三氧化二砷诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对EWS—FLil融合蛋白的影响

目的：探讨三氧化二砷（Arsenic trioxide，As2O3）诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对融合蛋白EWS—FLi1表达的影响，．方法：应用噻唑蓝（MTF）法、形态学观察、原位末端标记法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）观察As2O3对体外生长的尤文肉瘤RD—ES细胞系生物行为的影响：应用半定量RT—PCR测定应用As2O3前后c—mye基因mRNA水平的变化；应用免疫细胞化学及固定化蛋白印迹法（Western blot）观察用药前后EWS—FLi1融合蛋白表达水平的变化、结果：As2O3对体外生长的RD—ES细胞系具有明显抑制作用，并可诱导细胞凋亡、c-mye基因mRNA表达水平和EWS—FLil融合蛋白表达量随As2O3作用时间延长逐渐降低结论：常规治疗浓度的As2O3对体外生长的尤文肉瘤细胞具有明显的杀伤作用，其作用机制与改变线粒体膜通透性和抑制EWS—Flil融合蛋白、降低c一myc基因表达有关。     

三氧化二砷(As2O3)诱导人肺腺癌GLC-82细胞凋亡及分子机制的研究

目的:探讨As2O3对人肺腺癌GLC-82细胞系抑制生长、诱导凋亡的生物学效应及作用机制.方法:通过MTT还原法检测As2O3对该细胞系生长的影响;用光学显微镜、流式细胞仪、DNA凝胶电泳和细胞凋亡原位检测(TUNEL)研究As2O3诱导细胞凋亡的情况;用RT-PCR、Northern blot或Western blot分析As2O3对c-myc、p53、p16和bcl-X等基因表达的影响.结果:As2O3能抑制GLC-82细胞的生长.As2O3处理GLC-82细胞后,光学显微镜下可见到明显的凋亡细胞,细胞周期的G1期前有低于2倍体的凋亡峰,DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征:DNA有规律断裂形成的梯状图谱,蛋白水平的检测表明As2O3可使细胞c-myc基因表达下降,p16和p53表达升高.结论:As2O3能显著抑制GLC-82细胞生长、诱导细胞凋亡,并主要通过调节c-myc,p16和p53等基因的表达来实现.     

细胞周期蛋白激酶抑制剂诱导尤文肉瘤细胞凋亡作用的机制

目的探讨小分子细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol（FP）尤文肉瘤细胞株RD-ES凋亡诱导作用及其调控机制。方法FP作用RD-ES细胞后，光学显微镜观察其形态变化，MTT法测定FP对细胞增殖的抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot检测bcl-2，bax，mcl-l和caspase-8的蛋白表达变化。结果MTT实验显示FP对尤文肉瘤RD-ES细胞增殖有抑制作用，其抑制效应具有时间及浓度依赖的特点，流式细胞计数分析表明FP可诱导细胞凋亡，免疫印迹检测显示FP对bcl-2及bax的表达无影响，但细胞凋亡抑制基因mcl-1活性型caspase-8的表达被上调。结论FP可诱导尤文肉瘤细胞株凋亡，其作用不依赖于bcl-2基因的变化，mcl-1基因表达的抑制及caspase-8路径的激活可能为其机制之一。     

三氧化二砷对人胃癌细胞系MGC803凋亡及耐药基因表达影响的实验研究

目的:研究三氧化二砷(As2O3)对人胃癌细胞系MGC803的抑制和诱导凋亡作用及对MRP基因表达的影响.方法:选用人胃癌MGC803细胞系,运用体外细胞培养法,MTT法,流式细胞术检测As2O3对人其抑制和诱导凋亡作用;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MRP mRNA的表达.结果:As2O3对人胃癌MGC803 细胞具有抑制作用,其抑制率呈时间-剂量依赖关系.不同浓度的As2O3均可诱导凋亡.1.0μmol/L、2.0μmol/L的As2O3可下调MRP mRNA的表达.结论:As2O3具有抗肿瘤作用,主要是通过诱导细胞凋亡实现的,其机制与下调MRP mRNA 表达有密切关系.     

抗CD44抗体HI44a诱导THP-1细胞凋亡作用的研究

背景与目的:研究抗CD44抗体HI44a体外诱导白血病细胞THP-1凋亡的作用及其机制.材料与方法:应用Annexin-V/PI染色法、原位凋亡检测试剂盒及透射电镜分别检测形态学变化及其凋亡情况,RT-PCR及western-blot方法检测原癌基因c-myc mRNA及蛋白水平的表达,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的变化,流式细胞仪检测抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.结果:采用多种方法均可证实,HI44a对THP-1细胞有明显的诱导凋亡作用.HI44a明显抑制THP-1细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P＜0.05);同时c-myc在mRNA及蛋白水平的表达水平均明显降低;并可诱导细胞线粒体膜电位的改变.结论:HI44a能够有效诱导THP-1细胞凋亡.其作用机制可能与调节相关癌基因及抗凋亡蛋白的表达,降低线粒体膜电位有关.     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中Par-4及WT1基因表达的变化

 目的　探讨三氧化二砷（As2O3）诱导K562细胞凋亡过程中前列腺凋亡反应因子-4（Par-4）和WT1基因表达的变化。方法　用不同浓度As2O3（2～10 μmol／L）处理K562细胞24～72 h,MTT法测定细胞增生活力,流式细胞术检测细胞凋亡,采用荧光定量RT-PCR检测Par-4和WT1基因 mRNA表达变化,Western blotting检测Par-4和WT1蛋白表达的变化。结果　不同浓度As2O3作用于K562细胞,随浓度增加能明显抑制细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。同时Par-4基因mRNA和蛋白表达逐渐增加;而WT1基因mRNA及蛋白表达逐渐下降。结论　As2O3可抑制K562细胞生长,诱导细胞凋亡,Par-4与WT1基因可能参与As2O3诱导K562细胞凋亡的调控。     

三氧化二砷对人肾癌RCC-WCS细胞的作用及其机制研究

目的 :观察三氧化二砷 (Arsenictrioxide ,As2 O3 )对人肾癌细胞系RCC WCS细胞生长的抑制作用 ,并初步探讨其作用机制。方法 :采用MTT法检测As2 O3 对肾癌细胞生长的抑制作用 ,用流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡 ,用RT PCR法检测c myc和bc1 2mRNA表达的变化。结果 :As2 O3 以浓度依赖方式抑制RCC WCS细胞的体外生长 ,在浓度为 0 5、1 0、2 0和 4 0 μmol/L作用 96h时 ,As2 O3 对RCC WCS细胞的抑制率分别为 2 7 6 0 %、30 0 9%、4 1 0 3%和 5 0 77% ;与未经As2 O3 处理的RCC WCS细胞相比 ,均有显著性差异 (P <0 0 1)。As2 O3 作用后的RCC WCS细胞 ,G2 /M期细胞从 7 3%上升到 16 6 % ,同时出现 13 7%的凋亡峰。As2 O3 可以诱导c mycmRNA表达水平的下降 ,但bc1 2的表达无明显变化。结论 :As2 O3 在相当于临床应用的浓度可抑制RCC WCS细胞生长 ,使细胞阻滞在G2 /M期 ,并诱导细胞凋亡。这种抑制作用机制之一可能是诱导c myc基因表达水平的下降。     

三氧化二砷对淋巴瘤T2细胞株SHP-1基因的去甲基化作用

背景与目的:去甲基化作用可能是三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对抗造血系统恶性肿瘤的另一种机制.本研究探讨As2O3对淋巴瘤细胞系T2细胞中抑癌基因酪氨酸磷酸酶(SH2-containinphosphatase-1,SHP-1)的去甲基化作用及对T2细胞生长增殖的生物学影响.方法:T2细胞以As2O3或5-氮杂胞苷(5-aza-2'-deoxyoytidine,5-AC)单独处理,或两药联合处理.采用甲基化特异性PCR、荧光定量PCR和Western检测As2O3处理前后SHP-1基因启动子过甲基化及其mRNA和蛋白表达状况、c-kit蛋白表达变化.MTT法检测细胞存活率.流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:As2O3能逆转SHP-1基因启动子甲基化,使T2细胞SHP-1 mRNA和蛋白重新表达,同时c-kit蛋白表达呈下降趋势;As2O3明显抑制T2细胞的增殖,随浓度增加及作用时间延长,其增殖抑制效应增加(P<0.05);2.5μmol/L浓度的As2O3作用T2细胞t,2,3d细胞增殖抑制率(9.8%,20.3%,47.5%)明显低于联合作用组(11.0%,36.7%.61.0%).As2O3可使T2细胞凋亡率增加,且随作用时间延长和浓度增加,凋亡细胞逐渐增多(P<0.05),联合作用组细胞凋亡率(1 d:17.3%;2 d:37.9%;3 d:67.9%)明显高于2.5 μmol/L As2O3单独作用组(6.1%,26.5%,50.9%).结论:As2O3能去除T2细胞中SHP-1基因甲基化,使其重新表达,并可能通过抑制c-kit受体及其信号转导路径的活化而抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

三氧化二砷对白血病HL-60细胞株分化影响的研究

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)治疗白血病的作用机制.方法:1)用流式细胞仅检测细胞膜上的CD11b的表达和细胞凋亡率.2)用RT-PCR方法检测c-myc基因在mRNA水平上的表达.结果:2.5 μmol/LAs2O3处理HL-60细胞90 h后,细胞分化的标志性细胞膜抗原CD11b表达明显升高,由(14.5±2.1)%升高到(35.4±5.7)%,P<0.05;NBT阳性细胞由(10.0±2.1)%升高到(31.25±3.4)%(P<0.05),同时c-myc基因在mRNA水平也明显降低.结论:As2O3通过降低c-myc基因表达及上调细胞分化抗原CD11b表达,从而促进HL-60细胞分化.     

三氧化二砷联合顺铂对人类非小细胞肺癌细胞生长及凋亡抑制基因XIAP表达的影响

背景与目的 在中国肺癌居各种肿瘤之首位,寻求肺癌有效的治疗方法已成为人们关注的热点.本研究探讨三氧化二砷(As2O3)注射液与顺铂(DDP)联合应用对人类非小细胞肺癌细胞的生长、细胞凋亡及其X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察As2O3注射液和/或DDP对人类非小细胞肺癌细胞H460生长的影响;应用流式细胞术观察As2O3注射液和/或DDP处理前后细胞凋亡率;应用半定量RT-PCR检测As2O3注射液和/或DDP处理前后H460细胞中XIAP mRNA表达变化.结果 与单药作用相比,As2O3与DDP联合应用可显著抑制H460的增殖,增加细胞的凋亡率,并对细胞XIAP mRNA表达有增强抑制的作用.结论 与单药相比较,As2O3注射液联合DDP能够明显提高非小细胞肺癌对化疗的敏感性,其机制可能与抑制非小细胞肺癌的凋亡抑制蛋白XIAP的表达有关.     

Amyloid precursor-like protein 2 suppresses irradiation-induced apoptosis in Ewing sarcoma cells and is elevated in immune-evasive Ewing sarcoma cells

Despite surgery, chemotherapy, and radiotherapy treatments, the children, adolescents, and young adults who are diagnosed with metastasized Ewing sarcoma face a dismal prognosis. Amyloid precursor-like protein 2 (APLP2) has recently been implicated in the survival of cancer cells and in our current study, APLP2’s contribution to the survival of Ewing sarcoma cells was examined. APLP2 was readily detected in all Ewing sarcoma cell lines analyzed by western blotting, with the TC71 Ewing sarcoma cells expressing the lowest level of APLP2 among the lines. While irradiation induces apoptosis in TC71 Ewing sarcoma cells (as we determined by quantifying the proportion of cells in the sub-G₁ population), transfection of additional APLP2 into TC71 decreased irradiation-induced apoptosis. Consistent with these findings, in parallel studies, we noted that isolates of the TC71 cell line that survived co-culture with lymphokine-activated killer (LAK) cells (which kill by inducing apoptosis in target cells) displayed increased expression of APLP2, in addition to smaller sub-G₁ cell populations after irradiation. Together, these findings suggest that APLP2 lowers the sensitivity of Ewing sarcoma cells to radiotherapy-induced apoptosis and that APLP2 expression is increased in Ewing sarcoma cells able to survive exposure to cytotoxic immune cells.     

三氧化二砷对尤文肉瘤细胞迁移和侵袭能力抑制作用的体外研究

 目的　研究三氧化二砷在体外对尤文肉瘤细胞系迁移和侵袭能力的抑制作用 。方法　通过噻唑蓝（MTT）实验选择对尤文肉瘤细胞系（A-673、RD-ES）无毒性的三氧化二砷浓度（＜2 μmol／L）后,Transwell迁移和侵袭实验检测三氧化二砷作用下尤文肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。Western blot实验及明胶酶谱实验检测PI3K-AKT通路相关作用蛋白及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达变化。结果　迁移和侵袭穿过Transwell基底膜的尤文肉瘤细胞的数量随着三氧化二砷浓度的增加而逐渐降低,经不同浓度三氧化二砷处理过的A-673迁移平均数量分别占未处理组的54.3 %、49.0 %和17.0 %,差异有统计学意义（F＝112.78,P＜0.01）,在侵袭实验中分别为52.7 %、32.3 %和10.3 %,差异有统计学意义（F＝183.76,P＜0.01）;经过不同浓度三氧化二砷处理后的RD-ES细胞迁移平均数量分别占未处理组的46.0 %、39.0 %和8.0 %,差异有统计学意义（F＝408.25,P＜0.01）,在侵袭实验中分别为58.7 %、22.3 %和9.0 %,差异有统计学意义（F＝373.25,P＜0.01）。PI3K-AKT通路相关蛋白和MMP-9表达水平下降。结论　低浓度三氧化二砷可以通过下调PI3K-AKT信号通路的表达来抑制尤文肉瘤细胞系的转移能力。     

Bcl-2反义核酸增强三氧化二砷诱导NCI-H69肺癌细胞凋亡

目的 :探讨Bcl 2反义核酸对三氧化二砷 (As2 O3 )诱导NCI H6 9肺癌细胞株凋亡的影响。方法 :合成Bcl 2反义核酸 (ASON) ,导入NCI H6 9肺癌细胞。Western blot法检测Bcl 2蛋白的表达 ;FTIC TUNEL流式细胞仪检测导入ASON的NCI H6 9肺癌细胞凋亡的变化 ;Western blot法检测As2 O3 作用后多聚ADP核糖聚合酶 (PARP)裂解片段。结果 :1)导入Bcl 2反义核酸后NCI H6 9肺癌细胞 (ASON -NCI H6 9)的Bcl 2基因表达受抑制 ,Bcl 2蛋白的合成减少 ;2 )随As2 O3 浓度增加 ,肺癌细胞的凋亡指数逐渐上升 ,ASON NCI H6 9细胞凋亡指数明显高于NCI H6 9细胞 ;3)As2 O3 诱导后ASON NCI H6 9肺癌细胞PARP的89KD裂解片段检测呈强阳性 ,NCI H6 9肺癌细胞则呈弱阳性。结论 :三氧化二砷可诱导肺癌细胞株NCI H6 9凋亡 ;Bcl 2反义核酸通过阻断Bcl 2基因表达 ,增强了As2 O3 诱导NCI H6 9细胞凋亡     

Suicide gene therapy of sarcoma cell lines using recombinant adeno-associated virus 2 vectors

Soft-tissue sarcomas are mesenchymal tumors that respond poorly to systemic chemotherapy. Suicide gene therapy may be an alternative treatment strategy. Here we show a high susceptibility of human sarcoma cell lines for recombinant adeno-associated virus 2 (rAAV-2) suicide vectors: connective tissue sarcoma (HS-1), fibrosarcoma (HT-1080), Ewing sarcoma (RD-ES), Askin tumor (SK-N-MC), rhabdomyosarcoma (A-204) and soft-tissue sarcoma (WSKL-1). Several vectors containing the thymidine kinase (TK) gene under the control of either the cytomegalovirus promoter or the elongation-factor 1 alpha (EF1alpha) promoter were cloned and tested. Higher expression levels of the transgene were observed in the sarcoma lines when using the EF1alpha-suicide gene-containing vectors. A complete eradication of rAAV-2-EF1alpha-TK/eGFP (TK/enhanced green fluorescent protein fusion gene)-transduced tumor cells was shown following exposure to ganciclovir (2.5 microg/ml) in vitro, while at this dose level > 90% of mock-transduced tumor cells survived. Xenotransplantation tumor models (intraperitoneal, subcutaneous) for the human sarcoma cell line HS-1 were established in nonobese diabetic/severe-combined immunodeficient mice. Mice transplanted with rAAV-2-EF1alpha-TK/eGFP-transduced and ganciclovir-exposed tumor cells survived > 5 months while in the nontransduced group all mice had died approximately 1 month after inoculation. These data hold promise for further development of rAAV-2-based suicide gene therapy of sarcomas.     

三氧化二砷诱导人鼻咽癌细胞凋亡的实验研究

目的 :研究三氧化二砷 (As2 O3 )体外抑制人鼻咽癌细胞株 (CNE1)增殖及诱导凋亡的作用。方法 :以不同浓度的As2 O3 处理CNE1,用四甲基噻唑蓝 (MTT)法测定细胞增殖情况 ,细胞染色方法观察细胞凋亡的形态 ,原位末端标记法 (TUNEL)检测凋亡细胞 ,流式细胞仪检测细胞的DNA含量。结果 :As2 O3 明显抑制人鼻咽癌细胞株CNE1细胞的增殖 ,其抑瘤作用优于顺铂 (DDP)和 5 -氟尿嘧啶 (5 FU)。As2 O3 作用于细胞后 ,可见典型凋亡细胞的形态学改变 :细胞核固缩 ,染色质凝集 ,核碎裂 ,凋亡小体形成等。流式细胞仪DNA线条图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰”。结论 :As2 O3 可明显抑制人鼻咽癌细胞株CNE1的生长和促进细胞凋亡的作用     

Expression and reversion of drug resistance-and apoptosis-related genes of a DDP-resistant lung adenocarcinoma cell line

Resistanceofcancercellstocytotoxicchemotherapyisacommonprobleminpatientswithcancerandamajorobstacletoeffectivetreatmentofdisseminatedneoplasm.Severalmolecularmechanismshavebeenassociatedwithmultidrugresistance(MDR)inexperimentaltumormodels.Theseincludel)enhancedeffluxofdrugbytransporterproteinssuchasp--glycoprotein(Pgp),multidrugresistance-associatedprotein(MRP)andhumanmajorvaultprotein(LRP)whichmightplayanimportantroleinvesicularsequestrationofdrug;['3]2)alterationsofdrugtargetssuchasDNA…