γ-H2AX的辐射剂量效应关系研究

目的用共聚焦显微镜分别检测在整体和离体条件下电离辐射强度与γ-H2AX的剂量效应关系以及整体与离体之间的一致性关系。方法用137Cs源分7个剂量点(0、0.5、1、2、4、6、8Gy)照射Wister雌性大鼠外周全血,提取淋巴细胞,利用共聚焦显微镜检测电离辐射与γ-H2AX的剂量效应关系。结果在离体和整体条件下均发现电离辐射与γ-H2AX存在剂量反应关系,拟合的剂量反应曲线分别为:Y整=0.096+0.13X;Y离=0.040+0.21X。并且在离体和整体两种条件下的剂量反应关系具有一致性(R=0.98)。结论γ-H2AX与照射剂量之间存在正相关,相关系数R大于0.98。表明γ-H2AX检测有作为快速辐射生物剂量指标的可能性,可以用离体照射实验替代整体照射。     

60Coγ-射线诱导人膀胱癌EJ细胞中磷酸化组蛋白H2AX焦点形成

目的探讨^60Coγ-射线是否可在人膀胱癌EJ细胞中诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成以及形成的焦点数量与照射剂量及照射后时间的关系。方法免疫印迹法和流式细胞分析法用于检测不同剂量^60Coγ-射线照射后脚细胞中γH2AX蛋白表达的变化；免疫荧光法检测不同剂量照射后以及2Gy照射后不同时间日细胞中γH2AX焦点的数量。结果γ-射线照射后γH2AX蛋白表达明显增加，但量效关系不明显；免疫荧光法可检测γH2AX焦点形成的数量和大小，并且存在剂量-效应关系及有时间依赖性，随着照射剂量的增加，γH2AX焦点数目及大小均明显增加，照射的剂量范围从0．1～4．0Gy均可检测，照射后24h仍可检测到γH2AX焦点，但焦点数随时间延长而减少、减弱。结论免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目可敏感、直观地反映DNA损伤及修复情况，有望成为辐射检测及辐射致癌的好的生物指标。     

γ-H2AX与DNA双链断裂关系的研究进展

H2AX是组蛋白的一个种类,普遍存在于整个基因组中。据报道,DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸-139位C-端保守区域内的H2AX磷酸化形成γ-H2AX,在荧光显微镜下形成可见的γ-H2AX焦点。用特异性抗体的免疫荧光法检测γ-H2AX已成为测定DSB的金标准。目前,多种物理性、化学性和生物性的因素都能诱导形成γ-H2AX焦点。本文综述了不同因素诱导形成γ-H2AX的机制及其与DNA双链断裂之间的关系的研究进展。     

二甲双胍对肺癌细胞A549放疗增敏作用及机制研究

目的探讨二甲双胍对肺癌A549细胞的放射增敏作用及其潜在的机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度二甲双胍对A549细胞的抑制作用,计算IC_(50)值;细胞克隆形成实验检测二甲双胍联合放疗的增敏作用;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡;免疫印迹法检测DNA损伤蛋白γ-H2AX,DNA修复蛋白DNA-PK,Ku80,Ku70的表达。结果我们发现5mM浓度的二甲双胍增强了A549细胞的放射敏感性。克隆形成实验结果显示放疗联合5mM二甲双胍24小时后细胞存活分数(SF值)为1.39,单纯放疗组SF值为0.1;流式细胞技术结果显示6 Gy放疗联合5mM二甲双胍组24小时后G2/M期比例为8%,早期凋亡率为34.9%,而单纯放疗组G2/M期比例为26%,早期凋亡率为10.6%。免疫印迹结果显示5mM二甲双胍与6 Gy放射联合作用于A549细胞24小时,二甲双胍能够上调DNA损伤蛋白γ-H2AX表达,下调DNA修复蛋白DNA-PK,Ku70及Ku80表达(P0.01)。结论体外实验中,我们发现二甲双胍增敏放疗的机制是降低放疗相关的G2检查点及抑制DNA损伤修复。     

γ-H2AX 在辐射生物剂量估算中的研究进展

γ-H2AX对受照人员DNA双链断裂损伤修复具有重要作用,利用γ-H2AX焦点计数可以估算照射剂量,因其检测周期短、特异性与灵敏度相对较高,近几年被国内外广泛应用于辐射剂量生物估算研究。本文对γ-H2AX在生物剂量估算中的应用与研究进展做一综述,对其在核与辐射事故批量受照人员的快速剂量估算以及伤员分类的应用前景上进行展望。     

醋酸铅染毒致人外周血淋巴细胞遗传损伤的研究

目的研究醋酸铅染毒致人外周血淋巴细胞遗传损伤情况。方法不同浓度醋酸铅染毒人外周血淋巴细胞,CCK-8试验检测细胞活力;染色体畸变试验检测醋酸铅染毒对人外周血淋巴细胞染色体损伤作用;免疫荧光染色检测DNA双链断裂损伤生物标志物组蛋白H2AX的磷酸化(γ-H2AX)表达情况。结果醋酸铅染毒抑制人外周血淋巴细胞活力,其24 h的IC50值为168.5μmol/L;醋酸铅染毒后,人外周血淋巴细胞染色体损伤程度和γ-H2AX焦点表达水平随醋酸铅浓度的增加和染毒时间的延长而升高,呈现明显的剂量效应和时间效应。结论醋酸铅对人外周血淋巴细胞有潜在的细胞毒性和遗传毒性。     

辐射对沉默ATRX的H460细胞增殖以及DNA损伤修复的影响

目的 探讨辐射对沉默ATRX的肺癌H460细胞增殖和DNA损伤修复的影响及二者的关系。方法 靶向ATRX的3个慢病毒载体转染293T细胞后,慢病毒感染H460细胞,获得ATRX低/无表达的细胞株shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460,并以shControl-H460作为对照,利用Western blot检测沉默效率。分别以克隆形成实验检测细胞增殖,免疫荧光技术检测γH2AX和Rad51焦点数,同时以Western blot检测PARP1、γH2AX和Rad51蛋白的表达。结果 shControl-H460细胞中可见ATRX表达,而shATRX1-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞中ATRX表达均出现不同程度的降低。克隆形成实验显示,shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞的存活分数（survival fraction,SF）均较shControl-H460细胞降低。shControl-H460和shATRX3-H460细胞经4 Gy照射后1 h,γH2AX焦点最多,而3 h时Rad51焦点最多,而后均降低,与shControl-H460细胞比较,在1和6 h时shATRX3-H460细胞γH2AX焦点,以及1、3和6 h时Rad51焦点显著增加（P<0.05,P<0.001）。而且shATRX3-H460细胞中PARP1、γH2AX和Rad51蛋白在3和6 h时均较shControl-H460细胞表达增加。结论 成功地获得靶向沉默ATRX的细胞模型,辐射后细胞增殖能力降低,可能与DNA损伤修复能力降低有关。     

冬凌草甲素抑制胃癌SGC-7901细胞增殖诱导DNA损伤相关蛋白表达的实验研究

目的探索冬凌草甲素对胃癌细胞增殖及DNA损伤相关蛋白表达的影响。方法MTT法检测冬凌草甲素对胃癌细胞的增殖活性的影响;Western blot检测H2AX、γH2AX、ATM、phospho-ATM、phospho-P53、P53、phospho-CHK2等DNA损伤相关蛋白表达的变化;免疫荧光检测冬凌草甲素对phospho-ATM和γ-H2AX焦点形成的影响。结果 MTT结果显示冬凌草甲素能够抑制胃癌细胞增殖,具有剂量依赖关系;Western blot结果显示γH2AX、phospho-ATM、phospho-P53、P53、phospho-CHK2蛋白水平呈剂量依赖性增高;免疫荧光结果发现phospho-ATM、γH2AX焦点随着药物浓度增大而增多。结论冬凌草甲素可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导DNA损伤及相关蛋白表达,且具有剂量依赖性,但DNA损伤信号通路详细机制有待进一步研究。     

1800 MHz射频电磁场对中国仓鼠肺成纤维细胞DNA损伤的影响

目的研究全球移动通讯系统(GSM)1800 MHz射频电磁场对中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)DNA损伤的影响.方法采用DNA双链断裂的早期标志性事件H2AX的磷酸化作为检测指标,将细胞间断(5 min开,10 min关)暴露于比吸收率为0或3.0 W/kg的1800 MHz射频电磁场1或24 h后,用4%多聚甲醛固定后进行γH2AX免疫荧光分析,即用鼠源抗γH2AX单克隆抗体为一抗和异硫酸酯荧光素标记的山羊来源抗鼠抗体为二抗,显示细胞核内γH2AX的形成情况.以4,6-二咪基-4-联苯基吲哚标记细胞核,采用Image Pro-Plus图像软件分析数据,以20 mg/L的DNA损伤剂二乙酰氨基芴(AAF)作用2 h作为阳性对照.各处理条件至少检测50个细胞的γH2AX 焦点数,焦点超过5个的细胞定义为γH2AX焦点阳性细胞,将该焦点阳性细胞率作为评价细胞DNA损伤程度的指标.结果γH2AX焦点阳性细胞率在1800 MHz射频暴露24 h后为(37.9±8.6)%,在阳性对照组为(50.9±9.4)%,与假辐照组的(28.0±8.4)%比较,明显增高;而射频暴露1 h后的γH2AX焦点阳性细胞率为(31.8±8.7)%,增加不明显.结论 1800 MHz 比吸收率为3.0 W/kg的射频电磁场辐照24 h对CHL细胞DNA有损伤作用.     

共济失调毛细血管扩张突变基因对氢醌诱导人外周血淋巴细胞DNA损伤及S期阻滞的影响

目的 探讨共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）对氢醌（hydroquinone，HQ）诱导人外周血淋巴细胞（JHP）DNA损伤及细胞周期S期阻滞的影响。方法 以不同浓度的HQ（0、1、5、10 μmol/L）处理JHP 12 h后，采用流式细胞术检测细胞周期分布情况，活细胞成像技术检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放水平，Western blot法检测DNA损伤标志蛋白γ-H2AX、抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1、NQO1以及细胞周期相关蛋白CyclinA、CDK2、CyclinE的表达；利用ATM化学抑制剂KU-60019预处理JHP 1 h，以10 μmol/L HQ处理12 h后观察上述指标的变化。结果 （1）与0 μmol/L HQ组相比，随着HQ浓度的增加，ROS释放水平逐渐升高，ATM、γ-H2AX及抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1、NQO1表达水平呈剂量依赖性增加，CDK2蛋白表达呈剂量依赖性降低（P<0.05）；10 μmol/L HQ组S期细胞比例显著增加，CyclinA表达水平显著降低，与0 μmol/L HQ组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（2）与HQ组相比，HQ+KU-60019组ROS的释放水平显著升高，S期阻滞减轻（P<0.05）；HQ+KU-60019组γ-H2AX、Nrf2、HO-1、NQO1和CDK2蛋白的表达均显著升高（P<0.05）。结论 HQ可诱导JHP的ROS释放，促进ATM蛋白、DNA损伤标志蛋白γ-H2AX以及抗氧化相关蛋白表达升高，诱导细胞发生S期阻滞；ATM表达抑制后，ROS释放增多，γ-H2AX以及抗氧化相关蛋白表达进一步升高，S期阻滞减轻。     

电离辐射对人肺非小细胞癌细胞株H446 nm23-H1基因表达的影响

目的:探讨电离辐射对人肺非小细胞癌细胞株H446 nm23-H1基因表达的影响.方法:取对数生长期的H446细胞置60Co放射治疗机上单次照射,照射剂量分别为0、1、2、3、4和5Gy,继续培养至0、6、24和48 h后收集细胞,提取细胞总RNA和总蛋白.分别用RT-PCR和Western blot检测nm23-H1基因mRNA和蛋白的表达水平.结果:照射后各剂量组mn23-H1 mRNA和蛋白的表达量均明显降低(P<0.01),与剂量之间呈负相关(P<0.05),相关系数r分别≥0.785和≥0.66;mRNA的表达水平在0～24 h内随培养时间延长逐渐增加,48 h时有所降低.蛋白表达在0～6 h内没有明显变化,24 h达到高点,48 h有所降低.结论:电离辐射对H446细胞nm23-H1基因表达有一定的影响,随着辐射剂量的增大该基因mRNA和蛋白表达水平逐渐降低,并且在所有观察时间点均显示出一定的剂量效应关系.     

干扰素-γ、干扰素-α2b联合应用诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡及机制

目的 研究干扰素-γ、干扰素-α2b联合应用对MCF-7乳腺癌细胞的诱导凋亡作用及其机制.方法 流式细胞仪（FCM）检测处理后细胞凋亡及Fas/FasL蛋白表达情况.结果 处理后凋亡细胞百分率及FasL的表达增加,随着处理时间的延长,表达有增加趋势,差异有统计学意义（P〈0.05）;Fas的表达无明显变化.结论 干扰素-γ、干扰素-α2b联合应用可诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,机制可能与上调FasL的表达,加强Fas/FasL之间的交联及使Fas/FasL通路敏感性增加有关.     

β-紫罗兰酮诱导人乳腺癌细胞(ER~+)凋亡作用

目的为了研究β-紫罗兰酮对雌激素阳性的人乳腺癌细胞(MCF-7)凋亡诱导作用的影响。方法采用细胞生长曲线,凋亡细胞的荧光显微镜和电镜观察,TUNEL方法及流式细胞光度术以及Western blot的检测方法,观察了用不同浓度β-紫罗兰酮(25、50、100和200μmol/L)对MCF-7细胞的抑制作用及诱导该细胞产生凋亡情况。结果β-紫罗兰酮可明显抑制MCF-7细胞生长,抑制率分别为6.57%、34.58%、65.22%和81.87%。通过荧光显微镜和电镜技术观察到了MCF-7细胞有凋亡的形态特征;TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记)方法和流式细胞光度术均检测到β-紫罗兰酮可诱导MCF-7细胞产生凋亡,并随着β-紫罗兰酮浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加。TUNEL凋亡指数(AI)分别为20.74%(24h)和33.15%(48h);流式细胞光度术的凋亡指数(AI)分别为27.96%(24h)和38.59%(48h)。通过Western blotting方法观察到β-紫罗兰酮可对MCF-7的细胞增殖相关蛋白PCNA及bcl-2蛋白表达有明显地抑制作用,呈现明显地剂量-反应关系。结论β-紫罗兰酮可明显地抑制雌激素阳性(ER+)人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,并诱导该细胞产生凋亡,其作用机制需要进一步探讨。     

二甲基甲酰胺致人肝细胞DNA的损伤效应

目的 探讨不同染毒剂量二甲基甲酰胺(DMF)在不同染毒时间下对人正常离体肝细胞DNA损伤的影响.方法 肝细胞染毒分别以PBS阴性对照组、1.56、6.25、25.00、100.00 mmol/L的DMF和100μmol/L的H2O2,染毒时间为0.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h,用γH2AX免疫荧光法观察肝细胞DNA的损伤情况.结果 不同剂量的DMF和H2O2诱导形成γH2AX焦点的细胞数量多于PBS阴性组,差异有统计学意义(P＜0.01),并且随着DMF染毒剂量的增加,形成γH2AX焦点细胞数有增多趋势;在不同染毒时间处理后,γH2AX焦点细胞数的形成除3.0 h组和0.5 h组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),余处理时间组与0.5 h比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),并且形成γH2AX焦点细胞数有减少趋势.结论 不同剂量DMF可引起DNA的损伤,并且损伤程度与剂量呈正相关,与染毒时间呈负相关,γH2AX可作为检测细胞DNA损伤程度的良好指标.     

IFN-γ诱导小鼠颗粒细胞DNA损伤及凋亡的体外研究

目的初步探讨IFN-γ诱导小鼠卵泡颗粒细胞DNA损伤及凋亡的机制。方法体外分离培养小鼠原代颗粒细胞,分为正常对照组、IFN-γ(1 000 U/ml)处理组及NAC(20 mM)+IFN-γ(1 000 U/ml)联合处理组,处理5d后,采用免疫荧光染色、Western blot和流式细胞术检测颗粒细胞的ATM/ATR信号通路中DNA损伤相关蛋白,ROS水平及凋亡相关蛋白的变化。结果 IFN-γ组颗粒细胞表达γ-H2AX,而NAC组未见明显γ-H2AX表达;Western blot发现IFN-γ组颗粒细胞γ-H2AX、Chk2和p-Chk2蛋白以及p53和p-p53、Caspase-3等凋亡相关蛋白水平均明显上调,NAC组中以上蛋白均被抑制;流式细胞术检测发现IFN-γ可诱导颗粒细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平上调,而NAC组颗粒细胞的ROS下降至对照组水平。结论 IFN-γ可通过DNA氧化损伤信号引起颗粒细胞凋亡。     

枸橼酸芬太尼对乳腺癌细胞体外增殖和侵袭的影响

目的:探讨枸橼酸芬太尼对人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖和侵袭的影响。方法:分别用0.000 1μmol/L、0.01μmol/L、1μmol/L的枸橼酸芬太尼处理MCF-7细胞,MTT比色法检测MCF-7细胞增殖;流式细胞仪检测MCF-7细胞细胞周期;采用划痕实验及侵袭小室法检测MCF-7细胞侵袭能力。结果:MTT比色法显示不同浓度枸橼酸芬太尼处理的MCF-7细胞的增殖率分别为(58.84±11.31)%、(54.37±9.89)%和(51.83±10.33)%,明显低于对照组;各组MCF-7细胞停滞在G2/M期的比例增加,S期比例减少;各实验组及对照组划痕实验显示48 h时间段的愈合率分别为(70.41±6.86)%、(64.36±3.87)%、(62.52±4.95)%和(83.34±4.59)%;侵袭小室实验显示枸橼酸芬太尼在体外具有抑制MCF-7细胞侵袭转移作用。结论:芬太尼可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖、使细胞周期停滞于G2/M期,并且降低其侵袭能力,对MCF-7细胞的生物学性状产生较大的影响。     

UVB:辐射对人角质形成细胞HaCaT的DNA损伤及其机制

目的研究不同剂量UVB辐射对人角质形成细胞HaCaT DNA损伤的影响及机制。方法采用紫外辐照装置照射人角质形成细胞Ha Ca T建立急性紫外辐射细胞模型;MTT法检测不同剂量紫外辐射对细胞存活的影响;免疫荧光和流式细胞术分别检测细胞核内磷酸化γH2AX焦点形成及蛋白表达水平;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测不同剂量不同时间照射后早期细胞凋亡百分数;免疫印迹法分别检测Caspase-3活化水平。结果 UVB辐射可抑制HaCaT细胞的存活,有一定的量效关系;相对较大剂量的UVB辐射可观察到明显的焦点形成;UVB照射后各剂量点磷酸化γH2AX的表达均明显高于未照射的对照组;UVB辐射可通过Caspase-3活化诱导细胞发生早期凋亡,照射后20 h,早期凋亡细胞百分数明显增加,特别是在UVB相对较大剂量范围内更明显,并有随照射剂量增高而增加的趋势。结论 UVB辐射可通过诱导DNA双链断裂抑制人HaCaT细胞存活,并通过激活Caspase-3而诱导细胞凋亡,细胞凋亡延迟,可能导致细胞更易于发生突变进而形成皮肤肿瘤。     

电离辐射与T细胞突变频率的剂量效应关系曲线的建立与验证

目的 建立T细胞受体基因突变频率(T cell receptor mutation frequency,TCR MF)与电离辐射剂量效应关系曲线.方法 招募8名健康成年人,4男4女.采集其外周血,分离淋巴细胞,分装到12孔培养板中,不同剂量(0.00～8.00 Gy)照射后,用植物血凝素蛋白(PHA-P)刺激,加人重组白介素-2(IL-2)培育7d,以流式细胞仪测量TCR MF,拟合剂量-效应曲线.另招募16例不同类型、照射方式及照射剂量的癌症放疗患者,采集外周血,用同样方法分离培养淋巴细胞,测量TCR MF,用拟合的剂量-效应曲线估算肿瘤放疗患者全身等效剂量.采集外周血,观察淋巴细胞染色体双着丝粒和着丝粒环畸变情况,估算受照剂量.结果 TCR MF与电离辐射在0.00～8.00 Gy剂量范围内剂量效应关系良好;大剂量组(2.00 ～8.00 Gy)、小剂量组(0.00～1.00 Gy)及0.00～8.00 Gy剂量组拟合曲线均符合二次多项式模式,拟合方程分别为TCR MF=- 32.8579+ 20.5436D+0.6341D2、TCR MF=1.796+0.017D+ 5.155D2和TCR MF=-0.6229+6.305D+0.6919D2,D为辐射剂量(Gy).用实验建立的曲线估算肿瘤放疗患者的全身受照剂量,与用染色体双着丝粒和着丝粒环畸变率估算的剂量平均相对标准偏差为16.8％.结论 应用TCR基因突变分析技术拟合出的辐射剂量效应曲线,可应用于电离辐射事故受照者近期受照剂量的估算.     

FTY720对人乳腺癌MCF-7细胞、喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的:探讨FTY720抑制人乳腺癌MCF-7细胞和喉癌Hep-2细胞增殖作用。方法:将人乳腺癌MCF-7细胞和喉癌Hep-2细胞用不同浓度FTY720作用48 h,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测其对细胞周期及凋亡率的影响。结果:MTT结果显示,FTY720对乳腺癌MCF-7细胞和喉癌Hep-2细胞增殖均有抑制作用,而且对喉癌Hep-2细胞抑制作用的浓度依赖性高于对乳腺癌细胞的作用;流式细胞术检测结果显示,FTY720可将乳腺癌MCF-7细胞阻滞于G1期,将喉癌Hep-2细胞阻滞于G2/M期,并明显促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡。结论:一定浓度的FTY720能明显抑制体外培养的乳腺癌和喉癌细胞增殖,调节其细胞周期,诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。     

三羟异黄酮对乳腺癌细胞系MCF-7生长的影响

目的探讨三羟异黄酮(Genistein)对乳腺癌细胞系MCF-7的生长、细胞周期及诱导细胞凋亡的影响。方法培养MCF-7细胞,在其对数生长期加入三羟异黄酮,通过MTT试验,流式细胞仪技术及Giemsa染色法,观察三羟异黄酮对MCF-7生长的影响。结果(1)MTT试验显示,细胞培养第1天,三羟异黄酮20、40、80、160μmol.L-14个剂量组的吸光度值(该值反映对MCF-7细胞生长的抑制作用)分别为0.460±0.018、0.450±0.020、0.440±0.020、0.385±0.040,明显低于对照组(0.520±0.023,P<0.05),第2、3、4天的变化趋势相同于第1天。(2)三羟异黄酮80、160μmol.L-12个剂量组的细胞周期G2%分别为50.0%、57.5%,而对照组为6.8%。(3)三羟异黄酮10、80μmol.L-12个剂量组晚期细胞凋亡率分别为6.51%、20.03%,而对照组为0.50%。结论三羟异黄酮对MCF-7的生长有明显的抑制作用;能阻滞细胞周期的正常进行,但主要在细胞周期的后期(G2期)发挥作用;能诱导细胞凋亡。