基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的 人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

基质细胞衍生因子-1对炎症和正常来源的人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 通过体外培养炎症来源的人牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）,比较基质细胞衍生因子-1（SDF-1）对于两种来源细胞的成骨分化作用。方法 采用组织块酶消化法原代培养iPDLSCs 和hPDLSCs,经有限稀释法纯化,通过流式细胞仪对干细胞表面标记物检测鉴定后,对其进行成骨诱导;MTT法检测并比较SDF-1对两种来源的细胞增殖能力的影响;茜素红染色检测SDF-1作用于两种来源的细胞后钙化骨量的表达;碱性磷酸酶法比较SDF-1作用于两者的成骨分化能力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测SDF-1作用于两种牙周膜干细胞前后成骨相关基因表达水平的变化。结果 两种来源的牙周膜细胞经纯化后均阳性表达干细胞标记物。hPDLSCs较iPDLSCs增殖能力高;两种细胞经SDF-1成骨诱导培养后,成骨相关基因的表达水平均较诱导前明显上调（P<0.05）,SDF-1在50、200 ng·mL ^-1时分别对iPDLSCs和hPDLSCs细胞成骨分化作用最明显（P<0.05）。结论 正常来源和炎症来源的人牙周膜干细胞均具有成骨分化能力,SDF-1可增强两种来源的牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

尼古丁通过调控Toll样受体4抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力

目的 探讨尼古丁对牙周膜干细胞（PDLSCs）增殖和成骨分化能力的调控作用,检测尼古丁能否通过调控Toll样受体4（TLR4）抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。方法 培养PDLSCs,采用流式细胞仪检测PDLSCs表面抗原标志,WST-1试剂盒检测不同浓度尼古丁刺激后PDLSCs增殖能力的改变。采用茜素红染色观察PDLSCs经不同浓度尼古丁刺激和成骨诱导后的矿化结节生产情况。运用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测经尼古丁刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因和蛋白的改变,以及尼古丁联合TLR4抑制剂TAK-242刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因及蛋白的改变。结果 培养的细胞表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD105,证实为PDLSCs。与对照组相比,培养3 d后,尼古丁浓度为10^-4 mol·L^-1的PDLSCs的增殖能力受到明显抑制（P<0.05）;成骨诱导21 d后,10^-4 mol·L^-1尼古丁刺激组茜素红染色矿化结节明显减少。RT-PCR反应及Western blot显示：与对照组相比,尼古丁刺激组PDLSCs的碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因及蛋白表达量均降低（P<0.05）,加入TLR4抑制剂TAK-242后,尼古丁的抑制效应减弱。结论 尼古丁可能通过TLR4信号通路抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。     

细胞外信号调节蛋白激酶1/2在介导周期性牵张力对牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的 研究周期性牵张力刺激下细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2对牙周膜细胞成骨分化的分子调控机制。方法 组织块法培养人牙周膜细胞。采用多通道应力加载系统对细胞施加频率0.5 Hz、振幅10%的周期性牵张力（加力时间1、3、6、12、24 h）,以不加力的细胞作为对照,并分别在加力前应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126以及对细胞转染ERK1/2显性负相变异体（DN-ERK1/2）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）及蛋白质印迹法研究人牙周膜细胞的基因蛋白水平变化。结果 加力后人牙周膜细胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨钙蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均显著升高,Runt相关基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均显著升高。加入抑制剂U0126或细胞转染DN-ERK1/2后,Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。结论 ERK1/2是周期性牵张力刺激下牙周膜细胞成骨分化的重要分子途径,力学刺激下激活的ERK1/2可能通过提高Runx2蛋白的表达水平而参与成骨基因OCN和BSP的转录表达。     

化脓链球菌脂磷壁酸对人牙周膜干细胞分化能力的影响

目的 研究脂磷壁酸(LTA)对牙周膜干细胞(PDLSCs) 分化能力的影响,从而探讨G+细菌毒素LTA对人牙周膜干细胞再生牙周组织的影响.方法 用0.1、1和10μg/ml的LTA作用于PDLSCs,采用MTT方法及流式细胞术检测细胞的增殖及凋亡情况,使用碱性磷酸酶染色和茜素红染色对细胞的成骨分化能力进行比较;应用油红O染色鉴定成脂分化能力,实时定量PCR检测成骨成脂相关基因的变化,研究LTA在PDLSCs分化中的作用.结果 1μg/ml及10μg/ml LTA显著降低PDLSCs增殖率,细胞凋亡增加.ALP染色及活性结果表明,早期成骨能力各组之间没有显著差异;茜素红染色结果及钙离子浓度定量测定显示,随LTA浓度升高,PDLSCs晚期成骨能力降低,并具有LTA浓度依赖性.成骨相关基因Runx2表达表现相同变化趋势.油红O染色结果表明,随着LTA浓度的增加,PDLSCs的成脂分化能力升高,成脂相关基因PPARγ表达升高,具有LTA浓度依赖性.结论 LTA降低PDLSCs成骨分化能力,同时促进细胞成脂分化能力,表明LTA抑制PDLSCs介导的牙周组织再生.     

低氧对人牙囊细胞生物学特性的影响

目的 研究低氧对人牙囊细胞（hDFCs）生物学特性的影响。方法 利用组织块酶消化法从年轻恒牙中分离培养hDFCs;采用免疫荧光技术检测细胞表面标志物,多向诱导实验检测细胞多向分化潜能;模拟体外低氧微环境,将细胞分为常氧组（20%O₂）和低氧组（2%O₂）,分别对两组细胞行Transwell小室试验检测低氧对细胞迁移的影响,采用CCK-8法检测低氧对细胞增殖的影响。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot分别从基因和蛋白水平检测hDFCs多能性相关标志物于不同氧体积分数下的表达;分别对两组细胞进行成骨诱导,qRT-PCR检测成骨相关基因,茜素红染色评估矿化结节的形成。结果 hDFCs具有较强的干细胞特征,具有成骨、成脂及成神经多向分化能力,符合间充质干细胞基本标准,能够满足牙组织工程构建对种子细胞的需求。低氧有利于hDFCs多能性的保持,同时促进了hDFCs的迁移和增殖。hDFCs于低氧中进行诱导时,其成骨分化能力得到增强。结论 低氧微环境对维持hDFCs多能性,促进hDFCs增殖、迁移和分化有重要作用。     

肿瘤坏死因子-α对牙周膜干细胞骨向分化及Notch信号通路的影响

目的 研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对牙周膜干细胞（PDLSCs）骨向分化及Notch信号通路的影响,初步探讨在TNF-α影响下Notch信号通路对PDLSCs成骨分化的调控作用。方法 采用酶消化结合组织块法获得PDLSCs,通过流式细胞仪检测间充质干细胞（MSCs）表面标记物CD105、CD90、CD146、CD45、CD31的表达,将PDLSCs分为实验组（10 ng·mL^-1 TNF-α）和对照组（不含TNF-α）,使用CCK-8法检测PDLSCs增殖能力;通过碱性磷酸酶（ALP）活性、茜素红染色、实时定量聚合酶链反应（PCR）检测TNF-α对PDLSCs成骨能力的影响;实时定量PCR 检测Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3,配体JAG1、JGA2、DLL1,细胞内效应分子Hes-1的表达。结果 流式细胞仪检测结果显示CD105、CD90及CD146表达阳性,CD45、CD31表达阴性;CCK-8法结果显示TNF-α能够促进PDLSCs增殖能力（P<0.05）;ALP活性检测结果显示,实验组与对照组相比,ALP活性降低（P<0.05）;茜素红染色结果显示,与对照组相比,实验组矿化结节减少;实时定量PCR结果显示,与对照组相比,成骨标志基因牙骨质附着蛋白（CAP）、骨桥蛋白（OPN）、Runt相关转录因子2（Runx2）表达量明显降低（P<0.05）;Notch信号通路相关分子中Notch1、Notch2、JAG1、JGA2、Hes-1的表达水平显著降低（P<0.05）,而Notch3、DLL1的表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 TNF-α能够促进PDLSCs增殖而抑制其骨向分化,同时抑制Notch信号通路的表达,说明Notch信号通路对PDLSCs骨向分化具有一定的调控作用。     

唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及 成骨分化的作用研究

目的 研究唑来膦酸对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的作用。方法 取大鼠BMSCs体外原代培养,使用含不同浓度（1、5、10、20 μmol·L ^-1）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞作为实验组,不含唑来膦酸的培养基干预细胞作为对照组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;茜素红和碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、Ⅰ型胶原酶（COL-Ⅰ）、Runt相关转录因子2（Runx-2）、锌指结构转录因子（Osx）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达量。结果 1 μmol·L ^-1唑来膦酸对BMSCs的增殖、成骨分化无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。浓度大于1 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化,且抑制作用呈浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。当唑来膦酸浓度为5 μmol·L ^-1时,ALP、BMP-2、COL-Ⅰ等成骨相关基因的表达量高于对照组（P<0.05）,而当唑来膦酸浓度大于5 μmol·L ^-1时,成骨相关基因的表达量低于对照组（P<0.05）。结论 低浓度唑来膦酸对BMSCs增殖和成骨分化无影响,5 μmol·L ^-1唑来膦酸抑制BMSCs增殖但促进其成骨分化,高浓度唑来膦酸抑制BMSCs的增殖和成骨分化。     

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的 观察布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法 破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L ^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA（siRNA）24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果 RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,其增殖及分化能力也明显受到抑制（P<0.05）。结论 抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。     

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的 观察布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法 破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L ^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA（siRNA）24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果 RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）,其增殖及分化能力也明显受到抑制（P<0.05）。结论 抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。     

人牙周膜干细胞成骨相诱导后相关基因的表达变化

目的:对人牙周膜干细胞进行筛选纯化,骨向诱导后观察其成骨能力,并对成骨相分化过程中相关基因的表达变化进行检测。方法:用组织块联合磁珠分选法分离纯化人牙周膜干细胞,初步探讨其成骨性能,碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色观察其成骨情况,实时定量PCR检测其相关成骨基因的表达变化。利用SPSS12.0软件包对数据进行统计学分析。结果:组织块联合磁珠分选法能成功培养出高纯度的人牙周膜干细胞。体外培养中,PDLSCs具备成脂和成骨的双相分化能力。在成骨诱导过程中,FOXO1和RUNX2的表达先升高再降低,ALP和OCN的基因表达水平持续增高。结论:成骨相关基因 ALP、RUNX2、FOXO1和OCN均参与其向成骨样组织分化的过程,其表达变化具有时间规律性,与成骨过程类似。     

炎症微环境下芦丁对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究芦丁（rutin）对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 采用有限稀释法分离纯化获得牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定牙周膜干细胞。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激牙周膜干细胞,建立体外炎症模型。实验分为4组,第1组使用α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第2组使用含有脂多糖的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第3组在含有脂多糖的α-MEM培养基加入芦丁培养牙周膜干细胞,第4组使用含有芦丁的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞。通过碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测试、茜素红染色、RT-PCR以及蛋白免疫印迹等方法检测成骨分化能力的改变。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析。结果 CCK-8和碱性磷酸酶活性测试结果显示,10 μmol/L芦丁对炎症状态下牙周干细胞增殖和成骨分化作用最明显。碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,10 μmol/L芦丁可以改善炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。RT-PCR、蛋白免疫印迹结果显示,芦丁可以增强炎症状态下COL1、ALP、RUNX2等成骨基因和成骨蛋白的表达。结论 芦丁可以增强炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。     

低强度高频振动对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究低强度高频振动（low-magnitude high frequency vibration,LMHFV）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）增殖、迁移、成骨分化能力的影响。方法 体外分离培养hPDLSCs;流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物;加载LMHFV（加速度=0.3 g,频率=40 Hz,时间=15 min/24 h）刺激后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力;通过qRT-PCR、Western免疫印迹检测成骨相关基因、蛋白表达水平,通过茜素红染色检测细胞成骨分化能力。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果 加载振动刺激后,hPDLSCs的增殖能力增强,迁移能力上升;RUNX2、ALP、Col-1、OCN的mRNA表达量和蛋白表达量均上升,茜素红染色结果与qRT-PCR、Western免疫印迹结果一致。结论 LMHFV可提高hPDLSCs的增殖、迁移能力和成骨分化能力。     

颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的生物学特性比较

目的:比较颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的基本生物学特性。方法:分离颌骨来源骨髓基质细胞和牙周膜细胞,进行改良体外原代培养。倒置显微镜观察细胞生长及克隆形成情况;CCK-8检测细胞生长曲线;免疫荧光染色检测STR0-1表达;成脂诱导后检测脂滴形成,矿化诱导后检测碱性磷酸酶的变化并用RT-PCR检测7、14 d成骨相关基因OCN的表达水平。结果:两种细胞体外培养均呈成纤维样细胞外形,能克隆生长,均具有活跃的增殖能力;两种细胞STR0-1表达阳性;成脂诱导后可见脂滴形成;矿化诱导后骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性较强,而且OCN基因表达较早且较强。结论:颌骨来源骨髓基质细胞具有较强的增殖及成骨分化能力,具有干细胞特性,可能是有较大临床应用潜力的组织工程种子细胞。     

慢病毒介导过表达端粒酶逆转录酶的 人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

目的 通过慢病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的口腔黏膜上皮细胞（OMECs）,探索构建高效、稳定的永生化OMECs细胞系的方法。方法 提取293T细胞总RNA,应用聚合酶链反应（PCR）法扩 增hTERT基因全长,构建重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT。包装慢病毒颗粒后感染人正常OMECs,经嘌呤霉素抗 性筛选获得阳性克隆,采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测hTERT基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建了pLVX-puro-hTERT过表达慢病毒载体并感染到OMECs中;感染细胞与正常OMECs形态相似,呈铺路石 样生长;实时荧光定量PCR和Western blot结果均显示,hTERT在感染细胞中高表达,与正常细胞相比差异有统计学 意义（P<0.05）。结论 通过慢病毒法成功建立了过表达hTERT的OMECs稳定细胞系,为构建高效、稳定增殖的人 永生化OMECs细胞系奠定了实验基础。     

细胞外信号调节激酶1/2信号转导通路调控牙周膜细胞成骨分化的研究

目的：探索细胞外信号调节激酶（ERK）1/2信号转导通路是否参与调控牙周膜细胞的成骨分化。方法???取体外培养的第3代牙周膜细胞进行研究。实验分为空白对照组、成骨诱导组和实验组（在成骨诱导培养基中加入10?nmol·L－1?ERK1/2磷酸化的抑制剂PD98059）。培养1周和3周后通过定量聚合酶链反应（qPCR）、碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测其成骨能力。结果?成骨诱导可促进牙周膜细胞中ERK1/2的磷酸化。培养1周后,抑制ERK1/2的磷酸化可上调成骨标志物Runx2、ALP和骨钙蛋白（OCN）的表达,与成骨诱导组相比较,OCN的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,Runx2、ALP的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。培养3周后,实验组牙周膜细胞成骨标志物Runx2、ALP和OCN的表达仍较成骨诱导组高,ALP染色和钙结节形成较成骨诱导组强,其中Runx2、ALP的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,OCN的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。结论 ERK?1/2信号转导通路参与了调控体外培养的牙周膜细胞的成骨分化。