低氧状态下骨细胞参与破骨细胞形成的作用机制研究

目的 探究低氧状态下骨细胞对破骨细胞形成的作用及其机制。方法 用去铁胺甲磺酸（DFO）刺激骨细胞系MLO-Y4建立体外低氧骨细胞培养体系。CCK-8实验检测DFO对MLO-Y4细胞增殖活性的影响;采用DFO处理后的MLO-Y4细胞培养液制备条件培养基诱导RAW264.7细胞分化,行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测;利用实时荧光定量聚合酶链反应、细胞免疫荧光和蛋白质印迹（Western blot）检测DFO作用下MLO-Y4表达低氧诱导因子（HIF）-1α与核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的情况;检测HIF-1α siRNA转染对MLO-Y4表达HIF-1α和RANKL的影响。结果 100 μmol·L ^-1 DFO作用24 h时MLO-Y4增殖活性升高,之后随着时间延长细胞增殖活性下降（P<0.01）。加入可溶性RANKL后,低氧组可见破骨细胞形成明显增加（P<0.001）。100 μmol·L ^-1 DFO作用下,HIF-1α mRNA表达稳定,RANKL mRNA的表达随时间明显变化,24 h时最高（P<0.01）;HIF-1α、RANKL蛋白表达升高（P<0.01）。低氧状态下siHIF-1α转染可降低HIF-1α和RANKL的表达（P<0.01）,破骨细胞减少（P<0.01）。结论 低氧状态下MLO-Y4可通过上调HIF-1α的蛋白水平促进RANKL的生成,进而加速RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的 观察布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法 破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L ^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA（siRNA）24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果 RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,其增殖及分化能力也明显受到抑制（P<0.05）。结论 抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。     

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的 观察布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法 破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L ^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA（siRNA）24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果 RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,其增殖及分化能力也明显受到抑制（P<0.05）。结论 抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。     

Notch信号促进核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞分化的体外研究

目的 探讨Notch信号抑制对核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。方法 建立RANKL诱导的小鼠RAW264.7细胞体外分化模型,实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）检测Notch信号成分（Notch1、Notch2、Delta1、Jagged1）、下游靶基因Hes1以及破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和Cathepsin K在诱导前后mRNA的表达。在诱导体系中加入不同浓度的γ分泌酶抑制剂（GSI）,抑制Notch受体的表达,TRAP染色检测破骨细胞分化的变化情况。结果 50 ng•mL-1 RANKL诱导小鼠RAW264.7细胞3 d,Notch1、Notch2、Delta1、Jagged1及Hes1的mRNA表达均有不同程度的提高,其中以Notch2、Jagged1增高最明显;破骨细胞标志基因表达显著增高。在RANKL诱导的同时加入不同浓度GSI,抑制Notch的表达,可致Notch下游靶基因Hes1表达下降,同时TRAP阳性细胞计数显著减少,且呈剂量依赖性。结论 Notch信号可促进RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激巨噬细胞表达髓样细胞触发受体-1的研究

目的 探索牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）刺激的巨噬细胞中髓样细胞触发受体-1（TREM-1）、可溶性TREM-1（sTREM-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达,探讨TREM-1与牙周炎发病机制的可能关联。方法 使用豆蔻酰佛波醇乙酯诱导人单核细胞系细胞THP-1分化为巨噬细胞,分别予以0（空白对照）、0.5、1.0 μg·mL ^-1的Pg-LPS刺激,并根据不同时间分组：孵育4、6、12、24 h组。实时定量聚合酶链反应检测巨噬细胞中TREM-1 mRNA的表达,Western blot分析TREM-1蛋白表达的差异,细胞免疫荧光染色检测TREM-1在巨噬细胞中的表达部位,并通过酶联免疫吸附试验对细胞培养液中的sTREM-1及TNF-α进行检测。结果 与空白对照组相比,Pg-LPS刺激巨噬细胞后TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白及细胞培养上清液中的sTREM-1表达均显著增强（P<0.05）;1.0 μg·mL ^-1 Pg-LPS组TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白及细胞培养上清液中的sTREM-1表达量高于0.5 μg·mL ^-1组,且分别从6、4、4 h时间点开始差异具有统计学意义（P<0.05）;细胞免疫荧光染色结果显示,Pg-LPS（1.0 μg·mL ^-1）刺激巨噬细胞24 h后,可见TREM-1蛋白呈阳性染色,且TREM-1的染色部位主要位于巨噬细胞的细胞膜区域;Pg-LPS刺激巨噬细胞后TNF-α的分泌水平升高（P<0.05）,其中1.0 μg·mL ^-1 Pg-LPS组表达量高于0.5 μg·mL ^-1组,且从12 h开始差异具有统计学意义（P<0.05）;0.5 μg·mL ^-1 Pg-LPS刺激巨噬细胞后TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白、sTREM-1间表达呈正相关（r=1,P<0.05）,但与TNF-α表达不存在相关性;在1.0 μg·mL ^-1 Pg-LPS刺激巨噬细胞后检测到了具有统计学意义的sTREM-1与TNF-α表达的正相关性（r=1,P<0.05）。结论 巨噬细胞受到Pg-LPS刺激后可出现Pg-LPS浓度依赖性的TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白及细胞培养上清液中的sTREM-1表达上调,且能观测到三者之间表达的正相关性;同时细胞培养上清液中的TNF-α也出现Pg-LPS浓度依赖性的表达上调,在高浓度Pg-LPS（1.0 μg·mL ^-1）刺激下与sTREM-1表达量呈正相关。该结果提示,TREM-1作为促炎受体蛋白,可能通过调节巨噬细胞TNF-α的表达来实现牙周炎发展的促进作用。     

白细胞介素-24通过Jak-Stat通路对破骨细胞影响的实验研究

目的:研究白细胞介素-24(interleukin-24,IL-24)在体外通过Jak-Stat信号通路对单核巨噬细胞向破骨细胞分化的影响。方法:使用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)确定最佳感染复数(MOI);使用ELISA检测培养基中IL-24的含量;采用Real-time PCR方法检测RAW264.7细胞中Jak-Stat信号通路相关基因Jak1、Jak2、Jak3、Stat1、Stat2、Stat3及其向破骨细胞分化过程中相关基因NFATc1、CTSK、MMP9 mRNA的表达。结果:MOI=600为最佳转染效率;转染组IL-24含量显著高于未转染组(P＜0.01);在RANKL诱导条件下转染IL-24的RAW264.7细胞与未转染组相比Jak2、Stat3 mRNA的表达增加(P＜0.05),在RANKL诱导条件下转染IL-24的RAW264.7细胞加入信号通路抑制剂后与未加入抑制剂组相比,向破骨细胞分化过程中相关基因NFATc1、CTSK、MMP9 mRNA的表达降低(P＜0.05)。结论:IL-24通过Jak-Stat信号通路调控破骨细胞的分化及功能。     

流体剪切力对MLO—Y4骨细胞骨性标志物表达的影响

目的通过研究MLO-Y4骨细胞受流体剪切力作用前后骨性标志物在mRNA水平的表达变化,探讨机械力影响骨组织代谢中骨细胞的作用。方法以小鼠成骨细胞(MOB)为参照,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MLO-Y4细胞在体外培养条件下,以及受流体剪切力作用0.5 h,1 h,2 h,4 h,6 h,12 h,24 h后骨性标志物在mRNA水平的表达特征和变化。结果以MOB为参照,在mRNA水平,体外培养条件下MLO-Y4细胞骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)高表达;破骨细胞分化因子(RANKL)、骨保护因子(OPG)低表达,但RANKL/OPG比值明显高于MOB。受流体剪切力作用后,MLO-Y4细胞ALP、OCN表达降低;RANKL和OPN表达增加;OPG随加力时间也有一定变化。结论 MLO-Y4细胞具有分化终末骨细胞的特点;流体剪切力作用后,RANKL/OPG比值以及ALP、OCN和OPN等骨性标志物的表达发生变化,为其参与机械力信号到生物信号的传导过程提供了间接证据。     

核因子κB受体活化因子配体和肿瘤坏死因子α经炎性牙周膜干细胞外泌体促进破骨细胞分化

目的　慢性牙周炎表现的病理性骨吸收非常常见,牙周膜干细胞（PDLSCs）的外泌体（Exo）对骨吸收的作用和影响尚不明确,本研究分析了该Exo蛋白组分对破骨细胞分化的影响。方法　分别从正畸前拔牙患者和慢性牙周炎患者的牙周膜组织中提取PDLSCs,通过流式细胞术检测表面标记物;通过差速离心分别提取2种细胞的Exo,即Exo-WT和Exo-CP,并通过Western blot、透射电子显微镜（TEM）、蛋白浓度检测、纳米粒径追踪检测Exo特征;通过蛋白质谱检测2种Exo的蛋白组分;通过酶联免疫吸附（ELISA）验证了差异表达蛋白肿瘤坏死因子α（TNF-α）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、白细胞介素（IL）-1α、转化生长因子β（TGF-β）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达水平;将10、100、1 000 μg·mL^-1的Exo-CP或Exo-WT加入RAW264.7培养基中并于5 d时通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blot、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨分化相关指标表达情况;采用SPSS 24.0软件对实验数据进行统计学分析。结果　Exo-CP富集的差异表达蛋白主要与破骨细胞分化的TNF信号通路、核转录因子κB（NF-κB）信号通路相关;ELISA实验证实了Exo-CP中高表达TNF-α、RANKL、IL-1α,低表达TGF-β1、BMP-2（P<0.05）;Exo-CP作用于RAW264.7,显著提高了细胞的破骨分化相关基因及蛋白的表达水平,TRAP染色可见分化的破骨细胞,且呈现浓度依赖性,100、1 000 μg·mL^-1浓度Exo-CP对破骨细胞分化的促进作用显著高于10 μg·mL^-1浓度组（P<0.05）。结论　慢性牙周炎的病理性骨吸收可能由炎性PDLSCs所分泌的Exo通过促进破骨细胞分化引起,Exo中主要的作用蛋白可能为RANKL和TNF-α,本研究为慢性牙周炎骨吸收的发病机制提供了新视角。     

唑来膦酸对破骨细胞黏附及整合素αv、β3基因表达的影响

目的 研究唑来膦酸（ZOL）对破骨细胞黏附以及整合素α_v和β₃基因表达的影响。方法 体外诱导小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本质吸收陷窝检测以评价破骨细胞生成情况。将细胞分为对照组及ZOL处理组两组,后者用1×10^-6 mol·L^-1的ZOL处理2 d,用结晶紫染色法检测细胞黏附情况,用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot和免疫荧光化学法检测整合素α^v、β³ mRNA及蛋白表达水平。结果 TRAP染色及牙本质吸收陷窝检测提示有多核破骨细胞生成。ZOL处理组破骨细胞黏附能力较对照组显著降低（P<0.01）。ZOL处理组整合素α_v、β₃mRNA水平分别为0.66±0.05、0.59±0.08,显著低于对照组的1.01±0.01和1.01±0.02（P<0.01）;蛋白表达水平分别为31 934.84±112.91、18 812.79±194.13, 较对照组（52 517.81±211.72、31 441.93±456.87）分别下降了39.19%和40.17%（P<0.01）。免疫荧光化学检测显示,ZOL处理使整合素α_v、β₃荧光强度（9.491±0.748、4.744±0.759）较对照组（15.159±1.143、11.418±1.095）分别降低了37.39% 和58.45%（P<0.01）。结论 ZOL可抑制破骨细胞黏附并下调整合素α_v、β₃表达;ZOL的上述作用可能参与对破骨细胞性骨吸收的抑制。     

促红细胞生成素对破骨细胞调控机理的研究

目的研究小鼠单核巨噬细胞在体外向破骨细胞分化的过程中,促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）与破骨细胞表面受体Epor结合发挥作用的机理。方法 EPO作用于Epor受体沉默的经诱导的小鼠单核巨噬细胞,观察TRAP阳性多核细胞数目变化。Real-time PCR检测RAW264.7向破骨细胞分化过程中相关基因Epor、Nfatc1、Mmp9、EphrinB2基因的表达。结果与对照组比较,4天后,Epor沉默组的Nfatc1、EphrinB2 mRNA的表达明显升高（P〈0.01）,Ctsk Mmp9 mRNA的表达明显降低（P〈0.01）。结论 EPO通过与破骨细胞表面受体Epor结合,引发破骨细胞内相关基因表达改变,进而影响破骨细胞的分化和活化。     

唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及 成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。     

唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。     

川续断皂苷Ⅵ对人颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 探讨川续断皂苷Ⅵ(asperosaponinⅥ,ASAⅥ)对人颌骨骨髓间充质干细胞(human jaw bone marrow mesenchymal stem cells,hjBMSCs)成骨分化的影响。方法 流式鉴定提取的hjBMSCs表面的特异性抗原;CCK8检测1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8 mol/L的ASAⅥ药物溶液对hjBMSCs增殖的影响;用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色、茜素红染色(alizarin red stain,ARS)及免疫印迹分析(western-blot,WB)验证ASAⅥ促进hjBMSCs成骨分化作用的同时,确定ASAⅥ促进hjBMSCs成骨分化合适浓度。用实时定量荧光PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR)进一步探索,在mRNA水平,ASAⅥ对hjBMSCs成骨分化的影响。结果 实验结果表明,1×10^-4 mol/L的ASAⅥ对hjBMSCs有明显的毒性作用(P<0.01),1×10^-8～1×10^-5 mol／L对细胞增殖无明显毒性作用。与对照组相比,1×10^-5 mol／L、1×10^-6 mol／L ASAⅥ组的碱性磷酸酯酶、钙结节沉淀、成骨分化特异性蛋白表达量均明显升高。与对照组相比,1×10^-5 mol／L、1×10^-6 mol／L组的Runx2、OCN和COL-Ⅰ在mRNA水平的表达均明显上升(P<0.01),且前者略显优势。结论 1×10^-5、1×10^-6 mol／L的ASAⅥ均能较好促进hjBMSCs成骨分化,且1×10^-5 mol／L略显优势。     

当归多糖对高糖状态下大鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响

目的 探讨当归多糖（ASP）对高糖状态下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨向分化的影响。方法 培养并收集第3代BMSCs进行成骨成脂分化诱导鉴定。将BMSCs分为3组进行培养：正常对照组（葡萄糖浓度5.5 mmol·L ^-1）、高糖组（葡萄糖浓度25.5 mmol·L ^-1）、ASP+高糖组（葡萄糖浓度25.5 mmol·L ^-1+40 mg·L ^-1 ASP）。CCK8检测各组BMSCs的增殖活性,茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测成骨活性。实时荧光定量聚合酶链反应检测成骨标记基因Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）mRNA及Wnt/β-catenin信号通路关键因子CyclinD1及β-catenin的mRNA表达。建立2型糖尿病大鼠模型,将大鼠分为3组：正常对照组（正常大鼠）、糖尿病组（糖尿病大鼠）、糖尿病+ASP组（糖尿病大鼠,ASP喂养）,制备大鼠胫骨骨缺损,进行组织学检测,观察骨缺损修复情况。结果 高糖组、ASP+高糖组的BMSCs增殖高于正常对照组（P<0.05）,高糖组和ASP+高糖组二者之间无统计学差异（P>0.05）。高糖组中BMSCs钙结节数量、碱性磷酸酶活性及Runx-2、OCN、Osx、COL-Ⅰ、CyclinD1、β-catenin的mRNA表达均低于正常对照组和ASP+高糖组（P<0.05）,正常对照组和ASP+高糖组之间无统计学差异（P<0.05）。组织学检测结果显示,糖尿病组骨小梁数量少于正常对照组和糖尿病+ASP组（P<0.05）,而正常对照组和糖尿病+ASP组二者之间无统计学差异（P>0.05）。结论 ASP可促进高糖状态下大鼠BMSCs的成骨分化及2型糖尿病大鼠的骨缺损修复,这种促进作用可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。