金铁锁种质资源的遗传多样性分析

目的研究中国西南特有濒危药用植物金铁锁的遗传多样性。方法应用AFLP分子标记技术对具有代表性的7个金铁锁居群,共137个个体进行分析。结果在金铁锁的物种水平上,Nei’s基因多样性指数(He)、Shan-non’s信息指数(I)、多态位点百分率(PPB)分别为0.2434±0.1791、0.3735±0.2485、82.30%;在其居群水平上分别为0.0918±0.1610、0.1402±0.2362、30.48%。居群间Nei遗传分化指数(Gst):0.6244;Shannon’s多样性基因遗传分化系数(Ist):0.6246。聚类表明:地理距离相对远的丽江居群与个旧居群遗传距离最近;昆明居群与其他居群遗传距离较远。统计获得9条可区分各地方居群的特征指纹带。结论金铁锁种内的遗传多样性水平丰富,而居群内遗传多样性水平较低,居群间遗传分化显著;各居群间亲缘关系与地理距离无明显相关性;其种内特征带与各居群特征带结合,可以为AFLP分子标记技术用于其种质资源的鉴定、遗传育种提供重要的依据。     

基于分子谱系地理学的药用植物核心种质构建

作者介绍了药用植物核心种质构建的现状和特点,阐明了基于分子谱系地理学的药用植物核心种质构建的意义和研究方法,探索了野生资源丰富和野生资源已丧失的药用植物应用分子谱系地理学进行核心种质构建的方法和可行性,进而展望基于分子谱系地理学的药用植物核心种质构建的应用前景。     

甘草β-AS基因时空表达模式研究

目的:揭示甘草β-AS基因表达的时间特异性及空间特异性。方法:通过PCR扩增获得不同时间、不同部位甘草β-AS基因的cDNA序列,琼脂糖凝胶电泳后用Gel-Pro分析软件对电泳条带进行光密度分析,计算其相对表达量。结果:空间特异性实验显示β-AS基因在甘草的地上部分没有表达,地下组织中,新陈代谢最旺盛的根尖部分表达量高于根茎。时间特异性实验显示甘草β-AS基因在全年中的表达水平可分为4个阶段。12月至2月,β-AS基因表达低于检测水平;3月至5月,β-AS基因开始表达,表达量逐渐上升;5、6及8、9月,β-AS基因表达量保持较高水平;10、11月表达量开始下降。结论:在研究甘草β-AS基因时,应该选取转录水平较高的5、6及8、9月份;选取转录水平较高的根尖作为提取总RNA的部位。     

金铁锁根的化学成分研究

目的：研究金铁锁根的化学成分。方法：采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱分离纯化,利用ESI-MS,EI-MS,NMR技术确定化合物的结构。结果：分离并鉴定了7个化合物,分别为goyaprosaponin(1),大豆脑苷Ⅰ(soya-cerebrosideⅠ,2),鸢尾苷(tectoridin,3),α-菠甾醇(α-spinasterol,4),正二十五烷酸(5),β-谷甾醇(6),胡萝卜苷(7)。结论：化合物2～7均为首次从该属植物中分离得到。     

金铁锁有效部位的化学成分

目的:研究金铁锁有效部位的化学成分.方法:采用柱色谱法从金铁锁的正丁醇部位分离得到7个化合物,通过波谱技术鉴定了5个化合物.结果:5个化合物分别是16-异皂树酸(16-isoquillaic acid,1)、丝石竹苷元(gypsogenin,2)、α-菠甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(α-spinasterol-3-O-β-D-glucoside,3)、α-菠甾醇(α-spinasterol,4)、胡萝卜苷(daucosterol,5).结论:化合物1～3为首次从金铁锁中分离得到的天然化合物.     

金铁锁提取工艺的研究

目的:优选金铁锁的提取工艺。方法:采用正交试验法,以金铁锁提取物提取率为主要考察指标,结合生产成本,对影响金铁锁提取工艺的因素进行了研究。结果:试验设计三因素中提取方式有显著影响。结论:金铁锁的最佳提取工艺为:金铁锁根粉用80%乙醇浸渍3次,48 h/次,过滤,滤液减压浓缩成浸膏,加水溶解,水溶液经DM-101型大孔吸附树脂柱层析,分别用10%、20%及80%的乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,减压浓缩经喷雾干燥得金铁锁提取物。     

金铁锁的化学成分与生物活性的研究进展

目的:研究金铁锁的化学成分和生物活性。方法:检索国内外相关文献进行分析、归纳。结果:发现金铁锁的化学成分研究主要集中在三萜及其皂苷类、环肽类、咔伯啉生物碱类、木脂素类、麦芽酚类化合物;金铁锁生物活性研究多集中在镇痛活性、抗类风湿性关节炎活性及免疫调节活性方面。结论:通过对金铁锁的化学成分与生物活性的研究,可为进一步研究金铁锁提供信息资源。     

金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达北大核心CSCD

目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法:在转录组数据分析的基础上,利用RTPCR方法获得金铁锁SE基因的两个克隆的全长c DNA序列及进行生物信息学分析;并进行Real-time PCR实验,测定SE在不同组织中的表达量。结果:得到2条SE c DNA,SE-1全长1 642 bp,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸;SE-2全长1 552 bp,开放阅读框1 446 bp,编码481个氨基酸;构建了p EASY-E1-SE-1及p EASY-E1-SE-2重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致。Real-time PCR结果表明SE-1、SE-2基因在根中的表达量均高于茎和叶。结论:从金铁锁中成功克隆了SE基因,可为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础。     

濒危药用植物金铁锁的传粉生物学研究

目的:揭示金铁锁开花规律与传粉特征,确定其繁育系统类型,为金铁锁引种繁育和濒危原因探寻提供基础依据。方法:开花动态的观察、杂交指数估算法、繁育系统检测法、种子萌发率和访花昆虫及其访花行为的观察。结果:杂交指数检测与繁育系统检测结果一致,金铁锁的繁育系统为同株自花传粉、同株异花传粉、异株异花传粉。金铁锁的花在结构上具有与异花授粉相适应的结构和机制,也有虫媒花的特征。金铁锁的盛花期在雨季,其访花昆虫在雨季少见或不传粉,从而直接影响了结实率。结论:金铁锁为混合交配繁育系统,为虫媒异交植物,同时可以自花授粉,其繁殖方式为近交繁殖。     

西南民族药金铁锁的研究现状及展望

对西南特有植物金铁锁的生药学、化学成分、药理学和临床研究以及通过人工栽培、组织培养和遗传学等研究取得的生物保护和资源利用方面的进展进行了综述,分析了目前研究存在的不足和面临的问题,提出了有待继续深入和加强研究的方向及建议。     

金铁锁PtCYP450基因的克隆及原核表达

目的:从金铁锁Psammosilenetunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆细胞色素PtCYP450酶基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据已获得的金铁锁转录组数据,设计PtCYP450基因全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得金铁锁PtCYP450基因的全长cDNA序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建金铁锁PtCYP450-03基因的原核表达载体pEASY-E1-CYP450,转入BL21(DE3)Chemically Competent Cell中,在Art Media~(TM)Protein Expression培养基中进行蛋白表达。结果:获得全长1612 bp的金铁锁CYP450 c DNA,其开放阅读框(ORF)为1560 bp,编码519个氨基酸;序列分析及系统发育分析表明,PtCYP450基因属于CYP710家族成员。构建了p EASY-E1-CYP450重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致。结论:成功克隆了金铁锁PtCYP450基因,构建了稳定的pEASY-E1-CYP450原核表达体系,为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关键酶表达模式奠定基础。     

野生和栽培金铁锁的鉴定研究

目的：对金铁锁Psammosilene tunicoides W．C．Wu et C．Y．Wu根的野生和栽培品种进行比较研究，评价其药材质量，为建立贵州省栽培金铁锁的GAP药材标准、完善金铁锁的药材质量标准提供依据。方法：通过观察金铁锁药材的性状，制作金铁锁根显微切片，比较野生品种和栽培品种的药材性状与根的显微结构特征有无差异。结果：金铁锁野生和栽培品种的外观颜色、药材大小、导管的大小与排列稍有差别。结论：野生品种药材质量较好，栽培品种的栽培年限应延长。     

金铁锁活性成分基因调控网络及其产物评价研究进展

对西南特有植物金铁锁的活性成分基因调控网络及其产物评价的研究进展进行了综述,为金铁锁植物代谢途径生物工程的应用,研究和开发提供一定的理论依据。     

金铁锁中1个新β-咔啉生物碱

目的:研究金铁锁的化学成分.方法:采用多种色谱方法分离纯化,运用多种波谱分析手段进行化合物结构鉴定.结果:从金铁锁正丁醇部位分离得到2个β-咔啉类生物碱,经结构鉴定分别为1-乙酰基-3-甲酯基-β-咔啉(1),1-乙酰基-3-甲酯基-4-羟基-β-咔啉(2).结论:化合物1为首次从该植物中分离得到天然产物,化合物2为新化合物.     

金铁锁毛状根诱导的初步研究

目的:建立金铁锁毛状根诱导体系。方法:用发根农杆菌A4和C58C1菌株分别诱导金铁锁外植体获得毛状根,并对毛状根诱导过程中的多个因素进行优化。结果:金铁锁毛状根诱导的最佳条件为选择幼嫩茎段和幼嫩叶片作为外植体,在培养基1/2MS+AS 100μmoL/L上预培养2 d,用OD600=0.6的农杆菌浓度侵染15 min,在培养基1/2MS+AS 100μmoL/L上共培养3 d,转接至抑菌培养基1/2MS+Cef 300 mg/L进行毛状根的诱导。结论:已建立起金铁锁毛状根诱导体系,为后续金铁锁有效成分的提高及金铁锁基因工程的研究积累材料。     

金铁锁β-香树素合酶cDNA的克隆、原核表达和功能鉴定

目的 克隆金铁锁Psammosilene tunicoides三萜皂苷生物合成途径中的关建酶基因——β-香树素合酶全长cDNA,并对其进行表达和分析,为研究其在三萜皂苷合成途径的关键作用及次生代谢产物工程技术在金铁锁上的应用奠定基础。方法 应用RT-PCR和RACE等方法,克隆金铁锁β-香树素合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,以2,3-氧化鲨烯为底物进行体外酶促,采用HPLC法鉴定产物。结果 克隆得到金铁锁β-香树素合成酶基因,全长2 882 bp,ORF长2 284 bp,编码760个氨基酸。表达产物具有催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树素合酶的活性。结论 克隆所得的全长cDNA通过大肠杆菌表达β-香树素合酶,并能催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树素,为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要的基础。     

金铁锁总皂苷抗类风湿性关节炎作用及其作用机制研究

目的:考察金铁锁总皂苷(TSPT)抗类风湿性关节炎(RA)的药理作用及作用机制。方法:建立佐剂性关节炎(AA)动物模型,观察TSPT对AA大鼠足肿胀、关节炎指数及炎性组织液中促炎细胞因子IL-1β,TNF-α水平的影响。结果:TSPT能有效抑制关节肿胀率及关节指数,降低AA大鼠炎性组织液中促炎细胞因子L-1β,TNF-α的水平。结论:TSPT具有良好的抗RA作用,其作用机制与抑制促炎细胞因子L-1β,TNF-α的水平有关。     

基于入血成分的金铁锁药材质量标准研究

采用高效液相色谱法建立了金铁锁药材中尿囊素的含量测定方法。金铁锁药材经乙醇提取后,取续滤液进行分析。采用ZORBAX NH₂色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),检测波长220 nm,柱温40℃,流动相为乙腈-水(93:7),流速1.0 mL·min^-1。结果表明,尿囊素线性关系良好,具有较好的精密度和重复性。在0.010 4~0.166 g·L^-1,尿囊素的线性相关系数R²=0.999 4(n=5);RSD(n=6)小于2.1%;平均回收率为95.47%~ 100.9%。该方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性,可为金铁锁药材的质量控制提供参考。     

金铁锁毛状根诱导及培养体系的建立

目的:研究金铁锁毛状根制备方法及液体培养条件,为规模化生产金铁锁提供技术支持.方法:利用发根农杆菌ACCC10060菌株侵染金铁锁幼叶及茎段.结果:将外植体与菌液(A6000.8)在含有20mg·L-1乙酰丁香酮的B5培养基上共培养48h,可以有效地诱导金铁锁毛状根;叶片比茎段的诱导率高.转化的毛状根具有激素自养和抗卡那霉素的特性,并且组织中含有冠瘿碱,证明该菌对金铁锁组织成功地进行了转化.在无激素的1/2Ms液体培养基中培养35d后,金铁锁毛状根生物量增加了14.11倍(鲜重)和8.39倍(干重),其总皂苷为0.857%(干重),愈伤组织和原植物中分别为0.388%,0.217%.结论:金铁锁毛状根离体培养系统的成功建立,对进一步规模化培养金铁锁毛状根具有重要意义.