IL-1β对肠上皮细胞屏障通透性的影响

目的 炎症性肠病是儿童和青少年时期重要的慢性胃肠道疾病,肠黏膜屏障的损伤在其发病中起重要作用.本研究通过IL-β刺激Caco-2细胞单层,体外模拟炎症性肠上皮细胞屏障,为研究炎症性肠病的发病及治疗提供基础.方法 体外培养Caco-2细胞21d模拟肠上皮细胞单层屏障.炎症1组从培养第5天开始每隔1天应用IL-1β处理2h检测TEER值,至第21天.炎症2组于培养第18天换用含IL-1β培养液,分别于处理0、12、24、48、72 h检测TEER.正常对照组用普通培养液培养,也于相应时间点检测TEER.结果 正常对照组细胞TEER从第5天至第15天逐渐增加,在第15天达到600 Ω·cm2,并到达平台期保持至第21 d.炎症1组细胞TEER值均低于正常组细胞,并且直至第21天仍＜500 Ω·cm2.炎症2组细胞显示时间依赖性的TEER逐渐降低,在48 h达到最大值,然后在72 h轻度回升.结论 培养2～3周的Caco-2细胞能够形成具有极性的肠上皮细胞单层,对其给予IL-1β刺激可在体外模拟炎症性肠上皮细胞屏障.     

Toll样受体2对肠上皮细胞屏障通透性的保护作用及机制

目的 肠上皮细胞屏障的损伤与多种胃肠道疾病的发生密切相关,有效维持屏障功能是治疗这些疾病的关键.本研究试图通过体外实验探讨Toll样受体2(toll-like receptor,TLR2)对肠上皮细胞屏障通透性的保护作用及其机制.方法 正常组将未转染Caco-2细胞,TLR2基因沉默Caco-2细胞,TLR2基因过表达Caco-2细胞培养21d形成单层,检测跨膜电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)值,其反应上皮细胞屏障的通透性.炎症组3类细胞分别于培养第19d给予10 ng/ml IL-1β刺激48 h,于第21d检测TEER值.抑制剂组3类细胞分别在IL-1β前再给予PI3K/Akt通路抑制剂处理1h,于第21 d检测TEER值.结果 TLR2基因沉默能够显著减低Caco-2细胞单层的TEER值(P＜0.01),而TLR2基因过表达能够升高TEER值,但不具有统计学意义.TLR2能够防止IL-1β造成的TEER值下降(P＜0.01),此作用在给予PI3K/Akt通路抑制剂后消失.结论 TLR2对肠上皮细胞屏障通透性具有调节作用,并且能够防止炎症造成的通透性增高,这种保护作用由PI3K/Akt通路参与介导.     

丁酸钠对Caco-2细胞肠屏障的作用及NF-κB途径的影响

目的通过观察高浓度丁酸钠(sodium butyrate,NaB)(5 mmol/L,8 mmol/L)对单层Caco-2细胞肠屏障模型的作用,及该过程中对NF-κB通路的影响,旨在探讨高浓度NaB破坏单层Caco-2细胞肠屏障模型的可能分子机制。方法使用不同浓度的NaB及雷公藤甲素(triptolide,TP)(特异性抑制NF-κB)50 nmol/L作用体外培养的Caco-2细胞及单层Caco-2细胞肠屏障模型,按照作用的试剂和浓度分为0 mmol/L NaB(对照组)、50 nmol/L TP组(TP组)、2 mmol/L NaB组(NaB Ⅰ组)、5 mmol/L NaB(NaB Ⅱ组)、8 mmol/L NaB(NaB Ⅲ组)、5 mmol/L NaB+50 nmol/L TP组(NaB+TP组)。测定单层Caco-2细胞肠屏障模型的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TER)及菊粉-FITC(inulin-FITC)的通透性;用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase c...     

永生化小鼠Bend.3细胞株具有脑微血管内皮细胞的屏障特性

目的：评价永生化小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3是否具有脑微血管内皮细胞的屏障特性。方法：将小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3接种于细胞培养插内,跨内皮细胞电阻抗（transendothelial electrical resistance,TEER）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）通透性实验检测其屏障功能。Western blot法和直接荧光染色法观察其紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1的表达及细胞骨架蛋白F-actin的分布。结果：Bend.3细胞的TEER随培养时间延长逐渐升高,10 d达82.3±6.0 Ω?cm2,与培养3 d时的37.3±3.1 Ω?cm2 相比,差异有统计学意义（P<0.05）。其培养10 d和3 d的平均HRP通透率在120 min分别为（2.2±0.05）%和(4.3±0.20）%,差异有统计学意义（P<0.05）。培养10 d时该细胞表达高浓度的紧密连接蛋白Occludin、ZO-1,且F-actin主要分布在细胞周边,线条完整连续,未见明显缝隙形成。结论：小鼠脑微血管内皮细胞株Bend.3具有脑微血管内皮细胞的屏障特性,且其屏障功能在接种10 d后可达到最理想的状态。［中国当代儿科杂志,2010,12（6）：474-478］     

葡聚糖硫酸钠诱导炎症性肠病大鼠结肠黏膜紧密连接蛋白表达及其通透性的改变

目的：建立葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的大鼠炎症性肠病（IBD）模型,观察其肠上皮紧密连接蛋白表达以及结肠黏膜通透性的变化。方法：将雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为对照组和IBD模型组,每组27只,通过使用3% DSS持续经饮水途径饲养大鼠6 d后恢复正常饮水14 d建立IBD模型,对照组自由饮水。分别于DSS处理后第7天、第14天和第21天观察结肠黏膜病理变化,第21天取结肠组织标本检测髓过氧化物酶活性;采用Ussing chamber检测结肠上皮通透性;通过real-time PCR和Western blot从转录水平和翻译水平分析肠上皮紧密连接蛋白表达。结果：IBD模型组大鼠出现腹泻、便血、体重下降,炎症集中在远端结肠,表现为隐窝脓肿,炎症细胞浸润。与对照组比较,IBD模型组大鼠结肠髓过氧化物酶活性显著增加（P<0.01）,肠上皮跨膜电阻抗值和跨膜电势差显著降低（P<0.01）,短路电流值明显增加（P<0.01）;Real-time PCR和Western blot的结果均提示正常大鼠尚未检测出claudin2的表达,IBD模型组 claudin2 mRNA及蛋白表达阳性;IBD模型组 occludin、claudin3、ZO-1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于对照组（P<0.01）。结论：IBD大鼠结肠黏膜屏障功能受损,多种紧密蛋白表达改变,其中紧密连接蛋白表达变化可能在慢性修复期IBD屏障受损发病机制中起到重要作用。     

二十碳五烯酸对E.coli LF82感染后肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1 mRNA的影响

目的探讨二十碳五烯酸(EPA)对黏附侵袭性大肠杆菌(AIEC)LF82感染后肠上皮细胞(Caco-2)紧密连接蛋白(ZO-1)表达的影响。方法用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞紧密连接模型,分为EPA处理组,EPA 0、25、50、100、200μmol/L干预96 h;以及EPA(EPA 0、25、50、100、200μmol/L)+E.coli LF82联合处理组,在不同浓度EPA干预96 h的基础上,予E.coli LF82分别干预0 h、6 h、12 h。通过细胞形态学观察,MTT法测定细胞生长曲线,以及细胞膜两侧碱性磷酸酶(ALP)活性检测对Caco-2细胞模型进行评价。流式细胞术检测不同浓度EPA对Caco-2细胞凋亡的影响。RT-q PCR检测EPA和/或E.coli LF82作用于Caco-2细胞后ZO-1 m RNA的表达情况。酶联免疫吸附法检测Caco-2细胞上清中TNF-α的变化。结果 EPA25、50μmol/L处理后,Caco-2细胞存活率均高于0浓度组,且增高呈浓度依赖性(P0.05);EPA100、200μmol/L处理组的细胞存活率下降呈浓度依赖性,均低于0浓度组(P0.05)。EPA浓度为100、200μmol/L时,细胞凋亡率较0浓度组增加(P0.05)。单独E.coli LF82干预Caco-2细胞6 h、12 h后,ZO-1 m RNA表达随处理时间延长而减少,均低于未处理组(P0.05)。EPA 25、50μmol/L干预联合E.coli LF82处理6 h或12 h,Caco-2细胞的ZO-1 m RNA表达随EPA浓度增加而增加,均高于E.coli LF82单独处理组(P0.05)。单独E.coli LF82处理6 h、12 h组的TNF-α分泌随干预时间延长而增加,均高于未处理组(P0.05)。EPA25、50μmol/L联合LF82处理6 h或12 h,细胞上清液中TNF-α分泌量随EPA浓度的增加而减少,均少于单独LF82处理组(P0.05)。结论 EPA能有效预防E.coli LF82感染后肠上皮细胞紧密连接的破坏,抑制炎症因子的分泌,对肠黏膜屏障有一定的保护作用。     

紧密连接蛋白ZO-1、occludin和actin参与缺氧缺血诱导的血脑屏障通透性增加

目的：探讨血脑屏障紧密连接（blood-brain barrier-tight junction,BBB-TJ）蛋白ZO-1、occludin和actin在缺氧缺血诱导的血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）通透性增加中的变化及其机制。方法：利用人脐静脉内皮细胞系ECV304与星形胶质细胞（astrocytes, AS）共培养建立体外BBB模型,模型随机分为正常对照组和缺氧缺血两组。透射电镜观察两组间BBB-TJ的变化,直接免疫荧光观察细胞骨架蛋白actin分布的改变。γ计数仪检测大分子物质 125I-牛血清白蛋白（125I-BSA）通透曲线观察BBB通透性的改变, Western blot检测细胞骨架蛋白actin,胞浆附着蛋白ZO-1,跨膜蛋白occludin的表达量的改变。结果：透射电镜观察培养第10天的体外BBB模型,可见内皮细胞连接紧密,细胞间形成光滑、连续、较高密度的紧密连接。缺氧缺血后5 h,内皮细胞间连接开放,形成裂隙。直接免疫荧光下检测可见周边Actin丝带模糊,部分断裂,形成细胞间裂隙。缺氧缺血组 125I-BSA的通透量增加,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。同时ZO-1的表达量显著减少,而occludin和actin的表达量无明显改变。结论： 缺氧缺血诱导occludin的位置分布改变和ZO-1的表达量减少进而促使actin蛋白发生重排,是导致缺氧缺血后BBB通透性增加的可能机制之一。     

急性肝内胆汁淤积大鼠小肠上皮紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达的变化

目的 研究急性肝内胆汁淤积大鼠小肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达的变化及其发病机制.方法　雄性21日龄SD大鼠40只随机分为空白对照组(10只)和模型组(30只).模型组大鼠采用α-异硫氰酸萘酯50 mg·kg-1一次性灌胃,建立急性肝内胆汁淤积动物模型.空白对照组只灌服等量蓖麻油.于灌胃后24 h、48 h、72 h采用免疫组织化学和Western blot法检测其末端回肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的分布和表达,并利用检测分析系统对Western blot图像结果进行定量分析.结果　ZO-1蛋白和Occludin蛋白主要沿大鼠小肠黏膜上皮细胞膜的顶端呈线状分布.模型组大鼠24 h时ZO-1蛋白和Occludin蛋白的阳性染色较空白对照组减少,48 h减少最为明显,72 h阳性染色有所恢复.Western blot结果与免疫组织化学结果一致,模型组24 h已开始下降(ZO-1:0.129 4±0.048 1,Occludin:0.195 0±0.044 1),48 h最低(ZO-1:0.039 5±0.009 5,Occludin:0.013 7±0.009 2),72 h开始恢复(ZO-1:0.202 4±0.049 8,Occludin:0.149 4±0.035 5),模型组各时间点ZO-1与Dccludin与空白对照组(ZO-1:0.288 7±0.023 7,Occludin:0.426 6±0.067 0)比较差异均有统计学意义(Pa＜0.01).结论　急性肝内胆汁淤积大鼠小肠黏膜上皮存在紧密连接蛋白分布异常及数量改变,影响肠黏膜上皮屏障的完整性,破坏小肠黏膜屏障.     

血小板活化因子受体拮抗剂对内毒素血症幼年大鼠肠道黏液蛋白损伤的作用

目的 探讨血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂在内毒素血症幼年大鼠肠道黏液蛋白(MUC2)损伤中的作用.方法 18日龄Wistar大鼠,随机分为对照组和实验组,实验组又分为内毒素组(LPS组)、PAF受体拮抗剂预防组(简称预防组)和PAF受体拮抗剂治疗组(简称治疗组),每一时点(注射LPS后1.5、3、6、24、48、72 h)各8只,注射LPS后1.5、3、6、24、48、72 h取回肠.LPS组和对照组分别腹腔注射内毒素5 mg/kg及生理盐水lⅡd/J‘g;预防组于注射LPS前30 min、治疗组于注射LPS后30 min腹腔注射PAF受体拮抗剂BN52021 5 ng/kg.用透射电镜做形态学检查.应用免疫组化方法检测肠黏膜中MUC2变化.结果 电镜下对照组肠微绒毛及细胞间紧密连接未见异常.LPS 组上皮细胞连接增宽;微绒毛变细、稀疏,部分断裂、脱落;细胞器受损.预防组和治疗组改变较LPS组轻.对照组MUG2蛋白均匀地分布于回肠上皮细胞表面,MUC2蛋白染色阳性的杯状细胞轻度膨胀、扩张.实验组细胞表面MUC2阳性染色明显减少,分布不均.对照组MUC2表达平稳且水平较高,其他3组均下降,LPS组降低最为明显,低谷在注射后6 h(0.1841±0.0047),明显低于对照组(0.2091±0.0060)(P＜0.01),预防组及治疗组变化趋势同LPS组,各时点MUC2均较LPS组高,方差分析提示组内及组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PAF在内毒素血症肠道黏液屏障功能损伤中可能起一定作用,预防和治疗性应用PAF受体拮抗剂BN52021可减轻肠损伤.     

炎症反应与小儿胃肠功能障碍

胃肠功能障碍在危重病发展过程中有着重要作用。炎症反应与胃肠功能障碍密切相关。肠黏膜通透性增高,可造成肠源性内毒素血症和细菌移位。内毒素可直接或间接破坏肠黏膜的完整性,进一步导致肠屏障功能损伤。血小板活化因子可引起胃肠黏膜缺血、缺氧,损伤细胞旁路径通道,从而使屏障功能损伤。血小板活化因子受体拮抗剂可减轻血小板活化因子对肠道的损伤作用。核因子κB可促进细胞因子等基因转录,其活化可介导肠上皮细胞紧密连接及通透性增高,并可使结肠环状平滑肌细胞收缩性降低。Toll样受体4在肠道炎症时表达升高,其可活化内毒素介导的核因子κB途径。     

Unconjugated bilirubin modulates the intestinal epithelial barrier function in a human-derived in vitro model

Unconjugated bilirubin promotes intestinal secretion without affecting nutrient digestion or absorption. In the current study, the effects of unconjugated bilirubin (UCB) on the barrier function of the intestinal epithelium were investigated. The apical side of human intestinal cell line Caco-2 monolayers was challenged with purified UCB. Transepithelial electrical resistance and paracellular fluxes of 10 kD Cascade blue conjugate dextran were measured. Cell monolayer viability was studied using LDH release and trypan blue exclusion tests. Redistribution of enterocyte tight junction occludin was studied by confocal microscopy. Bilirubin induced a dose-dependent decrease of transepithelial electrical resistance (TEER). This effect was maximal at 6 h and tended to be reversed at 48 h. Oxidated bilirubin was ineffective. Bilirubin significantly increased fluorescent dextran paracellular passage. Cell viability was not affected by UCB over the 5-200 nmol/L concentration range. Finally, bilirubin triggered a reversible redistribution of tight junctional occludin. UCB increases the permeability of intestinal epithelium. This effect is reversible, dependent on the redox status of the molecule and the rearrangement of the tight junction. These data attribute to bilirubin a novel role of functional modulator of intestinal paracellular permeability in vitro.     

miR-200b调控肌球蛋白轻链激酶/磷酸化肌球蛋白轻链信号通路对肠上皮紧密连接的影响

目的探究mi R-200b对肠上皮紧密连接的影响及作用机制。方法利用阴性对照慢病毒及表达mi R-200b的慢病毒感染Caco-2细胞形成NC株和200b株,以10 ng/m L肿瘤坏死因子(TNF-α)处理建立体外肠上皮损伤模型,并分为NC组、NC+TNF-α组、200b组和200b+TNF-α组。测量4组细胞对肠上皮跨膜电阻抗(TEER)及对异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FITC-dextran)的通透性;Western blot检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)及磷酸化肌球蛋白轻链(P-MLC)表达。结果与NC组相比,NC+TNF-α组TEER值降低、对FITC-dextran通透量显著增高、MLCK和P-MLC表达上调,差异均有统计学意义(P?0.05)。与NC+TNF-α组相比,200b+TNF-α组TEER显著升高、FITC-dextran通透量显著降低、MLCK和P-MLC表达显著下调,差异均有统计学意义(P?0.05)。结论 mi R-200b可调控MLCK/P-MLC信号通路修复TNF-α导致的肠上皮紧密连接损伤。     

The effect of hypoxia on permeability and bacterial translocation in Caco-2 adult and I-407 fetal enterocyte cell culture models

Hypoxia has been implicated in the breakdown of the intestinal epithelial barrier in animals, leading to bacterial translocation (BT); however, the mechanism of this hypoxic insult is unknown. To determine the effects of hypoxic injury in vitro on epithelial membrane integrity, transepithelial electrical resistance (TEER), mannitol permeability (Ma-Pm), and BT were measured in both an adult (Caco-2) and fetal (I-407) intestinal epithelial cell culture model. Caco-2 adult and I-407 fetal epithelial cell monolayers were treated with or without bacteria (1 x 10(7) Escherichia coli. C-25), and then incubated under either normoxic (5% CO(2) in room air) or hypoxic (5% CO(2) and 95% N(2)) conditions at 37 degrees C for 6 h. Hypoxia caused a 10% increase in Ma-Pm in the I-407 fetal cell model independent of the bacterial challenge. In contrast, a bacterial challenge in the Caco-2 adult model caused a 485% increase in Ma-Pm independent of hypoxia. Neither hypoxia, nor C-25 bacteria, for 6 h caused BT in either cell culture model. In the adult cell culture model, bacteria appear to mediate changes in epithelial barrier function, with hypoxia having no effect. On the other hand, hypoxia is the major factor in the loss of epithelial barrier function in fetal epithelium, but has no effect on adult epithelium. The data suggest that the breakdown of barrier function caused by a hypoxic insult is the primary stimulus for subsequent BT in neonates.     

Effects of butyrate on intestinal barrier function in a Caco-2 cell monolayer model of intestinal barrier

Production of short-chain fatty acids (SCFA) in the intestinal lumen may play an important role in the maintenance of the intestinal barrier. However, overproduction/accumulation of SCFA in the bowel may be toxic to the intestinal mucosa and has been hypothesized to play a role in the pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis (NEC). By using a Caco-2 cell monolayer model of intestinal barrier, we report here that the effect of butyrate on the intestinal barrier is paradoxical. Butyrate at a low concentration (2 mM) promotes intestinal barrier function as measured by a significant increase in transepithelial electrical resistance (TER) and a significant decrease in inulin permeability. Butyrate at a high concentration (8 mM) reduces TER and increases inulin permeability significantly. Butyrate induces apoptosis and reduces the number of viable Caco-2 cells in a dose-dependent manner. Intestinal barrier function impairment induced by high concentrations of butyrate is most likely related to butyrate-induced cytotoxicity due to apoptosis. We conclude that the effect of butyrate on the intestinal barrier is paradoxical; i.e. whereas low concentrations of butyrate may be beneficial in promoting intestinal barrier function, excessive butyrate may induce severe intestinal epithelial cell apoptosis and disrupt intestinal barrier.     

紧密连接相关蛋白与肺疾病的研究进展

紧密连接是内皮细胞和上皮细胞之间的重要连接方式,能起到栅栏和屏障的作用。紧密连接相关蛋白是维持紧密连接结构和功能的重要组成蛋白,由膜蛋白和闭小环蛋白等外周胞浆蛋白组成,其中膜蛋白包括occludin、claudin和连接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAMs),闭小环蛋白由ZO-1、ZO-2和ZO-3组成。尽管各种蛋白功能有所差异,但它们之间相互连接,共同构成了细胞间的紧密连接复合体,维持着生物体内环境的稳态。近年来研究发现,多种肺部疾病,包括感染、肺水肿、纤维化和肿瘤都与紧密连接蛋白的异常表达和紧密连接复合体的结构破坏密切相关。因此,阐明紧密连接蛋白与肺疾病之间的关系,对揭示一些肺疾病的病理基础,以及疾病的诊断和治疗都有重要意义。[临床儿科杂志,2012,30(5):492-495]