分布无显著影响.结论 Cyelin D1和CDK4基因均参与了B(a)P所致细胞周期改变过程,并发挥正性调节作用.     

Cyclin D1和CDK4正性调节苯并(a)芘所致人胚肺成纤维细胞周期改变

目的研究苯并(a)芘[B(a)P]对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期分布及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白表达的影响,并探讨两种蛋白含量改变与细胞周期效应之间的关系。方法将反义cyclin D1质粒和反义CDK4质粒导入HELF细胞内,建立两种质粒稳定转染的细胞模型。用0.1、0.5、2.5和12.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h,用蛋白印迹方法检测cyclin D1和CDK4蛋白表达水平;利用流式细胞技术检测B(a)P处理对HELF细胞及两种稳定转染细胞系细胞周期的影响。结果成功建立了反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的细胞系。不同剂量B(a)P处理可引起cyclin D1蛋白表达的显著增加,但对CDK4蛋白表达无明显影响;2.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h后,引起其细胞周期G1期显著下降,S期显著增加;2.5μmol/L的B(a)P处理反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的HELF细胞24h后,对其细胞周期的分布无显著影响。结论Cyclin D1和CDK4基因均参与了B(a)P所致细胞周期改变过程,并发挥正性调节作用。     

Effects of p,p′-DDT,p,p′-DDD,and p,p′-DDE on oxygen uptake in the freshwater planarian (Phagocata gracilis)

Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology -     

p53、p63、p73在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的 探讨p53、p63和p73在鼻咽癌(NPC)组织中的表达及临床意义.方法 用免疫组织化学方法检测p53、p63和p73在56例鼻咽癌组织、15例鼻咽黏膜慢性炎症组织中的表达情况.结果 p53、p63和p73蛋白均表达于细胞核内.p53和p63在鼻咽癌组织中的阳性表达率明显高于慢性炎症组织,且差异有统计学意义(P＜0.01),p53和p63在鼻咽癌组织中表达的高低存在正相关性(P＜0.05).p73在鼻咽癌、慢性炎症组织中的表达差异无统计学意义(P＞0.05).p53、p63、p73蛋白表达水平与鼻咽癌患者的性别、发病年龄及颈淋巴结转移均无关(P＞0.05),p63、p73蛋白表达水平与NPC临床分期相关(P＜0.05).结论 通过检测p53、p63、p73蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况,可能在鼻咽癌的发生发展过程中其发挥着重要作用.     

胃癌患者p21和p15基因蛋白表达及意义

目的研究p21和p15基因蛋白在胃癌患者中的表达。方法采用χ²检验和多元Logistic回归分析分别对p21与p15基因蛋白在胃癌病人中免疫组织化学表达情况进行分析。结果<58岁的23例病人中,p21基因蛋白阳性和阴性分别有7,16例;p15基因蛋白阳性和阴性分别有4,19例;≥58岁的24例病人中,p21基因蛋白阳性和阴性分别有11,13例;p15基因蛋白阳性和阴性分别有9,15例;33例男性病人中,p21基因蛋白阳性和阴性分别有14,19例;p15基因蛋白阳性和阴性分别有9,24例;14例女性病人中p21和p15基因蛋白阳性和阴性均为4,10例。多因素Logistic回归分析结果显示,组织分化程度和淋巴结转移进入p21基因蛋白表达的Logistic回归模型,组织分化程度进入p15基因蛋白表达的Logistic回归模型(P<0.05)。结论p21与p15基因蛋白均是对机体有保护作用的抑癌基因。     

MiRNA-3p/5p在肿瘤中的研究进展

Pre-miRNA经Dicer酶剪切产生2个产物,分别是miRNA-3p和miRNA-5p,以往的研究多数都是以单一的miRNA-3p或者miRNA-5p为主,而miRNA-3p/5p成对调控肿瘤的发生发展却少有报道。本文就近年来miRNA-3p/5p与肿瘤的研究进展做一综述。