ZIPK在PKCα、PKCε调节失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用

目的： 观察失血性休克后,Zipper相互作用蛋白激酶（ZIPK）在蛋白激酶Cα（PKCα）、蛋白激酶Cε（PKCε）调节失血性休克大鼠血管钙敏感性中的作用。方法： 采用离体微血管环张力测定技术,观察褪膜后抑制ZIPK对PKCα、PKCε激动剂增高失血性休克肠系膜上动脉（SMA）一级分支微血管钙敏感性作用的影响;同时观察缺氧血管平滑肌细胞（VSMCs）在PKCα、PKCε激动剂作用下ZIPK蛋白表达、活性的变化。结果： （1）失血性休克后SMA钙敏感性明显降低,PKCα、PKCε激动剂可显著增高休克后的SMA钙敏感性,使Ca2+的Emax由正常对照的47.2％分别增高至66.5％（P<0.01）和66.3％（P<0.01）;抑制ZIPK,可显著降低PKCα激动剂和PKCε激动剂的增高休克SMA钙敏感性的作用,Ca2+的Emax降低至正常对照组的42.6％（P<0.01）和47.5％（P<0.01）。（2）缺氧2 h的VSMCs中,ZIPK蛋白表达降低,活性降低,PKCα、PKCε激动剂可增高缺氧VSMCs的ZIPK蛋白表达和活性。结论： PKCα、PKCε可能通过改变ZIPK的蛋白表达和活性,来调节失血性休克后血管的钙敏感性。     

缺血预处理对失血性休克大鼠血管反应性及钙敏感性的影响

目的：观察缺血预处理对失血性休克血管反应性和钙敏感性的影响。方法：通过观察不同缺血预处理方法对失血性休克大鼠存活时间和24 h存活率的影响,选择最适缺血预处理方法。在体实验,观察缺血预处理对失血性休克大鼠肠系膜上动脉（SMA）血管管径对去甲肾上腺素（NE）收缩反应性和NE升压反应的影响;离体实验,应用离体血管环张力测定技术,观察缺血预处理对失血性休克后大鼠SMA环血管反应性和钙敏感性的影响。结果：确定最适缺血预处理方法为：夹闭腹主动脉1 min,开放5 min,重复3次,2 h后复制失血性休克模型,这种方法可显著增加失血性休克大鼠的存活时间和24 h存活率。在体实验,缺血预处理可显著增加休克晚期NE的升压效应和在体SMA对NE的收缩反应（P<0.01）。离体实验,与失血性休克对照组比较,缺血预处理组SMA在休克早期(休克即刻)对NE的收缩反应性和钙敏感性明显下降（P<0.05）,但与正常对照组比较无显著差异（P>0.05）;在休克后期（休克2 h、3 h、4 h）,缺血预处理组SMA对NE的收缩反应性和钙敏感性显著增加（P<0.05）,且与正常对照组比较无显著差异（P>0.05）。结论：缺血预处理可能通过改善血管钙敏感性发挥对休克后期血管反应性的保护效应。     

参与失血性休克血管钙敏感性调节的信号分子

目的：观察Rho-激酶、PKC、PKG对失血性休克大鼠血管钙敏感性的调控作用。 方法： 取失血性休克大鼠肠系膜上动脉，利用离体血管环张力测定技术，用去极化状态下(120 mmol/L K+)血管环对梯度浓度Ca2+的收缩力反映钙敏感性，观察Rho-激酶激动剂血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）、Rho-激酶抑制剂fasudil、PKC激动剂PMA、PKC拮抗剂staurosporine、PKG激动剂8Br-cGMP和PKG拮抗剂KT-5823对失血性休克血管钙敏感性的影响。 结果： Ang-Ⅱ、PMA、KT-5823可增高失血性休克血管的钙敏感性，表现为Ca2+的量效曲线明显左移，在Ca2+（3×10-2 mol/L）水平，Emax分别为0.630 g/mg、0.595 g/mg、0.624 g/mg，均明显高于休克组的0.377 g/mg(P<0.05，P<0.01)；fasudil、staurosporine、8Br-cGMP可降低失血性休克血管的钙敏感性，表现为Ca2+的量效曲线明显右移，在Ca2+（3×10-2 mol/L）水平，Emax分别为0.242 g/mg、0.230 g/mg、0.256 g/mg，均显著低于休克组(P<0.05，P<0.01)。 结论： Rho-激酶、PKC、PKG对失血性休克大鼠血管钙敏感性有调节作用，Rho-激酶、PKC可上调钙敏感性，PKG可下调钙敏感性。     

PKC信号通道对严重创伤性休克大鼠血管舒缩功能的调节作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)信号通道是否参与了严重创伤性休克后血管舒缩功能的调控。方法取严重创伤性失血性休克大鼠的腹腔动脉(CA),观察PKC激活剂PMA及PKC抑制剂Staurosporine对休克后去甲肾上腺素(NE)、氯化钾(KC l)诱导的血管收缩反应的影响,以及PMA对乙酰胆碱(ACh)介导的内皮依赖性舒张(EDR)和硝普钠(SNP)介导的内皮非依赖性舒张(EIDR)反应的影响。结果严重创伤性失血性休克大鼠腹腔动脉对NE、KC l诱导的收缩反应以及ACh、SNP介导的舒张反应都显著降低;PMA(0.01、0.1、1μmol/L)对NE、KC l诱导的休克血管收缩反应有显著的增强作用,且呈浓度依赖性;Staurosporine(100 nmol/L)可使休克血管对NE、KC l的反应性进一步降低,同时Staurosporine预处理能显著抑制PMA增强休克血管收缩反应的作用;PMA(0.1μmol/L)可使ACh和SNP诱导的舒张反应都进一步降低。结论PKC信号通道对严重创伤后的血管舒缩功能具有重要的调节作用。     

Ang-1、Ang-2差异表达在大鼠失血性休克血管反应性双相变化中的作用

目的:观察血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)在失血性休克后肠系膜上动脉中的表达变化,及其在失血性休克血管反应性双相变化中的作用。方法:采用离体微血管环张力测定技术和Western blotting技术,观察失血性休克后不同时点肠系膜上动脉(SMA)一级分支微血管环的血管反应性、SMA中Ang-1、Ang-2的蛋白表达变化;并观察在缺氧高血管反应期和低血管反应期,给予和抑制Ang-1、Ang-2对SMA一级分支血管环血管反应性的影响。结果:(1)失血性休克后,肠系膜上动脉血管反应性呈早期增高、晚期降低的双相变化,休克10min组NE的Emax最高,为正常的129.3%(P0.01);Ang-1的蛋白表达也呈早期增高、晚期降低的双相变化,休克10min组的Ang-1蛋白表达最高,为正常对照组的1.85倍;Ang-2的蛋白表达在休克早期变化不大,在休克后期逐渐增高,休克4h组的Ang-2蛋白表达最高,为正常对照组的2.90倍。(2)在高血管反应期(缺氧30min),外源性给予Ang-1对血管反应性影响不大,尽管NE的Emax增大,但无显著差异(P0.05),外源性给予Ang-2可降低血管反应性(P0.01);在低血管反应期(缺氧4h),外源性给予Ang-1可改善血管反应性(P0.01),外源性给予Ang-2可进一步降低血管反应性(P0.01)。结论:失血性休克后,肠系膜上动脉存在Ang-1、Ang-2的差异表达,这种差异表达参与了失血性休克血管反应性双相变化的形成。     

PKC-α、б亚型在AVP改善缺氧处理VSMC反应性中的作用及其与MLC20磷酸化调节的关系

目的:探讨蛋白激酶c(PKC)-а、б亚型在精氨酸血管加压素(AVP)改善缺氧处理血管平滑肌细胞(VSMC)反应性中的作用及其与肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的关系.方法:贴块法取大鼠肠系膜上动脉(SMA)血管平滑肌细胞原代培养并传代至第3-5代后用于实验,观察缺氧1.5 h后PKC-а、б亚型抑制剂处理对AVP调节VSMC收缩反应性的影响,以荧光素标记的牛血清白蛋白在Transwell小室中的渗透率变化反映VSMC的收缩反应性;用酶反应法测定缺氧VSMC MLCK/MLCP活性.同时取失血性休克大鼠(30 mmHg,2 h)SMA,观察PKC-а、б亚型在AVP调节休克血管MLC20磷酸化水平(Western blotting)中的作用.结果:PKC-а抑制剂Go6976预处理可明显抑制AVP引起的缺氧VSMC收缩反应的升高,而PKC-б抑制剂rottlerin也部分抑制AVP的作用.缺氧VSMC的MLCP活性明显升高、MLCK活性降低,同时休克血管平滑肌的MLC20磷酸化水平降低;AVP预处理可使缺氧VSMC MLCP活性降低、MLC20磷酸化水平升高,而Go6976可明显拮抗AVP的作用,rottlerin仅有轻度的抑制作用.AVP和PKC-α、б抑制剂对MLCK活性的变化无明显影响.结论:AVP通过调节血管平滑肌细胞MLCP活性和MLC∞磷酸化水平来恢复休克后血管反应性和钙敏感性,PKC-α是其中重要的调节分子.     

PKC-α、δ亚型在AVP改善缺氧处理VSMC反应性中的作用及其与MLC20磷酸化调节的关系

目的：探讨蛋白激酶C(PKC)-α、δ亚型在精氨酸血管加压素(AVP)改善缺氧处理血管平滑肌细胞(VSMC)反应性中的作用及其与肌球蛋白轻链(MLC₂₀)磷酸化、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的关系。 方法: 贴块法取大鼠肠系膜上动脉(SMA)血管平滑肌细胞原代培养并传代至第3-5代后用于实验,观察缺氧1.5 h后PKC-α、δ亚型抑制剂处理对AVP调节VSMC收缩反应性的影响,以荧光素标记的牛血清白蛋白在Transwell小室中的渗透率变化反映VSMC的收缩反应性;用酶反应法测定缺氧VSMC MLCK/MLCP活性。同时取失血性休克大鼠(30 mmHg,2 h)SMA,观察PKC-α、δ亚型在AVP调节休克血管MLC₂₀磷酸化水平(Western blotting)中的作用。结果: PKC-α抑制剂G 6976预处理可明显抑制AVP引起的缺氧VSMC收缩反应的升高,而PKC-δ抑制剂rottlerin也部分抑制AVP的作用。缺氧VSMC的MLCP活性明显升高、MLCK活性降低,同时休克血管平滑肌的MLC₂₀磷酸化水平降低;AVP预处理可使缺氧VSMC MLCP活性降低、MLC₂₀磷酸化水平升高,而G 6976可明显拮抗AVP的作用,rottlerin仅有轻度的抑制作用。AVP和PKC-α、δ抑制剂对MLCK活性的变化无明显影响。结论: AVP通过调节血管平滑肌细胞MLCP活性和MLC₂₀磷酸化水平来恢复休克后血管反应性和钙敏感性,PKC-α是其中重要的调节分子。     

PKC-α、δ亚型在AVP改善缺氧处理VSMC反应性中的作用及其与MLC20磷酸化调节的关系

目的：探讨蛋白激酶C（PKC）-α、δ亚型在精氨酸血管加压素（AVP）改善缺氧处理血管平滑肌细胞（VSMC）反应性中的作用及其与肌球蛋白轻链（MLC20）磷酸化、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）的关系。方法：贴块法取大鼠肠系膜上动脉（SMA）血管平滑肌细胞原代培养并传代至第3—5代后用于实验,观察缺氧1．5h后PKC-α、δ亚型抑制剂处理对AVP调节VSMC收缩反应性的影响,以荧光素标记的牛血清白蛋白在Transwell小室中的渗透率变化反映VSMC的收缩反应性;用酶反应法测定缺氧VSMCMLCK／MLCP活性。同时取失血性休克大鼠（30mmHg,2h）SMA,观察PKC-α、δ亚型在AVP调节休克血管MLC20磷酸化水平（Western blotting）中的作用。结果：PKC-α抑制剂G66976预处理可明显抑制AVP引起的缺氧VSMC收缩反应的升高,而PKC-δ抑制剂rottlerin也部分抑制AVP的作用。缺氧VSMC的MLCP活性明显升高、MLCK活性降低,同时休克血管平滑肌的MLC20磷酸化水平降低;AVP预处理可使缺氧VSMCMLCP活性降低、MLC。磷酸化水平升高,而Go 6976可明显拈抗AVP的作用,rottlerin仅有轻度的抑制作用。AVP和PKC-α、δ抑制剂对MLCK活性的变化无明显影响。结论：AVP通过调节血管平滑肌细胞MLCP活性和MLC。磷酸化水平来恢复休克后血管反应性和钙敏感性,PKC-α是其中重要的调节分子。     

失血性休克大鼠淋巴管低反应性的钙敏机制

目的:观察失血性休克(HS)大鼠离体淋巴管对去甲肾上腺素(NE)反应性以及钙敏感性的变化,探讨淋巴管低反应性的钙敏机制。方法:Wistar雄性大鼠随机均分为sham组(仅手术)和HS组(复制HS模型,分为休克1 h、休克2 h亚组),制备胸导管环(每组均n=48)。采用离体淋巴管张力测定技术,观察淋巴管环对NE反应性以及钙敏性[梯度Ca2+与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和胰岛素(Ins)分别孵育]变化。结果:与sham组相比,HS1 h组、HS 2 h组大鼠离体淋巴管对NE反应的量效曲线以及HS 2 h组淋巴管对Ca2+的量效曲线明显右移,对NE多个浓度的反应性以及不同Ca2+浓度的收缩力、最大收缩力(Emax)、亲和力指数(pD2)均显著降低。HS大鼠离体淋巴管环与钙敏感性增强剂AngⅡ孵育后,对NE的反应性以及钙敏感性均显著升高,但仍低于sham组;与钙敏感性抑制剂Ins孵育后,对NE的反应性以及钙敏感性均显著降低。结论:HS大鼠离体淋巴管的低反应性与钙失敏有关,这是休克时淋巴管收缩性降低的机制之一。     

阻断肠淋巴液回流提升失血性休克大鼠的血管反应性和钙敏感性

目的:观察肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流对失血性休克(HS)大鼠血管反应性与钙敏感性的影响,探讨肠淋巴液在休克血管低反应性中的作用。方法:72只Wistar雄性大鼠随机均分为sham组(仅手术)、shock组(复制HS模型)、shock+ligation组(复制HS模型,行肠淋巴管结扎)、shock+drainage组(复制HS模型,行肠淋巴液引流)。记录所有动物在不同时点给予去甲肾上腺素(NE 3μg/kg)后平均动脉血压(MAP)的变化;维持低血压40 mmHg 3 h后,制备肠系膜上动脉(SMA)血管环(均n=36)。采用离体血管环张力测定技术,观察SMA血管环对NE反应性以及钙敏感性[梯度Ca2+、与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、胰岛素(Ins)分别孵育]的变化。结果:Shock组在休克即刻和0.5 h△MAP显著高于sham组,在1.5 h、2 h、2.5 h、3 h均显著降低;shock+ligation和shock+drainage组在休克即刻、0.5 h、1 h时△MAP显著高于sham组,在2.5 h和3 h时显著降低;shock+ligation和shock+drainage组在休克0.5 h后多个时点的△MAP均显著高于shock组。Shock、shock+ligation和shock+drainage组SMA血管环对NE的反应性和Ca2+的敏感性均显著低于sham组;shock+ligation和shock+drainage组SMA血管环对NE的反应性和Ca2+的敏感性均高于shock组。SMA与AngⅡ或Ins孵育后,shock、shock+ligation和shock+drainage组血管反应性和钙敏性均显著低于sham组,且shock+ligation和shock+drainage组均显著高于shock组。结论:以肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流阻断休克肠淋巴液回流,均可提高HS大鼠的血管反应性,其机制与提高钙敏感性有关。     

Cx40和Cx43调节大鼠肠系膜上动脉收缩反应性与钙敏感性的机制

目的：研究连接蛋白Cx40/Cx43对大鼠肠系膜上动脉内膜依赖的血管收缩反应性与钙敏感性的调节作用机制。方法:以SD大鼠肠系膜上动脉（SMA）为研究对象，用Cx40或Cx43反义寡脱氧核苷酸（Cx40/Cx43AODN）阻断SMA Cx40或Cx43表达，观察缺氧处理后SMA的收缩反应性、钙敏感性、肌球蛋白轻链磷酸酶/激酶（MLCP/MLCK)的活性、20 kD的肌球蛋白轻链（MLC₂₀）磷酸化程度的变化。结果:Cx40AODN可以降低正常组、1 h和3 h缺氧组SMA MLCP活性，增加MLC₂₀磷酸化水平，改善血管的钙敏感性和内膜依赖的收缩反应性；Cx43AODN可以增加各组血管的MLCP活性，减少MLC₂₀磷酸化水平，降低血管的钙敏感性和内膜依赖的收缩反应性。Cx40和Cx43AODN对SMA MLCK活性无明显作用。结论:Cx40和Cx43主要通过调节血管平滑肌细胞的MLCP活性和MLC₂₀磷酸化水平调节血管的钙敏感性，从而调节休克后内膜依赖的血管收缩反应性。     

Myosin light chain kinase is necessary for post-shock mesenteric lymph drainage enhancement of vascular reactivity and calcium sensitivity in hemorrhagic-shocked rats

Vascular hyporeactivity is an important factor in irreversible shock, and post-shock mesenteric lymph (PSML) blockade improves vascular reactivity after hemorrhagic shock. This study explored the possible involvement of myosin light chain kinase (MLCK) in PSML-mediated vascular hyporeactivity and calcium desensitization. Rats were divided into sham (n=12), shock (n=18), and shock+drainage (n=18) groups. A hemorrhagic shock model (40±2 mmHg, 3 h) was established in the shock and shock+drainage groups. PSML drainage was performed from 1 to 3 h from start of hypotension in shock+drainage rats. Levels of phospho-MLCK (p-MLCK) were determined in superior mesenteric artery (SMA) tissue, and the vascular reactivity to norepinephrine (NE) and sensitivity to Ca²⁺ were observed in SMA rings in an isolated organ perfusion system. p-MLCK was significantly decreased in the shock group compared with the sham group, but increased in the shock+drainage group compared with the shock group. Substance P (1 nM), an agonist of MLCK, significantly elevated the decreased contractile response of SMA rings to both NE and Ca²⁺ at various concentrations. Maximum contractility (E_max) in the shock group increased with NE (from 0.179±0.038 to 0.440±0.177 g/mg, P<0.05) and Ca²⁺ (from 0.515±0.043 to 0.646±0.096 g/mg, P<0.05). ML-7 (0.1 nM), an inhibitor of MLCK, reduced the increased vascular response to NE and Ca²⁺ at various concentrations in the shock+drainage group (from 0.744±0.187 to 0.570±0.143 g/mg in E_max for NE and from 0.729±0.037 to 0.645±0.056 g/mg in E_max for Ca²⁺, P<0.05). We conclude that MLCK is an important contributor to PSML drainage, enhancing vascular reactivity and calcium sensitivity in rats with hemorrhagic shock.     

线粒体KATP通道开放对培养成年大鼠心肌细胞PKC epsilon转位激活的影响

目的：探讨MitoKATP通道特异性开放剂二氮嗪(DZ)预处理对PKCε的转位激活作用及其与活性氧生成的关系。 方法： 采用免疫荧光和Western blotting等技术检测培养成年大鼠心室肌细胞PKCε的表达。 结果： ①MitoKATP通道特异性开放剂DZ预处理能引起PKCε向心肌细胞肌丝样结构转位；②活性氧清除剂2-巯基丙酰氨基乙酸(MPG)能抑制DZ预处理引起的PKCε转位；③PKC特性抑制剂氯化白屈菜赤碱(CH)能完全消除DZ预处理引起的PKCε转位。 结论： MitoKATP通道开放能够激活PKCε向肌丝样结构转位。MitoKATP通道开放过程中生成的ROS是引起PKCε转位激活的重要原因。     

大鼠海马神经元PKCε特异性shRNA对神经元突起生长的影响

目的 构建shRNA特异性干扰海马神经元内PKCε,研究PKCε干扰后海马神经元突起长度的变化.方法 设计并构建PKCε的小分子干扰shRNA载体.分别在293T细胞中共转染PKCε和各干扰片段,Western blot验证干扰效果.将有干扰作用的载体转染海马神经元,用细胞免疫荧光法验证干扰内源PKCε的效果.激光共聚...