抗恶性疟单抗独特型决定簇之第二单克隆抗体的制备和鉴定

以分泌抗恶性疟红内期抗体的小鼠杂交瘤细胞系94D1诱生的腹水,通过Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化IgG,并以此作为免疫原皮下多点免疫Wistar大鼠。加强免疫后3天取脾与小鼠SP~2/0瘤细胞进行异种间的细胞融合,经间接ELISA法检测筛选和5次克隆化,最终得到一株生长稳定、连续分泌特异抗体的异种杂交瘤细胞系41RF5。经过多次冷冻和复苏以及体外连续传代培养16个月,其稳定性与小鼠×小鼠杂交瘤细胞相近。选择8株单抗和SP2/0IgG作为包被抗原,用间接ELISA法对41RF5特异性进行鉴定.结果显示,41RF5单抗只与94D1呈阳性反应,与其余各种包被抗原均呈阴性反应,表明41RF5具有良好的抗94D1单抗独特型决定簇的特异性。41RF5培养上清中特异的抗体效价为1:1280。     

5株抗恶性疟McAb的免疫荧光特性及其靶抗原鉴定

本文观察了5株抗恶性疟McAb的免疫荧光特性,并对其抗原进行了鉴定。结果表明5株McAb主要与恶性疟原虫红内期发育晚期虫体的表面膜抗原发生免疫反应,免疫荧光图象为明亮的点状、均匀片状和蜂窝状。它们在对靶抗原的识别上与免疫荧光的特点呈现一致性,主要能识别恶性疟原虫红内期发育晚期虫体的~(125)Ⅰ-表面标记抗原,其中McAbs 93A_3、94B_5、92D_4和93D_4主要识别分子量为125、115、83、74和67KDa的表面抗原,而McAb94D_1则主要识别分子量为200和19KDa的抗原。     

定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能

[目的]制备无补体结合功能的免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体,用于重症肌无力的特异性免疫治疗.[方法]应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637的重链CH 2区的第322位氨基酸进行K 322 A突变,获得的突变型抗体IgG 637/K 322 A基因经转化大肠杆菌XL 1-Blue进行增殖,测定序列证实为突变序列,转染哺乳类细胞CHO-k 1进行表达,其产物经酶联免疫吸附试验检测与补体C 1 q的结合活性.[结果]突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637/K 322 A不能与补体C 1 q结合,而对照抗体IgG 637可与补体结合.[结论]经定点突变,成功地获得了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.     

恶性疟原虫保护性抗原的鉴定和纯化

用~(125)Ⅰ—乳过氧化物酶法标记恶件疟原虫裂殖体(子),TritonX—100提取疟原虫表面标记抗原。抗恶性疟单克隆抗体9_4D_1与上述恶性症原虫膜抗原提取物作免疫沉淀分析,并用单克隆抗体9_4D_1制备免疫吸附剂,通过亲和层析自恶性疟原虫提取物中分离纯化相应的靶抗原。结果表明,免疫沉淀的靶抗原分子量为55kd,48kd和25kd的多肽,与亲和层析纯化出的靶抗原基本一致.     

人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。　方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体。　结果 :获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株。该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合 ,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合。　结论 :利用重组人CTLA4Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体。     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠中的免疫特性

目的:探讨恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠(BALB/ca、C57BL/6J、C3H/He、DBA/2J及昆明种)中的免疫原性和免疫反应特性.方法:以ISA720为佐剂,PfCP-2.9抗原皮下免疫5种品系小鼠3次,间隔3周.以ELISA检测免疫血清中特异性抗体的动态变化、IgG抗体亚型及对融合抗原各组分的抗体水平,以间接荧光抗体实验分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况.结果:5种品系小鼠均能产生针对PfCP-2.9的免疫应答,3次免疫后血清中特异性抗体滴度达105以上.PfCP-2.9所诱生的免疫血清不但能识别MSP1-19和AMA-1(Ⅲ)两个主要片段,而且能识别恶性疟原虫天然抗原.所诱导的4种IgG抗体亚型中,IgG1和IgG2a是免疫血清中主要的抗体类型.但特异性抗体水平及抗体亚型分布因遗传背景不同而异.结论:融合蛋白PfCP-2.9在5种不同品系小鼠中具有强的免疫原性,其抗体能识别疟原虫天然蛋白.     

戊型肝炎IgG抗体检测方法的建立

为建立一种简便、快速诊断戊型肝炎病毒血清抗体的检测方法,以基因工程HEVORF2区重组蛋白抗原和人工会成HEVORF3区合成多肽抗原混合作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的单克隆抗人IgG抗体为第二抗体,建立了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中HEVIgG抗体技术。检测中国药品生物制品检定所《检测抗HEV抗体国家参考品》全套血清盘：特异性参比品30份,全部为阴性;阳性参比品10份,全部为阳性;精密性参比品,CV（n＝10）＜15％。17例非甲、乙、丙肝炎患者,黄殖出现后4个月内,HEVIgG抗体检出率为100％。普通人群HEVIgG抗体检出率为1％～2％。表明该方法检测HEVIgG抗体,特异性强、敏感性高、操作简便快速,适用于临床对戊型肝炎的诊断和流行病学调查。     

抗hnRNP B1单克隆抗体的制备与鉴定

目的　建立分泌抗不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hn RNP) B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对分泌的单克隆抗体进行免疫学鉴定。方法　用人工合成的19肽hn RNP B1作为免疫原,采用皮下多点注射及腹腔注射方法免疫BAL B/ c小鼠,取其脾细胞与SP2 / 0小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞采用间接EL ISA法筛选。结果　获得稳定分泌抗hn RNP B1单克隆抗体的杂交瘤细胞2株。EL ISA法检测腹水效价为1∶1.8×10 5,免疫组织化学染色法显示该单克隆抗体特异性强。结论　成功构建hn RNP B1单克隆抗体抗体杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体对肺癌的诊断具有较好的特异性。     

Identification of Target Antigens of Asexual Blood Stages of Plasmodium falciparum

Seven monoclonal antibodies (McAbs) specific for Plasmodium falciparum (Pf), humanimmune sera of three individuals, two adults and one child, living in a malaria endemic area inHainan Island of China and immune sera of BALB/c mice immunized with the erythrocytic stages ofPF were used to identify the target antigens of asexual blood stages of Pf. The ~(125)I-labeled surfaceantigens with apparent molecular weights of 125, 115, 83, 74 and 67 KDa were mainly recognizedby McAbs 93A3, 94B5, 92D4 and 93D4, but the ~(125)I-labeled surface antigens of 200 and 19 KDawere recognized by McAb 94Dl alone. In addition, the ~(35)S-methionine- labeled target antigens of183, 125, 83 and 55 KDa were also recognized by McAbs 93A3, 94B5 and 94C3. The McAb21E3 against the culture supernatant antigen of Pf only recognized the antigen of 125 KDa labeledwith ~(15)S-methionine. The human immune sera from the adulst living in a malaria endemic area andmouse immune sera not only immunoprecipitated the target antigens which were recognized by theMcAbs but also immunoprecipitated the polypeptides of 140, 100 and some lower - molecularweight. But these target antigens recognized by McAbs, adult immune sera of and mouse immunesera could not be immunoprecipitated by human immune serum of the child with a primary infec-tion. With the antigen competition assay, the unlabeled antigens of Pf could strongly inhibit the im-mune reaction between the McAbs and the ~(125)I-labeled antigens of Pf. It suggested that the antigensrecognized by McAbs and polyvalent immune sera were specific target antigens.     

分泌抗体的杂交瘤细胞株的制备

目的应用杂交瘤技术制备出分泌抗肺癌抗体杂交瘤细胞株,为肺癌的早期诊断和免疫治疗提供可能靶点．方法用肺癌细胞株作免疫原免疫健康BALB／C小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度抗肺癌抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA和检测单抗体的特异性,双抗体夹心法测定免疫球蛋白同种型．结果通过细胞融合,筛选出2株持续分泌抗肺癌抗体的杂交瘤细胞株C5、B8,其分泌的抗体为IgM亚类,κ亚型,并和肺癌细胞发生特异性反应．结论成功完成细胞融合,制备了分泌抗体的杂交瘤细胞株．     

联合检测类风湿因子、抗环瓜氨酸多肽抗体和抗角蛋白抗体在类风湿关节炎诊断中的价值

目的：研究类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体和抗角蛋白抗体（AKA）联合检测在类风湿关节炎（RA）诊断中的价值。方法：分别应用免疫比浊法、ELISA法和间接免疫荧光染色法检测150例RA患者和75例非RA患者血清中的RF、抗CCP抗体和AKA水平,并分析三种抗体在RA诊断中的价值。结果：单一抗体检测中敏感性以RF最高（82．O％）,特异性以AKA最高（93．33％）,阳性预测值以AKA最高（94．05％）,阴性预测值以RF最高（67．47％）;联合检测中敏感性以RF＋抗CCP抗体最高（43．33％）,特异性以RF＋抗CCP＋AKA最高（100％）,阳性预测值以RF＋抗CCP＋AKA最高（100％）,阴性预测值以RF＋抗CCP抗体最高（44．81％）。结论：RF诊断RA的灵敏性最高,但特异性以RF＋抗CCP＋AKA最高,三者联合检测可以提高对RA的诊断价值     

甲型H1N1流感病毒单克隆抗体的制备及其功能研究

目的获得分泌特异性抗H1N1亚型（A/California/04/2009）猪流感病毒单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞并探索其分泌抗体的功能。方法以表达血凝素蛋白H1（A/California/04/2009）的DNA疫苗为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接ELISA筛选分泌抗H1N1亚型（A/California/04/2009）抗体的杂交瘤细胞,进一步亚克隆筛选单一、稳定分泌其抗体的细胞株。结果获得能稳定分泌抗流感病毒血凝素H1亚型的单克隆抗体杂交瘤4株,分别命名为41H2、68E5、41E7和26D11。其中68E5、41E7和26D11为IgG1（K）,41H2为IgG2a（K）。运用Lenti-pseudovirus方法测试显示,26D11可识别结构性位点,具有H1N1（A/California/04/2009）专一性较强的中和能力,是中和性抗体。Western blot检测显示,41H2和41E7为阳性,识别线性位点。特异性实验表明,26D11只与H1（A/California/04/2009）亚型流感病毒发生特异性反应,而不与其他16个HA亚型流感病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论用单克隆抗体杂交瘤技术成功制备了甲型H1N1流感病毒的单克隆抗体。     

丙型肝炎患者抗-NS5抗体与α-干扰素疗效关系的研究

目的探讨丙型肝炎患者IgG抗-NS5抗体与α-干扰素疗效的关系.方法以重组HCV抗原及NS3、NS5区段多肽作为抗原,以EHSA法检测丙型肝炎患者α-干扰素治疗前血清IgG抗-NS3、抗-NS5、抗-HCV抗体及其滴度.结果α-干扰素治疗有效组的抗-NS5抗体的阳性率为80%(8/10),无效组为20%(2/10),两组比较有显著差异(P＜0.05);有效组抗-NS5抗体滴度显著性高于无效组(P＜0.05);有效组和无效组抗-NS3、抗-HCV抗体阳性率及抗体的滴度无明显差异(P＞0.05).结论治疗前血清IgG抗-NS5抗体可以作为α-干扰素疗效的一个预测指标.     

PDGFR单克隆抗体的制备和鉴定

目的 通过谷胱甘肽转硫酶偶联的血小板衍生因子受体氮端的融合蛋白(GST-PDGFR-N)制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-PDGFR-N融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗PDGFR的单克隆抗体,用间接ELISA、Western blot、免疫组化等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得两株能稳定分泌抗PDGFR单克隆抗体的细胞3B12F5和3C6H7C11,亚类鉴定两种单抗均为IgG1.间接ELISA法测定两株细胞腹水抗体的效价分别为1:102400为和1:25600.Western blot法显示PDGFR单克隆抗体特异性地识别免疫原和胶质瘤细胞株U251中的抗原成分.细胞免疫组化显示此单抗可以特异的识别胶质瘤细胞株U251和膀胱癌细胞株BIU87中表达的PDGFR抗原.结论 成功制备PDGFR单克隆抗体,为研究PDGFR的表达情况和临床检测提供了一个有用的工具.     

恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备

目的 通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8（PfAtg8）基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8（PfAtg8）的多克隆抗体,并验证其效价。 方法 体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行效价验证。 结果 PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100 000。结论 成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。     

抗人子宫颈癌单克隆抗体的制备及其特征的初步研究

应用单克隆抗体技术制备具有未经纯化的肿瘤细胞抗原中某种特异或相对特异抗原的单克隆抗体,这对肿瘤免疫的理论研究和实际应用均有重要意义。关于人宫颈癌单克隆抗体国外已有报道并已有人—人细胞融合产生的抗宫颈癌单克隆抗体,但国内尚无报道.本研究以人子宫颈癌细胞株CC-801为抗原免疫小鼠,制备出抗人子宫颈癌杂交瘤细胞株CEB9,并对其分泌的单克隆抗体进行了初步的鉴定.     

乙型肝炎表面抗原亚型决定簇“a”单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本研究中用纯化乙型肝炎表面抗原(HBsAg)“adr”免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合。以ELISA和RIA法检测抗体,获得9孔抗-HBs阳性的杂交瘤,经过5次有限稀释,建立4株单克隆细胞。选其中一株SH_1D_9杂交瘤细胞进行体外连续传代,接种小鼠腹腔,抗-HBs滴度在组织培养上清液中为1∶10,000,小鼠腹水为1∶50,000。经特异性、稳定性鉴定,证明其抗-HBs对HBsAg具有持续的和良好的亲和性,正常人血清无交叉反应,经亚型及Ig亚类鉴定为抗-HBs“a”亚型决定簇,IgG型单克隆抗体,杂交瘤细胞染色体平均为104个。本文并对HBsAg免疫Balb/c小鼠采取的不同方案及建立单克隆抗体杂交瘤细胞株的实验方法加以讨论。     

ATP5B原核表达和单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备高纯度ATP合酶β亚基（ATP5B）单克隆抗体并进行鉴定,为其后续研究奠定基础。方法：应用PCR法扩增ATP5B基因,克隆入pET28a载体中并转入大肠杆菌BL21（DE3）。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达并用镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白纯度。用纯化的融合蛋白免疫3只雌性Balb/C小鼠,取小鼠尾静脉血,间接酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血清中ATP5B抗体效价。取血清效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞混合培养建立杂交瘤细胞,采用间接ELISA法筛选融合细胞并行单克隆化培养,对阳性细胞进行核型分析。取12周龄Balb/C小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞制备腹水模型,收集腹水,间接ELISA法检测效价,SDS-PAGE检测抗体纯度,应用ELISA法检测抗体亚型。结果：PCR扩增后得到1 455bp的特异性条带,连接pET28a空载体获得重组pET28a/ATP5B载体。IPTG诱导转化的菌液表达目的蛋白,SDS-PAGE检测,在相对分子质量为51 000处出现明显的诱导蛋白条带。间接ELISA法检测免疫小鼠静脉血,血清效价最高达1：64 000。杂交瘤细胞染色体核型分析,染色体总数约为骨髓瘤细胞与正常小鼠脾细胞之和。采用杂交瘤细胞株制备小鼠腹水,抗体最高效价为1：240 000,杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型为IgG1。结论：通过克隆、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗ATP5B蛋白单克隆抗体。     

EB病毒GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备EB病毒GST—Rta150融合蛋白的单克隆抗体并鉴定其特性．方法取经GST-Rta150融合蛋白免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,接种杂交瘤细胞至小鼠腹腔,收集腹水并纯化。制备的单克隆抗体以琼脂双向扩散法鉴定抗体类及亚类．间接ELISA法测定抗体的效价,Western-blot检测抗体的特异性。结果获得一株稳定分泌抗GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A9,细胞培养上清效价为10^-3,腹水效价为10^-5,纯化的抗体效价为10^-6．经鉴定GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的亚类为IgGl。Western-blot结果显示此单克隆抗体能特异结合GST-Rta150融合蛋白．将杂交瘤细胞株在液氮中冻存3个月后复苏,其分泌的单克隆抗体效价不变。结论通过上述方法制备出来的单克隆抗体特异性强,稳定性好,为研究EB病毒立即早期基因产物Rta蛋白以及EB病毒相关疾病的诊断和治疗奠定了基础。