卡介苗热休克蛋白16.3基因的克隆与原核表达

目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达.     

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用Ｔ７ＤＮＡ聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白７０（ｈｓｐ７０）基因的启动子序列和卡介苗（ＢＣＧ）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的ｈｓｐ７０启动子序列为人结核杆菌ｈｓｐ７０编码基因起始密码（ＡＴＧ）上游１５０个脱氧核苷酸，其中在ＡＴＧ上游－１２￣－８核苷酸处有核糖体结合位点（ＳＤ序列）ＧＧＡＧＧ，在ＲＮＡ聚合酶的结合     

BCG 65KD热休克蛋白的纯化

目的：研究卡介苗（ＢＣＧ）６５ＫＤ热休克蛋白的提纯方法。方法：ＢＣＧ经３７℃恒温振荡培养两周，４２℃热休克处理２ｈ，培养液经离心、抽滤、盐析沉淀、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离、电泳洗脱等步骤纯化。结果：提纯产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，其电泳区带在６５ＫＤ位置，经抑制试验表明具有较高抗原活性。结论：流程方法简单、实用，有助于对ＩＤＤＭ的诊断及其深入研究。     

替普瑞酮对类固醇性溃疡大鼠胃黏膜热休克蛋白70和c-fos表达的影响

目的 观察替普瑞酮对类固醇性溃疡大鼠胃黏膜热休克蛋白(HSP)70和c-fos表达的影响,探讨其保护作用和机制.方法 50只雄性SD大鼠随机分为空白组、实验组、低剂量替普瑞酮组、中剂量替普瑞酮组和高剂量替普瑞酮组,每组10只.采用泼尼松龙皮下注射制备大鼠胃黏膜损伤模型,低、中、高剂量组替普瑞酮的剂量分别为50、100、200 ms/kg,给药7 d,每天1次.观察胃黏膜的病理变化,计算溃疡指数,免疫组化方法检测胃黏膜c-fos水平,RT-PCR方法检测大鼠胃黏膜HSP70 mRNA的表达.结果 类固醇激素能引起胃黏膜显著出血性损伤,实验组大鼠溃疡指数中位数为44.5,明显高于空白组(0,P＜0.01),实验组大鼠胃黏膜c-fos染色积分为42±8,高于空白组(22±3,P＜0.01),HSP70 mRNA的相对表达量高于空白组(0.22±0.03 vs 0.04±0.02,P＜0.01).低、中、高剂量替普瑞酮组的溃疡指数中位数分别为32.5,23.0,23.0,均明显低于实验组(均P＜0.01),大鼠胃黏膜c-fos染色积分分别为34±2,30±5,25±3,均明显低于实验组42±8(均P＜0.01);HSP70 mRNA的相对表达量分别为0.36±0.05,0.41±0.09,0.49±0.05,均明显高于实验组(0.22±0.03,均P＜0.01).结论 替普瑞酮对类固醇致胃黏膜损伤具有一定的保护作用,其机制可能与诱导HSP表达,抑制胃黏膜c-fos的表达有关.     

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。     

双歧杆菌对实验性大鼠结肠炎中热休克蛋白70的影响

目的 观察实验性结肠炎热休克蛋白(HSP70) 、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达变化并研究双歧杆菌对其表达的影响.方法 40只SD大鼠随机均分为正常组、模型组、5-ASA组及双歧杆菌组.2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇制备大鼠结肠炎模型.5-ASA组给予奥沙拉秦钠胶囊100 m...     

幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌热休克蛋白60（Hsp60)的候选菌株并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增Hsp60基因，将其定向插入pET-22b( )载体，在BL21（DE3）大肠杆菌中表达并通过动物实验研究其免疫原性。结果 克隆的Hsp60基因序列与Genbank公布的一致，Hsp60重组蛋白表达量占菌体总蛋白的27.2%，并可被幽门螺杆菌感染者血清所识别，用其免疫小鼠可产生抗该重组蛋白的抗体。结论 Hsp60有可能成为一种有效的疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

人胃癌细胞热耐受性与热休克蛋白70的关系

目的观察４１℃６０ｍｉｎ温热作用后人胃癌细胞ＢＧＣ－８２３热耐受性和ＨＳＰ７０表达的变化。方法４１℃６０ｍｉｎ温热作用后不同时间，测定细胞４３℃６０ｍｉｎ温热再作用的克隆形成率，并进行细胞ＨＳＰ７０免疫组化分析。结果①４１℃诱导后即时细胞已形成较高的热耐受性，４ｈ有所降低，８ｈ达到高峰（Ｐ＜０．０１），２４ｈ恢复近原有水平；②ＢＧＣ－８２３细胞常温下表达少量ＨＳＰ７０，并且主要分布于胞浆内；４１℃诱导后即时ＨＳＰ７０的表达量并未增加，但核内染色加深（Ｐ＜０．０１）；诱导后４ｈ开始增加（Ｐ＜０．０１），８～１６ｈ达到高峰，并主要在核内（Ｐ＜０．０１）；２４ｈ衰减至近原有水平（Ｐ＞０．０５）。结论４１℃温热诱导后ＢＧＣ－８２３细胞形成的热耐受性包括两部分：一部分为即时、非ＨＳＰ７０依赖的，另一部分为ＨＳＰ７０依赖的热耐受性。     

热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础.方法 采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAd-HSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAdvHSP.收获病毒进行滴度鉴定, RT-PCR方法检测目的 基因在Hela细胞的转录表达.结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒;荧光显微镜下可观察到GFP的表达,收获病毒的滴度为3.2×1012 U/L.结论 成功构建pAd-HSP70重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录.     

热休克蛋白70的诱导表达对豚鼠耳蜗听功能的影响

OBJECTIVE: To investigate the effect of evoked heat shock protein 70 (HSP70) expression on the hearing function of the cochlea in guinea pigs. METHODS: Guinea pigs were divided into pre-exposure group (pre-treated with white noise exposure at 100 dB SPL for 45 min) and none pre-exposure group. Auditory brainstem response (ABR) thresholds were recorded at 12, 60 and 108 h after the animals in both groups were exposed to loud white noise (125 dB SPL, 90 min). RESULTS: HSP70 expression was evoked by pre-treatment with white noise (100 dB SPL, 45 min). There was no significant difference of ABR thresholds between the 2 groups (P>0.05) at 12 h after exposure to loud noise, while ABR thresholds became lower in pre-exposure group than in none pre-exposure group (P<0.01) at both 60 and 108 h. In the pre-exposure group, ABR thresholds at 108 h were significantly lower than that measured at 60 h (P<0.05), but which was not the case in none pre-exposure group. CONCLUSION: HSP70 expression induced by pre-exposure to noise protects the hearing function of the cochlea in guinea pigs.     

HSP70在肾脏缺血预适应中的作用

目的 探讨缺血预适应对肾脏HSP70表达的影响.方法 大鼠3个循环的2min缺血加5min再灌注缺血预适应模型,免疫组化观察在体肾脏HSP70的表达.结果 缺血预适应后肾脏HSP70的表达显著升高.结论 缺血预适应可升高缺血再灌注损伤后肾脏HSP70的表达,改善肾功能.     

人肺腺癌A549细胞株中HSP70多肽复合物的分离与纯化

目的:探讨肺腺癌细胞中热休克蛋白70多肽复合物分离及纯化的方法.方法:采用裂解液裂解、超声破碎、ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析方法,从体外培养的热休克(43℃)处理后的人肺腺癌细胞株A549中分离纯化HSP70多肽复合物,通过SDS-PAGE电泳、Western-blot检测获得蛋白.结果:获得蛋白的相对分子质量约为70 000,能与抗HSP70特异单抗结合.结论:采用ConA-Sepharose亲和层析、ADP-agarose亲和层析结合DEAE阴离子交换层析从肺腺癌细胞株A549中可获得高纯度的HSP70多肽复合物,为进一步研究以HSP70多肽复合物为基础的肺癌免疫治疗提供了依据.     

亚低温对大鼠弥漫性脑损伤后海马CA3区HSP70表达及细胞凋亡的影响

目的观察亚低温对大鼠弥漫性脑损伤(DBI)后海马CA3区HSP70在蛋白质和mRNA水平表达及细胞凋亡的影响,探讨亚低温脑保护的分子生物机制.方法将大鼠随机分成空白对照、假手术、单纯DBI和DBI后亚低温治疗4组,按Marmarou氏方法制作大鼠DBI模型,分别采用免疫组化法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及流式细胞仪(FCM),观察各组动物脑海马CA3区HSP70在蛋白质和mRNA水平的表达及细胞凋亡率.结果与对照组相比,大鼠DBI后海马CA3区HSP70表达水平及细胞凋亡率均升高(P＜0.05).亚低温治疗后,大鼠脑海马CA3区HSP70表达水平较单纯DBI组显著增高(P＜0.01),而细胞凋亡率降低(P＜0.05).结论亚低温对创伤性脑损伤的脑保护机制可能与促进HSP70表达并减少神经细胞凋亡有关.     

重组结核病疫苗rBCG-IL-12p70-MPT64免疫原性研究

目的 构建可表达人细胞因子IL-12p70及结核分枝杆菌免疫显性抗原MPT64融合蛋白重组卡介苗,研究其免疫效应,为获取较卡介苗(BCG)更具保护作用的结核病新疫苗奠定基础.方法 采用基因重组技术构建重组卡介苗rBCG-IL-12p70-MPT64(rBCG-IM),将其免疫BALB/c小鼠,分别于免疫后15、30、60及90 d,iELISA检测特异性抗体滴度水平,评价疫苗诱导的体液免疫.XTT检测受特异性抗原刺激后脾淋巴细胞增殖反应,流式细胞术观察CD4+T、CD8+T细胞比例变化,细胞因子检测试剂盒检测IFN-γ的诱生量,评价疫苗诱导的细胞免疫.结果 与BCG相比,重组疫苗rBCG-IM可诱导更强的脾细胞增殖反应、更高的IFN-γ诱生量,以及更高比例的CD4+T、CD8+T细胞.同时,rBCG-IM可诱导产生较BCG更高水平的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度,IgG2a/IgG1比值变化趋势提示该疫苗可诱导Th1型免疫应答.结论 重组卡介苗rBCG-IM可诱导产生较BCG更强、持续时间更长的细胞免疫及体液免疫反应,具有较强的深入研究价值.     

热处理对HeLa细胞增殖、凋亡及HSP70表达的影响

目的:通过不同温度对HeLa细胞的处理,观察细胞的存活率,细胞凋亡以及HSP70蛋白表达的变化。方法:对HeLa细胞进行培养及不同温度的热处理,采用MTT法测定HeLa细胞的存活,通过免疫组化方法检测HeLa细胞HSP70蛋白表达的变化以及DNA ladder观察HeLa细胞的凋亡变化。结果:45℃高温处理组细胞增殖的抑制最强,HSP70蛋白表达量最高,细胞凋亡程度最高,41℃次之,37℃最低。结论:高温可以增强热休克蛋白HSP70的表达,进而促进细胞的存活,抑制细胞凋亡。     

HSP70、HSP90在肾细胞癌中的表达及其临床意义

目的 分析HSPT0、HSP90在肾细胞癌组织中表达的意义.方法 用免疫组化S-P法检测32例肾细胞癌组织标本中HSP70、HSP90的表达情况.结果 肾细胞癌组织中HSP70、HSP90表达阳性率分别为90.6%(29/32)、84.4%(27/32),明显高于正常肾组织,差异有统计学意义(P<0.05);但其表达程度与肾细胞癌临床分期及细胞类型无明显相关性(P>0.05).结论 HSPT0、HSP90高表达在肾细胞癌的发生、发展中具有促进作用.     

鼻咽癌放疗残灶中HSP70/HSP27蛋白的表达

目的：分析鼻咽癌原发组织HSP70/HSP27蛋白表达与放疗残灶的相关性,探讨HSP70/HSP27表达对鼻咽癌放疗残灶的预测价值。方法：应用SP免疫组织化学法检测58例鼻咽癌原发组织HSP70/HSP27热休克蛋白表达,其中规范放疗后有残存癌灶的28例鼻咽癌为实验组,随访5年无癌灶复发的30例为对照病例。结果：HSP70和HSP27在实验组阳性表达率分别为92.9％(26/28)和53.6%(15/28),而在对照组的阳性表达率为53.3％(16/30) 和53.3%(16/30),HSP70阳性表达率在两组间比较有统计学差异(P<0.05),而HSP27阳性表达率在两组间比较无统计学差异(P>0.05);HSP70和HSP27在实验组共同阳性表达率为50.0%(14/28),对照组为16.7%(5/30),两者比较有统计学差异(P<0.05);两者共同阴性表达率在实验组和对照组分别为3.6%(1/28) 和10.0%(3/30),两者相比无统计学差异（P>0.05）。结论：HSP70在鼻咽癌抗放射损伤中可能起重要作用,检测鼻咽癌组织HSP70蛋白表达对预测鼻咽癌放射后癌灶残存可能有重要价值。     

不同灸法对实验性RA家兔关节滑膜组织HSP70表达的影响

目的:观察3种灸法(温和灸、直接灸和隔姜灸)对实验性RA模型的抗炎效应,比较研究不同灸法对实验性RA家兔关节滑膜组织HSP70表达的影响。方法:40只家兔随机分为对照组、RA模型组、温和灸组、直接灸组、隔姜灸组,8只动物/组。注射FCA造模后第7 d开始分别用温和灸、直接灸、隔姜灸3种不同方法施灸家兔"足三里"、"肾俞"2穴,两侧交替进行,治疗1次/d,6 d为1疗程,共计3个疗程。于造模前、造模后7 d及治疗后7、14、21 d测量各组家兔双后肢膝关节周长,采用S-P免疫组化法检测滑膜组织HSP70的含量。结果:温和灸、直接灸和隔姜灸均能明显降低家兔左右膝关节周长(P0.01),隔姜灸作用优于温和灸和直接灸(P0.05);与对照组比较,RA模型组关节滑膜组织HSP70积分光密度值增高(P0.05);与RA模型组比较,各艾灸组滑膜组织HSP70积分光密度值显著增加(P0.01),隔姜灸组较温和灸组、直接灸组增加更为明显(P0.05)。结论:不同灸法对实验性RA均有良好的抗炎效应,以隔姜灸作用更为突出;不同灸法均可诱导实验性RA家兔关节滑膜组织HSP70大量表达,以隔姜灸更为明显。     

热休克蛋白70在肝缺血再灌注中的作用

目的：探讨热休克蛋白70（HSP70）在肝缺血再灌注中的作用。方法：阅读国内外有关文献并进行综述。结果：HSP70对肝缺血再灌注具有保护作用。在细胞接受应激刺激后,HSP70表达丰度最高,因此HSP70最受关注。结论：HSP70是目前发现的具有重要保护作用的一类蛋白质,经缺血预处理等的情况下,可诱导组织细胞大量表达,并可能对肝缺血再灌注损伤产生保护作用。     

热休克蛋白70在卵巢癌组织中的表达及其与雌、孕激素受体的相关性

目的　检测卵巢癌组织中热休克蛋白 70 (heat shock protein- 70 ,HSP70 )、雌激素受体 (estrogenreceptor,ER)、孕激素受体 (progesterone receptor,PR)的表达 ,探讨 HSP70与甾体激素受体之间的关系。方法　采用免疫组化 SP法检测 4 1例卵巢癌、1 1例正常卵巢组织中 HSP70、ER、PR的表达。结果　 4 1例卵巢癌中 HSP70阳性率为 6 8.2 9% (2 8/ 4 1 ) ,明显高于正常组织 (1 8.1 8% ) (P<0 .0 5 ) ,而且 HSP70在低分化卵巢癌中的阳性率明显高于高分化癌 (P<0 .0 5 )。ER阳性 1 9例 (4 6 .34% ) ,PR阳性 2 4例 (5 8.5 4 % )。ER、PR在 HSP70阴性组的表达高于 HSP70阳性组。结论　 HSP70与 PR的表达呈负相关 (P<0 .0 5 )