当归芍药散通过AMPK/mTOR通路对高糖诱导的足细胞损伤的影响

目的:探讨当归芍药散是否可以通过AMPK/mTOR信号通路激活自噬改善高糖诱导的足细胞损伤。方法:分别将足细胞分为正常对照组、模型组、当归芍药散含药血清组、自噬抑制剂组、当归芍药散含药血清加自噬抑制剂组、自噬激动剂、AMPK抑制剂、当归芍药散含药血清加AMPK抑制剂组和AMPK激动剂，并观察各组的自噬相关蛋白、细胞活性和细胞凋亡率。结果:与对照组相比，高糖组足细胞活力和Beclin-1/LC3/p-AMPK蛋白表达均降低，细胞凋亡率和p-mTOR蛋白表达均增加(P<0.01);和高糖组相比，当归芍药散含药血清组、自噬激动组、AMPK激动剂组的细胞活力和Beclin-1/LC3Ⅱ/p-AMPK蛋白表达均提高，细胞凋亡率和p-mTOR蛋白表达均降低(P<0.01);与高糖组相比，自噬抑制剂组、AMPK抑制剂组足细胞的细胞活力和Beclin-1/LC3Ⅱ/p-AMPK蛋白表达均降低，细胞凋亡率和p-mTOR蛋白表达均增加(P<0.01)。结论:当归芍药散可以通过AMPK/mTOR通路激活自噬改善高糖诱导的足细胞损伤。     

金雀异黄素对白介素-6诱导下SKOV3人卵巢癌细胞的抑制作用

目的探讨不同剂量金雀异黄素对白介素-6(IL-6)诱导的SKOV3人卵巢癌细胞增殖作用及其机制。方法将SKOV3人卵巢癌细胞分为5组,即对照组、IL-6组(25 ng/ml IL-6)、低(25 ng/ml IL-6+80μmol/L金雀异黄素)、中(25 ng/ml IL-6+120μmol/L金雀异黄素)和高剂量金雀异黄素组(25 ng/ml IL-6+160μmol/L金雀异黄素)。然后检测各组细胞增殖抑制率、凋亡率、迁移能力和侵袭能力,Western blot检测细胞CDK4和G1/S-特异性周期蛋白-D1(CyclinD1)表达情况。结果低、中和高剂量金雀异黄素组卵巢癌细胞增殖抑制率明显高于IL-6组(P0.05),凋亡率明显高于IL-6组(P0.01),低、中和高剂量金雀异黄素组卵巢癌细胞增殖率随金雀异黄素剂量上升明显降低(P0.05),而卵巢癌细胞凋亡率随金雀异黄素剂量上升明显增高(P0.01),上述差异均有统计学意义。低、中和高剂量组金雀异黄素和对照组卵巢癌细胞迁移率和穿膜细胞数明显低于IL-6组,低、中和高剂量金雀异黄素组卵巢癌细胞迁移率和穿膜细胞数随金雀异黄素剂量上升而降低,差异均有统计学意义(P0.01)。对照组、低、中和高剂量组卵巢癌细胞CDK4和CyclinD1蛋白表达明显低于IL-6组,低、中和高剂量组卵巢癌细胞CDK4和CyclinD1蛋白表达随金雀异黄素剂量上升明显降低,差异均有统计学意义(P0.01)。结论金雀异黄素可抑制IL-6诱导的SKOV3细胞增殖,其使用剂量越高,抑癌效果越好,机制可能是通过抑制CyclinD1/CDK4信号通路实现。     

高良姜素对非小细胞肺癌A549细胞SIRT1/mTOR通路及放射敏感性的影响

摘要：目的:探讨高良姜素对非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞沉默信息调节因子1（SIRT1）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路及放射敏感性的影响。方法:体外培养NSCLC A549细胞,细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测不同浓度(10,20,40,60,80,100μmol·L-1)高良姜素处理的A549细胞的增殖抑制率;将A549细胞经不同剂量（0,1,2,4,6,8 Gy）放射处理,并设置各剂量与35μmol·L-1高良姜素联用组,克隆形成实验观察高良姜素的放射增敏作用;将A549细胞分为高良姜素+放射线组(35μmol·L-1+6 Gy)、高良姜素组(35μmol·L-1)、放射线组（6 Gy）及对照组,流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法检测增殖蛋白细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞增殖核抗原（Ki67）、凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-9及STRT1/mTOR通路蛋白SIRT1、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、mTOR的表达。结果:与对照组比较,随着高良姜素浓度的增加,A549细胞增殖抑制率逐渐增加（P<0.05）;与各剂量射线单独处理的A549细胞相比,35μmol·L-1高良姜素+各剂量射线处理的A549细胞存活分数降低（P<0.05）,辐射增敏比（SER）=1.522;与对照组比较,高良姜素组、放射线组、高良姜素+放射线组A549细胞凋亡率、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK/AMPK蛋白表达显著升高,CyclinD1、Ki67、SIRT1、p-mTOR/mTOR蛋白表达显著降低（P<0.05）;与高良姜素组、放射线组比较,高良姜素+放射线组A549细胞凋亡率、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK/AMPK蛋白表达显著升高,高良姜素+放射线组CyclinD1、Ki67、SIRT1、p-mTOR/mTOR蛋白表达显著降低（P<0.05）。结论:高良姜素可能通过调控SIRT1/mTOR通路影响A549细胞的增殖凋亡及放射敏感性,可能是治疗NSCLC的潜在药物。     

3-溴丙酮酸通过AMPK/mTOR信号通路调控成纤维样滑膜细胞凋亡/自噬失衡的作用北大核心CSCD

目的基于AMPK/mTOR信号通路探讨3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-BrPA)对大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)凋亡、自噬的调控作用和机制。方法使用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导体外培养的大鼠FLS来构建类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)模型。MTT实验检测TNF-α诱导FLS以及3-BrPA治疗FLS的适宜浓度,划痕实验和Transwell实验检测3-BrPA对FLS迁移和侵袭能力的影响,流式细胞术和JC-1线粒体膜电位实验检测FLS的凋亡情况,mCherry-EGFP-LC3B过表达质粒检测FLS自噬流变化,Western blot检测FLS凋亡/自噬相关蛋白及AMPK/mTOR通路相关蛋白的表达。结果3-BrPA(15μmol·L^(-1))明显抑制了TNF-α(25μg·L^(-1))刺激下FLS的增殖、迁移和侵袭。此外,还促进FLS凋亡、下调FLS线粒体膜电位并阻断FLS的自噬流。Western blot检测结果显示,相比于TNF-α组,3-BrPA上调caspase-3、Bax、P62和p-mTOR/mTOR的表达,下调LC3B、Beclin1、Bcl-2和p-AMPK/AMPK的表达。结论3-BrPA能够在体外调节大鼠FLS凋亡/自噬失衡来抑制其异常活化,其机制可能与抑制AMPK/mTOR信号通路有关。     

槲皮素抑制TGF-β1诱导SMMC-7721人肝癌细胞发生EMT的效果研究

目的旨在研究槲皮素抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导SMMC-7721人肝癌细胞发生上皮-间质转化(EMT)的效果。方法将肝癌细胞分为对照组(10 ng/ml TGF-β1)、低剂量组(50 nmol/l槲皮素+10 ng/ml TGF-β1)、高剂量组(10 ng/ml TGF-β1+100 nmol/l槲皮素),分别处理6 h,光学显微镜观察肝癌细胞形态学变化。6、12和24 h后,观察肝癌细胞迁移及侵袭能力。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定肝癌细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA表达。Western blot法测定肝癌细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白。结果经TGF-β1诱导后,肝癌细胞发生明显EMT。划痕实验结果显示,12和24 h时,高剂量组和低剂量组肝癌细胞迁移划痕空隙长度明显低于对照组(P0.05)。侵袭实验中,与对照组比较,低和高剂量组每视野穿膜肝癌细胞数明显降低,且高剂量组穿膜高于低剂量组(P0.05)。RT-PCR实验结果显示,对照组E-cadherin mRNA表达明显低于高剂量组和低剂量组(P0.01),N-cadherin和Vimentin mRNA表达明显高于高剂量组和低剂量组(P0.01)。低剂量E-cadherin mRNA表达明显低于高剂量组(P0.01),N-cadherin和Vimentin mRNA表达明显高于高剂量组(P0.01)。Western blot实验结果显示,对照组E-cadherin蛋白表达明显低于高剂量组和低剂量组(P0.01),N-cadherin、Vimentin蛋白明显高于高剂量组和低剂量组(P0.01)。高剂量组E-cadherin蛋白表达明显高于低剂量组(P0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显低于低剂量组(P0.01)。结论槲皮素通过增加E-cadherin蛋白表达表达,降低N-cadherin、Vimentin蛋白表达,使得TGF-β1诱导的肝癌细胞EMT得到明显抑制。     

达克替尼通过抑制EGFR表达促白介素-6诱导非小细胞癌细胞株A549凋亡的效果

目的旨在探讨达克替尼通过Ark-5/MAPK通路抑制EGFR表达促白介素-6(IL-6)诱导非小细胞癌细胞株A549凋亡的效果。方法 A549分成对照组、诱导组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,诱导组添加25 ng/ml IL-6,低剂量组添加25 ng/ml IL-6+0. 1μmol/L达克替尼,中剂量组添加25 ng/ml IL-6+1μmol/L达克替尼,高剂量组添加25 ng/ml IL-6+10μmol/L达克替尼,对照组添加等剂量磷酸盐缓冲液(PBS)。MTT法检测各组A549细胞存活率。荧光染色检测各组A549细胞凋亡形态。蛋白免疫印迹(Western blot)法测定各组A549细胞凋亡相关蛋白的表达。结果 MTT检测结果显示,高剂量组和中剂量组的A549细胞存活抑制率明显高于低剂量组和对照组(P0. 05),中剂量组A549细胞存活抑制率最高(P0. 05)。染色结果显示,对照组内A549细胞呈现淡蓝色椭圆形或圆形,存在部分蓝白色荧光凋亡细胞;诱导组内A549细胞少见蓝色荧光凋亡细胞;经达克替尼干预后,中剂量组A549细胞凋亡细胞数量最多,凋亡蓝白色荧光细胞质凝聚联,高剂量组凋亡蓝白色荧光细胞数量多于低剂量组。对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组A549细胞凋亡率明显高于诱导组(P0. 01),低剂量组、中剂量组、高剂量组A549细胞凋亡率均明显高于对照组(P0. 01),中剂量组的细胞凋亡率最高。对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组EGFR、Ark-5、ERK1/2、p-EGFR、p-Ark-5和p-ERK1/2蛋白表达明显低于诱导组(P0. 01),中剂量组EGFR、Ark-5、ERK1/2、p-EGFR、p-Ark-5和p-ERK1/2蛋白表达明显高于低剂量组和高剂量组(P0. 01)。结论达克替尼能够通过抑制Ark-5/MAPK通路降低EGFR表达,从而促进IL-6诱导后非小细胞癌细胞株A549凋亡。     

百合知母汤对癫痫模型幼鼠行为学和海马神经发生及AMPK/mTOR水平的影响

目的探讨百合知母汤水提物对戊四氮(PTZ)诱导癫痫幼鼠行为学和海马齿状回神经发生及神经元AMPK、mTOR水平的影响。方法实验动物分为5组:正常组,模型组和百合知母汤水提物低、中、高剂量组。PTZ诱导建立癫痫模型幼鼠,分别尾静脉注射40、80和120 mg/ml百合知母汤水提物,模型组注射同等剂量生理盐水。正常组幼鼠注射同等剂量生理盐水,测定各组幼鼠行为学、海马齿状回神经发生和海马神经元AMPK、mTOR mRNA及蛋白水平。结果百合知母汤水提物低、中和高剂量组幼鼠发生II级以上惊厥次数、潜伏期时间和游泳距离明显低于模型组幼鼠(P0.05)。随百合知母汤水提物剂量的增加,癫痫幼鼠发生II级以上惊厥次数逐渐下降(P0.05),潜伏期时间和游泳距离逐渐上升(P0.05)。免疫组化结果显示,模型组幼鼠海马BrdU免疫阳性细胞呈现大片丛集性分布,百合知母汤水提物剂量组幼鼠海马BrdU免疫阳性细胞逐渐减少。百合知母汤水提物高剂量组幼鼠AMPK mRNA及蛋白和p-AMPK表达低于模型组幼鼠(P0.05),而mTOR mRNA及蛋白和p-mTOR表达高于正常组幼鼠(P0.05),且存在一定的剂量-效应关系。结论百合知母汤能够降低癫痫幼鼠海马神经元AMPK表达,提升海马神经元mTOR表达,改善癫痫幼鼠行为学改变及症状。     

替吉奥联合草酸铂对白细胞介素-6诱导的胃癌细胞侵袭机制影响

目的观察替吉奥联合草酸铂对白细胞介素-6(IL-6)诱导的胃癌细胞侵袭的影响,并探究其机制。方法选取人胃癌SGC7901细胞,设对照组、IL-6组、IL-6+替吉奥组、IL-6+草酸铂组和IL-6+替吉奥+草酸铂组;IL-6组滴入50 ng/ml IL-6,IL-6+替吉奥组滴入50 ng/ml+替吉奥20 mg/L,IL-6+草酸铂组滴入50 ng/ml IL-6+20 mg/L草酸铂,IL-6+替吉奥+草酸铂组滴入50 ng/ml IL-6+20 mg/L替吉奥+20 mg/L草酸铂,对照组未接受任何药物干预。用MTT方法测定其对细胞生长抑制作用,Transwell法测定细胞侵袭能力,ELISA法测定细胞上清液中MMP-2、VEGF水平,Western blotting方法检测细胞中AKT、p-AKT蛋白的表达水平,并对结果进行比较。结果在24、48和72 h时IL-6+替吉奥+草酸铂组胃癌细胞的生长抑制率明显的高于IL-6+替吉奥组和IL-6+草酸铂组,差异具有统计学意义(P0.01);替吉奥+草酸铂对IL-6作用的胃癌细胞侵袭率明显的高于单一的替吉奥或草酸铂,差异具有统计学意义(P0.01);IL-6+替吉奥+草酸铂组上层细胞液中的MMP-2、VEGF水平明显的低于IL-6+替吉奥组和IL-6+草酸铂组;IL-6+替吉奥+草酸铂组中AKT的表达量明显高于IL-6+替吉奥组和IL-6+草酸铂组,p-AKT的表达量明显的低于IL-6+替吉奥组和IL-6+草酸铂组,差异有统计学意义(P0.05)。结论替吉奥联合草酸铂可以抑制胃癌SGC7901细胞侵袭,其机制可能与调控ATK信号通路有关。     

大蒜素抑制胃癌细胞上皮-间质转化作用及其机制

目的研究大蒜素对胃癌细胞上皮-间质转化(EMT)的抑制作用及其机制。方法以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养人胃癌细胞株HGC-27,分别采用大蒜素(3μg·L^-1)联合白细胞介素6(IL-6,50 ng·mL^-1)、大蒜素(3μg·L^-1)、IL-6(50 ng·mL^-1)处理,另设空白对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测各组胃癌HGC-27细胞E-cadherin、vimentin及核因子-κB(NF-κB)P65的mRNA表达;Wst-3-2H-四唑单钠盐(CCK-8)实验、细胞划痕实验及细胞侵袭实验检测各组胃癌HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭能力。结果RT-qPCR显示,与空白对照组比较,大蒜素组E-cadherin mRNA表达上调,vimentin及NF-κB mRNA表达下调;IL-6组E-cadherin mRNA表达下调,vimentin及NF-κB P65的mRNA表达上调(均P<0.05)。与IL-6组比较,大蒜素联合IL-6组E-cadherin mRNA表达上调,vimentin与NF-κB mRNA表达下调(均P<0.05)。CCK-8实验结果显示,与空白对照组比较,大蒜素组胃癌HGC-27细胞被明显抑制,IL-6组具有明显增殖优势;与IL-6组比较,大蒜素联合IL-6组细胞被抑制(均P<0.05);划痕实验中,与空白对照组比较,12,24 h大蒜素组胃癌细胞迁移能力明显减弱;与IL-6组比较,大蒜素联合IL-6组划痕愈合百分比缩小(均P<0.05)。细胞侵袭实验中,与空白对照组比较,大蒜素组侵袭数目减少,IL-6组侵袭数目明显增多;大蒜素联合IL-6组细胞侵袭能力较IL-6组明显减弱(均P<0.05)。结论大蒜素能明显抑制胃癌细胞EMT,减弱其增殖、迁移及侵袭能力,该过程可能与调节NF-κB信号通路有关。     

罗哌卡因对白细胞介素-1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用探究

目的 基于腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物西罗莫司靶蛋白(mTOR)通路探究罗哌卡因对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞损伤的保护作用。方法 对软骨细胞进行培养,将软骨细胞随机分为对照组、模型组和低、中、高剂量实验组。对照组常规培养,模型组用含10 ng·mL^-1IL-1β的培养基刺激细胞24 h,低、中、高剂量实验组在模型组的基础上,用25,50,100 mg·L^-1的罗哌卡因进行处理。用细胞计数法-8(CCK-8)检测各组细胞的增殖情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况;用蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞凋亡相关蛋白、细胞外基质降解相关蛋白及细胞中磷酸化AMPK(p-AMPK)和磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达的影响。结果 与对照组比较,模型组24,48,72 h OD值降低;与模型组相比,中、高剂量实验组24,48,72 h OD值均明显升高(均P<0.05)。对照组、模型组和低、中、高剂量实验组细胞凋亡率分别为(4.24±0.64)%,(18.13±1.53)%,(14.93±0.52)%...     

槲皮素抑制TGF-β1诱导SMMC-7721人肝癌细胞发生EMT的效果研究CSCD

目的旨在研究槲皮素抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导SMMC-7721人肝癌细胞发生上皮-间质转化(EMT)的效果。方法将肝癌细胞分为对照组(10 ng/ml TGF-β1)、低剂量组(50 nmol/l槲皮素+10 ng/ml TGF-β1)、高剂量组(10 ng/ml TGF-β1+100 nmol/l槲皮素),分别处理6 h,光学显微镜观察肝癌细胞形态学变化。6、12和24 h后,观察肝癌细胞迁移及侵袭能力。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定肝癌细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA表达。Western blot法测定肝癌细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白。结果经TGF-β1诱导后,肝癌细胞发生明显EMT。划痕实验结果显示,12和24 h时,高剂量组和低剂量组肝癌细胞迁移划痕空隙长度明显低于对照组(P<0.05)。侵袭实验中,与对照组比较,低和高剂量组每视野穿膜肝癌细胞数明显降低,且高剂量组穿膜高于低剂量组(P<0.05)。RT-PCR实验结果显示,对照组E-cadherin mRNA表达明显低于高剂量组和低剂量组(P<0.01),N-cadherin和Vimentin mRNA表达明显高于高剂量组和低剂量组(P<0.01)。低剂量E-cadherin mRNA表达明显低于高剂量组(P<0.01),N-cadherin和Vimentin mRNA表达明显高于高剂量组(P<0.01)。Western blot实验结果显示,对照组E-cadherin蛋白表达明显低于高剂量组和低剂量组(P<0.01),N-cadherin、Vimentin蛋白明显高于高剂量组和低剂量组(P<0.01)。高剂量组E-cadherin蛋白表达明显高于低剂量组(P<0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显低于低剂量组(P<0.01)。结论槲皮素通过增加E-cadherin蛋白表达表达,降低N-cadherin、Vimentin蛋白表达,使得TGF-β1诱导的肝癌细胞EMT得到明显抑制。     

miR-34a改变自噬通路AMPK/mTOR的活性在心肌细胞肥大中的作用

目的 研究 miR-34a 与自噬通路磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）在血管紧张素（Ang）Ⅱ 诱导的原代大鼠心肌细胞肥大中的作用。 方法 体外培养原代大鼠心肌细胞, 分成 3 组： 阴性对照慢病毒（NC）组、AngⅡ 刺激+阴性对照慢病毒（AngⅡ +NC）组、AngⅡ 刺激+miR-34a 过表达慢病毒（AngⅡ +miR-34a）组。激光共聚焦检测心肌细胞肥大变化; 利用荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测 miR-34a、心房钠尿肽（ANP）和 β- 肌球蛋白重链（β-MHC）表达; 利用蛋白印迹（Western blot）测定 AMPK/mTOR 信号通路的活性变化。 结果 与 NC 组比较, AngⅡ +NC 组心肌细胞表面积明显增大（P＜ 0.05）; 与 AngⅡ +NC 组比较, AngⅡ +miR-34a 组心肌细胞表面积减少（P＜ 0.05）。 与 NC 组比较, AngⅡ +NC 组的 miR-34a 表达下调, ANP 和 β-MHC 表达上调（均 P＜ 0.05）; 而与 AngⅡ +NC 组比较, AngⅡ +miR-34a 组的 miR-34a 表达上调, ANP 和 β-MHC 表达下调（均 P＜ 0.05）。 与 NC 组比较, AngⅡ +NC 组 p-AMPK/AMPK 增加, p-mTOR/mTOR 减少（均 P＜ 0.05）; 与 AngⅡ +NC 组比较, AngⅡ +miR-34a 组 p-AMPK/AMPK 减少, p-mTOR/mTOR 增加（均 P＜ 0.05）。 结论 miR-34a 能抑制 AngⅡ 诱导的心肌细胞肥大, 其作用部分是通过改变 AMPK/mTOR 的活性来实现的。     

雷帕霉素对宫颈癌患者HeLa细胞侵袭转移抑制作用的实验

目的:研究雷帕霉素对宫颈癌患者HeLa细胞侵袭转移抑制作用。方法:取宫颈癌患者HeLa细胞标本进行实验,空白组不加雷帕霉素,雷帕霉素组加入雷帕霉素30 nmol/L,分别培养48 h后,采用MTT法检测细胞活力(计算细胞生长抑制率)、Transwell法检测细胞迁移侵袭能力,以及采用Western blot法检测蛋白激酶B(Akt)和兔抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平以及兔抗基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、兔抗基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、波形蛋白(Vimentin)与钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平。结果:雷帕霉素组患者宫颈癌HeLa细胞生长抑制率、E-cadherin表达率明显多于对照组(P<0.05),且宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭数量、Akt与mTOR磷酸化水平、MMP-2、MMP-9与Vimentin表达明显少于对照组(P<0.05)。结论:雷帕霉素能抑制宫颈癌HeLa细胞的侵袭转移,主要是通过Akt/mTOR信号通路发挥作用。     

利拉鲁肽通过调控AMPK/mTOR自噬信号减轻糖尿病大鼠心肌炎症和氧化应激损伤

目的 探讨利拉鲁肽(liraglutide, LRG)改善2型糖尿病(T2DM)大鼠心肌炎症和氧化应激损伤的可能机制。方法 选取40只雄性SD大鼠,分为对照组(CON)、T2DM组、LRG组、LRG+AMPK抑制剂Compound C组(LRG+CC)。4周后,检测大鼠血糖、血脂;彩色多普勒超声检测大鼠心功能;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况;Western blot检测心肌炎症、氧化应激、凋亡、自噬及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达。结果 LRG能降低T2DM大鼠高血糖、高血脂,改善心功能指标;LRG能降低T2DM大鼠心肌IL-6、TNF-α、IL-1β、NOX2、NOX4、cleaved caspase-3、Bax、p-mTOR/mTOR表达及MDA含量,增加Bcl-2、Atg5、Beclin-1、LC3-II/LC3-I、p-AMPK/AMPK表达及SOD、GSH活性,从而抑制心肌炎症、氧化应激和凋亡,并增强自噬,但使用AMPK抑制剂Compound C能够明显逆转LRG的作用。结论 LRG可通过调控AMPK/mTOR自噬信号减轻T2DM大鼠心肌炎症和氧化应激损伤。     

金匮肾气汤促进糖尿病小鼠肾脏足细胞自噬

目的探讨金匮肾气汤对db/db糖尿病小鼠肾脏足细胞自噬的影响及机制。方法将6周龄db/db糖尿病小鼠随机分为生理盐水组、金匮肾气汤低、高剂量组、二甲双胍组,均灌胃给药;♂db/m小鼠作为正常对照组。于第18周龄处死动物,留24 h尿检测尿白蛋白、肌酐;取血,检测血糖、肌酐;留取肾脏组织,分别进行PAS染色观察肾小球内细胞外基质增生情况,免疫组织化学检测WT1在肾组织的表达,透射电子显微镜观察足细胞内自噬体情况,Western blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK在肾组织的表达。结果与db/db糖尿病小鼠组比较,金匮肾气汤治疗后,24 h尿白蛋白减少、尿白蛋/肌酐下降、血肌酐下降(P<0.05),肾小球内系膜增宽程度减轻,足细胞内自噬体增加,WT1阳性细胞核数量明显增加(P<0.05),肾皮质内LC3Ⅱ表达明显增强、p62表达明显降低(P<0.05),AMPK磷酸化明显增加,mTOR磷酸化受到抑制(P<0.05)。结论金匮肾气汤通过AMPK-mTOR途径,促进足细胞自噬,保护足细胞,延缓糖尿病肾病的进展。     

欧前胡素调节MAPK/mTOR/p70S6K信号通路对急性髓系白血病细胞恶性生物学行为的影响

目的 探讨欧前胡素(IMP)对急性髓系白血病(AML)细胞恶性生物学行为的影响以及对MAPK/mTOR/p70S6K信号通路的调节机制。方法 将人AML细胞HL-60进行培养传代,并分为对照组(未处理组),ERK抑制剂组(PD98059组),IMP低、中、高剂量组,IMP高剂量+ERK激活剂组(IMP高+Cearoin组),每组均设置6个重复。MTT法检测IMP对HL-60细胞的毒性;MTT法、软琼脂克隆形成实验检测HL-60细胞的增殖活性;流式细胞仪术检测HL-60细胞凋亡;Transwell小室检测HL-60细胞迁移和侵袭能力;ELISA检测HL-60细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;Western blot检测通路相关蛋白及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达。结果 与未处理组比较,PD98059组和IMP低、中、高剂量组HL-60细胞的存活率、克隆形成数量、迁移和侵袭数量、促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及ERK1/2、mTOR、p70S6K磷酸化水平、Bcl-2表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、自噬相关蛋白Becl...     

厄贝沙坦激活PPAR-γ介导AMPK/mTOR通路诱导自噬改善LO2细胞脂肪变

摘要：目的　探讨厄贝沙坦调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）介导磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路及自噬对LO2细胞脂肪变的影响。方法　采用脂混合物（LM）诱导LO2细胞建立细胞脂肪变模型,将造模后细胞分为模型组、厄贝沙坦组和厄贝沙坦联合PPAR-γ抑制剂组,另设正常组。分别干预24 h后,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测细胞三酰甘油（TG）和总胆固醇（TC）含量,并行油红O染色分析细胞内脂质沉积,通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞PPAR-γ、AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达,应用激光共聚焦技术观察自噬标志蛋白LC3B的变化。结果　10 μmol/L及以下浓度的厄贝沙坦对LO2细胞生长无明显毒性作用,20 μmol/L厄贝沙坦对细胞毒性作用较大,表现出明显的抑制作用。与正常组比较,模型组LO2细胞内TG和TC含量升高,油红O染色显示脂质大量沉积,PPAR-γ、p-AMPK和LC3B蛋白表达水平降低,mTOR磷酸化水平升高（均P＜0.05）;与模型组比较,经厄贝沙坦治疗后,LO2细胞内TG和TC含量降低,油红O染色显示脂质沉积减少,PPAR-γ、p-AMPK和LC3B蛋白表达水平升高,mTOR磷酸化水平降低（均P＜0.05）;但经厄贝沙坦联合PPAR-γ抑制剂干预后,PPAP-γ抑制剂抑制了厄贝沙坦对LO2细胞脂肪变的治疗作用。结论　厄贝沙坦可通过激活PPAR-γ介导的AMPK/mTOR信号通路,促进LM诱导LO2细胞的自噬,从而减轻脂质沉积,改善肝细胞脂肪变。     

下调TP53INP1基于PI3K/AKT/mTOR信号通路对宫颈癌细胞凋亡、侵袭、迁移的影响

目的 分析下调肿瘤蛋白P53诱导性核蛋白1(TP53INP1)基于PI3K/AKT/mTOR信号通路对宫颈癌细胞凋亡、侵袭、迁移的影响。方法 按照脂质体2000说明书对细胞进行转染TP53INP1 mimics及TP53INP1 inhibitor,按照实验设计，将其分为对照组及上调组(TP53INP1 inhibitor)、下调组(TP53INP1 mimics)。荧光定量PCR法检测TP53INP1表达量，采用细胞划痕实验法检测细胞迁移能力，采用流式细胞仪检测细胞凋亡能力，采用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力，Western blot法检测PI3K/AKT/mTOR通路中PI3K、AKT、mTOR表达量。结果 上调组表达量高于下调组TP53INP1,差异有统计学意义(P<0.05);下调组凋亡率高于上调组，差异有统计学意义(P<0.05);下调组侵袭能力、迁移能力低于上调组，差异有统计学意义(P<0.05);下调组PI3K、AKT、mTORBax蛋白表达量低于上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TP53INP1在宫颈癌中呈现高表达，下调...     

miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制研究

目的探讨miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制。方法采用人宫颈癌HeLa细胞株构建宫颈癌大鼠模型,分为Gg组(宫颈癌大鼠)、Gm组(注射miR-10b-mimics)、Gi组(注射miR-10b-inhibitions)。采用HE染色观察癌组织变化,Western blotting、RT-PCR检测mTOR/P70S6K的mRNA和蛋白表达水平,Transwell检测HeLa细胞的侵袭能力。结果Gg组肿瘤组织出现丰富的血供,界限分明,切面呈鱼肉状,肿瘤细胞大小较为均等;Gm组肿瘤组织中有大量纤维血管形成,肿瘤细胞大小不等,胞浆着色较深;Gi组肿瘤组织中纤维血管较少,胞浆着色稍浅。Western blotting结果显示,mTOR/P70S6K蛋白表达水平为Gm组Gg组>Gm组(P<0.05),miR-10b mRNA水平为Gi组Gg组>Gm组(P<0.05)。结论miR-10b过表达可激活mTOR蛋白,增加P70S6K活性,抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。     

2-脱氧葡萄糖联合二甲双胍抗人肝癌HepG2细胞作用及与AMPK、mTOR相关性研究

目的 考察2-脱氧葡萄糖（2-DG）联合二甲双胍（Met）协同抗人肝癌HepG2细胞作用并探索其机制。方法 刃天青法测定2-DG及Met单独及联合应用对HepG2细胞的生长抑制作用,利用金氏公式计算联合用药Q值;利用高内涵细胞成像系统考察单独及联合用药对细胞线粒体膜电位及活性氧产生的影响;Western blotting检测Cleave-Caspase 3、p-AMPK及p-mTOR的蛋白变化;考察AMPK及mTOR抑制剂对联合用药后细胞生长抑制作用的影响。结果 2-DG、Met单独应用的IC₅₀值分别为2.45及16.35 mmol/L,联合用药对细胞生长抑制具有协同作用,Q值均大于1.15;联合用药能显著降低细胞内线粒体膜电位及p-mTOR蛋白表达,显著增加细胞内活性氧产生及Cleave-Caspase3、p-AMPK蛋白表达;抑制AMPK或mTOR能显著增加联合用药对细胞的生长抑制作用（P<0.05、0.01）。结论 2-DG联合Met具有协同抑制HepG2细胞增殖作用,其机制与降低细胞线粒体膜电位,促进活性氧产生、细胞凋亡,以及非AMPK依赖性的抑制mTOR活化有关。