慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在椎间盘髓核细胞中的表达

目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒,并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因导人慢病毒载体质粒pLenti6／V5 TOPO,应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒、包膜蛋白质粒等）共转染入293细胞进行包装,48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72h收集病毒上清并感染髓核细胞,在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为10^7U／mL。感染人椎间盘髓核细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体,且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。     

大鼠pEGFP-N1-PLZF真核表达载体的构建和意义

目的构建真核表达载体pEGFP-N1-PLZF，为基因水平研究早幼粒细胞白血病锌指蛋白（PLZF）在精原千细胞增殖和分化中的调控机制提供理论参考。方法参考分子克隆技术，采用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中扩增PLZF，将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上，以构建重组质粒pEGFP-N1-PLZF。结果实验从大鼠睾丸组织中提取总RNA，以RT-PCR方法获取编码PLZF基因的全序列cDNA。构建PLZF的CDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在PLZF基因，并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实结果。结论构建重组质粒pEGFP-N1-PLZF成功，实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在PLZF基因的3’端。提高PLZF在真核细胞中的表达，而且不影响其目的蛋白的结构和功能，对研究PLZF调控精原干细胞增殖和分化机制具有重要的意义。     

TSEG-2基因真核表达载体的构建及其在细胞内的表达

目的 构建睾丸特异表达基因2(TSEG-2)的真核表达载体,探讨TSEG-2在细胞中的表达及其生物学功能.方法 以小鼠睾丸组织cDNA为模版,设计携带HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点的引物序列,聚合酶链反应(PCR)扩增基因片段,克隆至携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pEGFP-N1;在阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)的介导下,重组质粒转染体外培养的精母细胞株GC-2spd 48 h后,荧光显微镜下观察TSEG-2基因在细胞内的表达定位,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长活性,AO/EB荧光染色法、Hoechst 33258荧光染色法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,实时定量PCR测定Fas、bcl-2、bax表达水平.结果 成功构建了TSEG-2与EGFP的融合表达载体pEGFP-TSEG2,转染GC-2spd细胞后可见胞质内绿色荧光蛋白表达.转染pEGFP-TSEG2 48 h后,GC-2spd细胞生长抑制39.2%(P＜0.05),出现细胞凋亡形态学改变,凋亡率为28.3%(P＜0.05);GC-2spd细胞中Fas和bcl-2的表达分别下调17.9%、64.8%(P＜0.05),而bax的表达上调25.1%(P＜0.05).结论 成功构建TSEG-2基因的真核表达载体,能在精母细胞株中表达并促进细胞凋亡.     

绿色荧光蛋白和大鼠睾丸AQP7融合蛋白表达载体构建及其表达

目的 :构建真核表达的pEGFP C1与大鼠睾丸AQP7的融合蛋白表达载体。　方法 :RT PCR的方法扩增Wistar大鼠睾丸AQP7cDNA编码区全长序列 ,测序鉴定 ,将AQP7cDNA融合于pEGFP C1基因的下游。以脂质体转染方法将pEGFP C1 AQP7融合蛋白转入中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞 ,应用免疫细胞化学方法和Western印迹技术对转染细胞株进行鉴定。　结果 :①Wistar大鼠AQP7cDNA序列登录到GenBank ,登录号 :AY15 7737;②通过鉴定证明CHO细胞已经稳定表达了pEGFP C1 AQP7融合蛋白 ,其相对分子质量为 5 30 0 0 ;③绿色荧光蛋白作为标记物观察到AQP7在CHO细胞的定位。　结论 :稳定表达pEGFP C1 AQP7融合蛋白的CHO细胞株的建立 ,为AQP7在细胞内定位与功能研究奠定了基础。     

RhoC基因真核表达载体的构建及其表达

目的 为探讨RhoC基因的功能以及其对肝癌的侵袭转移的影响提供实验模型。方法 用限制性内切酶酶切RhoC基因，定向克隆到pcDNA3.1上，利用脂质体将重组载体（pcDNA3.1-RhoC)空载体（pcDNA3.1)转染入HEPG2细胞，潮霉素选择培养，RT－PCR及免疫组化鉴定其稳定表达。结果 构建的真核表达载体pcDNA3.1-RhoC在HEPG2细胞中有稳定表达。结论 本实验为深入研究RhoC基因的功能以及其对肝癌的侵袭转移的影响提供了理想的体外实验模型。     

人VEGF-C基因荧光真核表达载体的构建和表达

目的:构建含有绿色荧光蛋白基因的人血管内皮生长因子C基因的真核表达载体,检测该基因在真核细胞中的表达,研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用.方法:含有绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP-1通过末端平滑化,酶切获得5'(粘端)BamHI-EGFP-XbaI(平端)3'片断,已经构建的VEGF-C表达载体pcDNA3.1/VEGF-C通过末端平滑化,酶切获得5'-(粘端)BamHI-pcDNA3.1-目的基因-KpnI(平端)3',两片段连接构建含有绿色荧光蛋白的真核表达载体,琼脂糖凝胶电泳并测序检测插入片段的正确性.将该载体通过脂质体转染到真核细胞CHO中,观察绿色荧光蛋白在CHO细胞中的表达情况.通过G418筛选阳性转染细胞,提取总RNA,行RT-PCR,PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察VEGF-C基因在CHO细胞中的表达情况.结果:琼脂糖凝胶电泳证实了插入EGFP片段的大小,测序结果证实了插入片段的正确性,CHO细胞中看到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR产物中含有VEGF-C cDNA.结论:成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的VEGF-C真核表达载体并检测到在真核细胞CHO中的表达.     

人源化绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

目的: 构建人源化绿色荧光蛋白(humanized greenfluorescent protein,hGFP)基因的真核表达栽体pcDNA3GFP,并观察其在MDCK细胞中的表达情况. 方法: 以Not I切取GFP后插入真核表达载体pcDNA3,以BamH I为鉴定方向,以Lipofect AMINE PLUSTM将pcDNA3GFP转染至培养的MDCK,经G418筛选GFP阳性克隆,于荧光显微镜下观察. 结果: 成功构建了含hGFP cDNA的真核表达载体 pcDNA3GFP,并成功转染MDCK细胞,在荧光显微镜下阳性克隆呈绿色. 结论: GFP基因可在MDCK细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记.     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：VEGF—C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF—C的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有EcoRI和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT—RCR方法扩塔人乳腺癌细胞MDA—MB－231中的VEGF—C cDNA(1.26kb)；回收PCR产物(1．28kb)，并将其连接至克隆载体pUMT—18中，重组的pUMT—18在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF—C cDNA全长的酶切片断(1．27kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1（－)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT—PCR产物自有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pUMT—18中自有正确的人VEGF—C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1(-)中含有人VEGF—C cDNA全长序列。结论：VEGP—C/pcDNA3．1(－)。     

脂质体介导胶质细胞生长因子真核表达载体在大鼠脊髓内的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）和胶质细胞生长因子2（glial growth factor 2,GGF2）的双基因真核表达载体在脊髓内转染及其表达变化。方法构建GGF2与EGFP双基因真核表达载体pIRES2-EGFP-GGF2。采用注射法将阳离子脂质体和pIRES2-EGFP-GGF2质粒混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中。采用RT-PCR法检测不同时间点转染区域脊髓组织中GGF2 mRNA的表达。在荧光显微镜下观察不同时间点EGFP在大鼠脊髓中的表达。结果基因转染后2 d即可观察到EGFP的表达及GGF2 mRNA表达的增加,在基因转染后1～2周内EGFP及GGF2 mRNA呈高水平表达,基因转染4周后,EGFP及GGF2 mRNA的表达明显减少。结论脂质体介导pIRES2-EGFP-GGF2转染大鼠脊髓后其表达的特点有助于基因治疗效果的即刻性,即早期大量表达,起到基因治疗的作用,又可避免外源基因的持续表达。     

小鼠睾丸特异性新基因TSAF76的克隆及其在睾丸组织中的表达

目的筛选与精子发生和（或）睾丸发育相关的基因。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA与小鼠睾丸DNA芯片进行杂交，通过杂交信号比较，筛选出差异表达基因。利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析。RT-PCR方法分析该基因在小鼠不同组织及不同发育阶段睾丸组织中的表达。结果通过4日龄和18日龄小鼠睾丸芯片信号比较筛选出一个差异表达的基因，命名为TSAF76基因（GenBank登录号：AF503943），测序提示该基因全长1052bp，包含1个474bp的开放阅读框，编码157个氨基酸。对TSAF76蛋白质序列分析表明该蛋白质理论相对分子量为18．77kDa，等电点PI为9．782。TSAF76蛋白与表达于人类睾丸和成熟精子中的AAT1蛋白类似。RT-PCR分析表明TSAF76基因在处于精子发生中的睾丸组织特异性表达。结论TSAF76基因可能在小鼠精子发生过程中起作用。     

凋亡素基因重组腺病毒的构建

目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体,为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。方法Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrack-CMV-VP3,然后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组。PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA,然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒,运用RT-PCR鉴定重组腺病毒。用氯化铯梯度离心纯化病毒。用物理和生物方法确定病毒的滴度。结果PacⅠ酶切证实同源重组成功。绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力,RT-PCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。重组腺病毒的浓度为84.52×109VP/ml,滴度为6.561×109PFU/ml。结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒,它的滴度足以满足体内外实验。     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

HLA-E�������������幹�������ڸΰ�HepG2ϸ���еı��

目的 构建表达人类白细胞抗原-E(HLA-E)基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导HLA-E基因在肿瘤免疫中的意义.方法 2006年10月至2007年11月在中山大学附属第三医院肝移植中心应用pGC-El-GFP-HLA-E慢病毒载体转导肝癌HepG2细胞,检测慢病毒载体的转导效率、细胞内HLA-E信使核糖核酸(mRNA)及蛋白质水平的表达.结果 pGC-El-GFP-HLA-E慢病毒载体转导肝癌HepG2细胞72h的转导效率为(95.0±1.3)%;通过RT-PCR检测24h后细胞内HLA-E mRNA水平是肝癌HepG2细胞的(8.73±1.05)倍,72h后为(293.48±42.01)倍,差异具有统计学意义(P<0.01).细胞免疫组化显示转导HLA-E后细胞内的蛋白水平明显增强.结论 慢病毒栽体系统能够使转导的基因在靶细胞中得到稳定表达,是基因治疗中的理想载体.     

人巨噬细胞金属弹性蛋白酶基因真核表达载体的构建及其鉴定

目的　构建一个包含人巨噬细胞金属弹性蛋白酶 (HME)基因全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3 .1(-) /HME ,为进一步研究人巨噬细胞金属弹性蛋白酶对体内肿瘤血管生成的影响奠定基础。方法　用Trizol试剂法从经体外纯化培养的人巨噬细胞中提取总RNA ,经逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增目的片段 ,PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接 ,并转化入大肠杆菌DH5α扩增以获得重组载体。结果　RT PCR获得预期大小的特异性DNA片段 ,经双酶切鉴定及测序证实已将人巨噬细胞金属弹性蛋白酶基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论　成功获得pcDNA3 .1(-) /HME重组真核表达载体。     

携带Notch-1受体胞内段基因重组腺病毒载体的构建及其在胰腺腺泡细胞中的表达

目的构建并鉴定携带Notch-1受体胞内段基因（NICD）的腺病毒表达载体，同时观察重组腺病毒在胰腺腺泡细胞中的表达。方法提取K562细胞总RNA，利用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增NICD并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，经PmeI酶切线性化质粒后与pAdeasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒线性化后转染293细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad—NICD。将该病毒感染胰腺腺泡细胞并通过实时定量PCR检测其表达。结果经PCR、基因测序和酶切鉴定证实重组质粒pAd—NICD构建成功，将重组质粒导入293细胞可以观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达，实时定量PCR证实病毒颗粒Ad—NICD感染腺泡细胞后可以有效地增加NICD表达。结论成功构建Ad—NICD并证实其在腺泡细胞中的表达，为进一步研究Notch信号传导途径及其与胰腺的疾病的关系奠定了基础。     

人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的 构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达.方法 取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录.聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的 蛋白质的表达.结果 RT-PCR扩增出TDRGl基因编码序列,目的 插入片段长约303bp:产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功:该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39-8kD的目的 蛋白表达.结论 成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达.     

与基底细胞癌细胞凋亡相关的分子生物学研究--促凋亡分子Bad的克隆及其pEGFP-C3真核表达载体的构建

目的:克隆Bcl-2相关凋亡基因Bad并构建其真核表达载体,探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:采用RT-PCR的方法,扩增Bad基因全长片段。通过基因定向克隆,构建Bad基因的真核表达质粒载体。结果:经酶切鉴定、PCR及DNA序列测定鉴定,Bad基因表达质粒pEGFP-C3载体成功构建。结论:成功克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad并构建其真核表达载体pEGFP-C3-Bad,为进一步研究Bad在人肿瘤细胞系中的促凋亡作用奠定了实验基础。