阳离子聚合物作为基因载体的研究进展

随着对生物材料学、基因组学及药物学等研究的深入,阳离子聚合物材料在基因传递、药物释放的研究中发挥着越来越重要的作用,受到研究者广泛的关注和重视。文中就阳离子聚合物作为基因载体的特点、研究进展和趋势等作一概述。     

聚合物纳米粒子作为抗肿瘤药物载体的应用

聚合物纳米粒子作为抗肿瘤药物载体具有优良的性能和广阔的应用前景,主要表现在其能增溶疏水性抗癌药物,增加抗癌基因药物与蛋白类药物的稳定性和提高基因的转染率,提高药物针对肿瘤的靶向性。聚合物纳米粒子作为抗癌中药的载体将为中药的发展带来巨大机遇。     

偶氮聚合物作为结肠靶向药物载体的研究进展

在人体消化道中,偶氮键仅能被结肠厌氧菌代谢的偶氮还原酶还原在耐断裂,偶氮聚合物可作为潜在的高定位性的结肠靶向药物缓释载体,根据合成方法和最终的释药方式,偶氮聚合物药物释放体系可分为水凝胶体系,胞衣体系和聚合物前药体系。     

两亲性聚合物胶束作为药物载体研究进展

两亲性聚合物胶束属于纳米缔合胶体体系，是一种新型的药物载体，具有很高的内核载药容量和独特的体内分布特征。两亲性聚合物（amphiphilic block copolymers）在结构上可以划分出亲水部分和疏水部分。由于这种独特的化学结构，在水溶液中能形成具有球形内核-外壳结构的共聚物胶束，其疏水部分构成内核，亲水部分形成外壳。内核可以作为疏水性药物的容器，将药物增溶在核心，降低毒副作用，外壳可对药物起保护作用，提高药物的稳定性，并且达到缓释作用，同时通过对胶束的表面修饰可以达到靶向作用。在难溶性药物、大分子药物和基因治疗药物载体给药方面具有独特的优势。在胶体粒子粒径约为10～100nm。     

磷酸胆碱聚合物载TGF—β1反义寡核苷酸转染血管外膜成纤维细胞对TGF—β1的影响

目的观察新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否有效地转染针对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的反义寡核苷酸（AS—ODN）进入到血管外膜成纤维细胞中及转染后对血管外膜成纤维细胞内TGF-β1表达的影响,为MPC30-DEA70,聚合物作为药物基因治疗载体在心血管疾病中的运用奠定基础。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞;应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察MPC30-DEA70／TGF-β1AS-ODN（FAM标记）在细胞内的分布和定位;流式细胞仪（FCM）检测二者的细胞转染效率、荧光强度;免疫印迹实验（Western blot）检测TGF-β1细胞内表达。结果①原代培养的细胞呈纺锤形,多角形或者不规则形,细胞核较大,数量1～2个不等,轮廓清楚,核仁大而明显,呈椭圆形;②激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围;③流式结果显示转染效率及荧光强度随N／P比增加而明显增大;④Western blot结果显示随着N／P比值的增大,TGF-β1的蛋白表达明显下降（P〈0．05）。结论MPC30-DEA70,能够携带TGF-β1-AS—ODN进入离体培养的大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞,并能下调TGF—β1蛋白的表达。     

星形聚合物胶束作为药物载体的研究进展

星形聚合物胶束是一类新型纳米药物载体,它具有独特的分枝结构,所形成的单分子胶束具有理想的粒径和稳定性,可使难溶性药物有效增溶,降低药物毒性,延长体循环时间,提高生物利用度和安全性。星形聚合物胶束作为药物载体具有良好的缓释效果,通过在聚合物表面接枝功能基团可产生靶向释放效果,聚酯结构的星形聚合物还具有良好的降解性能,不在体内蓄积产生毒副作用。本文对星形聚合物的合成及其胶束作为药物载体的理化性质、载药优势、制备方法等的研究进展进行综述。     

新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70转染血管平滑肌细胞的体外研究

目的 探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70（PC聚合物）转染进入体外培养的血管平滑肌细胞（VSMCs）的安全性和有效性.方法 应用ATRP法合成具有高度生物相容性的PC聚合物MPC30-DEA70;植块贴壁法原代培养大鼠VSMCs;MTT法检测PC聚合物与VSMCs的细胞相容性;应用FM及CLSM观察PC聚合物在细胞内的分布和定位;FCM法检测PC聚合物在VSMCs中的转染效率和荧光强度.结果 PC聚合物与原代培养的VSMCs具有较好的细胞相容性,随浓度的增高表现出一定的细胞毒性;PC聚合物可以转染进入VSMCs,大部分分布于细胞质及核周围,少部分可以进入到细胞核内;PC聚合物在VSMCs中具有较高的转染效率和荧光强度,并呈剂量依赖性.结论 新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70可以转染进入血管平滑肌细胞,是一种安全有效的非病毒类药物运输载体.     

磷酸胆碱聚合物载AT1受体反义寡核苷酸对自发性高血压大鼠血压及心血管重构的影响

目的 探讨磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体反义寡核苷酸(AS-ODN)对自发性高血压大鼠(SHR)血压及心血管重构的影响.方法 将MPC30-DEA70(N)与FAM-AS-ODN(P)按不同N/P比值络合后经尾静脉注入SD大鼠体内,未经处理的SD大鼠为对照,3周后观察复合物在全身各组织器官的分布.再将MPC30-DEA70与AT1受体AS-ODN按不同N/P比值络合后经尾静脉注入8周龄SHR大鼠体内,未经处理的SHR大鼠为对照,3周后测量尾动脉压,对主动脉及心肌组织行天狼星红染色,并用Western blot法和RT-PCR法检测AT1受体蛋白及mRNA表达情况.结果 MPC30-DEA70/FAM-AS-ODN复合物能够进入肾脏组织;空白对照组和N/P=1∶0组的尾动脉压持续上升,缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组的尾动脉压较空白对照组明显下降;空白对照组和N/P=1∶0组心肌细胞肥大,主动脉壁增厚,胶原纤维大量沉积,而缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组上述情况较空白对照组明显改善;N/P=10∶1组和N/P=1∶1组AT1a蛋白和mRNA表达较空白对照组显著降低.结论 MPC30-DEA70能够安全有效地进入肾脏各组织,在体内运载AT1受体AS-ODN,下调AT1受体蛋白及其mRNA表达,抑制SHR大鼠血压进展及心血管重构,是一种创新性的非病毒类基因运输载体.     

磷酸胆碱聚合物载AT1受体siRNA对血管内皮细胞AT1受体表达的影响

目的探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体siRNA对血管内皮细胞AT1受体表达的影响。方法应用琼脂糖凝胶电泳表征具有不同N/P比值的MPC30-DEA70与siRNA的复合物;将不同比例的MPC30-DEA70/siRNA基因复合物转染至人脐静脉内皮细胞,应用荧光显微镜(FM)检测其细胞内分布;流式细胞术(FCM)检测转染效率及荧光强度;Western blot法和RT-PCR法检测AT1受体蛋白及mRNA的表达情况。结果不同N/P比值的基因复合物在电泳中可见不同程度的迟滞现象,随正电性增强而显著。FM观察到MPC30-DEA70/siRNA复合物分布在细胞核周围,FCM结果显示随N/P比值的增大,转染效率明显增加,荧光强度也随之增强。RT-PCR法和Western blot法显示随着N/P比值的增大,基因复合物可使AT1受体的mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 MPC30-DEA70可作为AT1受体siRNA的载体转染至血管内皮细胞,下调AT1受体的mRNA及蛋白的表达,提示阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载和运输siRNA,抑制特异基因的表达,是一种有效的非病毒类转基因载体。     

能够代替偶氮聚合物作为结肠靶向药物载体的化学基团研究

我们将结肠细菌对二硫键和硝基键的还原速率与对偶氮类物质的还原速率进行对比。二硫化物和硝基的还原速率与具有相似分子结构的含偶氮基团的物质的还原速率接近。进一步探索了不同硝基化合物对细菌还原的定量构效关系（QSAR）,得到了哈米特关系,其中,系数p=0.553,R2=0.97。从而总结出二硫化物和硝基化合物具有无尽的潜能,它们可用作治疗结肠疾病的药物前体,也可使结肠药物传递系统具有靶向性。     

双嵌段磷酸胆碱基聚合物作为c-myc AS-ODN基因运输载体研究

目的 探讨双嵌段磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70 作为反义寡核苷酸（AS-ODN）运输载体的安全性和有效性.方法 将载体MPC30-DEA70（N）与c-myc AS-ODN（P）在不同N/P比值的条件下复合,应用DNA凝胶电泳法、荧光显微镜、流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法对复合物溶液进行检测,观察复合物在HeLa细胞中的转染情况.结果 c-myc AS-ODN能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大复合物正电性越强;MPC30-DEA70/AS-ODN复合物能够进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着N/P比值增大复合物对细胞的增殖抑制作用显著增强.结论 MPC30-DEA70可以有效负载和运输c-myc AS-ODN,抑制HeLa细胞增殖,是一种新型的、安全有效的非病毒类转基因载体.     

MPC30-DEA70载AMO-miR-146a对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响

目的 阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30-DEA70)负载反义miR-146a寡核苷酸(AMO-miR-146a)转染大鼠颈总动脉球囊损伤处血管平滑肌细胞(VSMC),观察其对血管内膜增生的影响.方法 60只SD大鼠完全随机化分为未损伤组、单纯损伤组、多聚赖氨酸(PLL)组、AMO-miR-146a组、PLL载MPC30-DEA70/AMO-miR-146a复合物(P/M=3:1组和P/M=5:1组),每组10只.通过光学显微镜观察4周后大鼠颈总动脉组织形态学变化,q-PCR法检测miR-146a的表达以及应用Western blot法检测增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)、NFκBp65的表达情况.结果 苏木精-伊红染色,光镜下显示,除未损伤组外,单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组、P/M=3:1组、P/M=5:1组大鼠颈总动脉血管新生内膜有不同程度的增生,而中膜面积无明显改变;与单纯损伤组比较,PLL组、AMO-miR-146a组新生内膜面积差异无统计学意义(P>0.05),P/M=3:1组和P/M=5:1组新生内膜面积明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),后两组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);q-PCR及Western blot检测显示P/M=3:1组和P/M=5:1组miR-146a及目的蛋白PCNA、NFκBp56的表达较未损伤组高,差异有统计学意义(P<0.05),但明显低于单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组,差异有统计学意义(P<0.05),而P/M=3:1组和P/M=5:1组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05);单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 MPC30-DEA70可与AMO-miR-146a络合,借助PLL进入VSMC,有效抑制球囊损伤后VSMC的miRNA-146a的表达,使PCNA、NFκBp56下调,抑制新生内膜增生,防止血管狭窄.     

含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

腺病毒介导人uPA感染大鼠间充质干细胞的体外研究

目的 体外分选与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并用腺病毒介导的人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)体外感染原代MSCs,观察病毒的转导效率及对MSCs增殖的影响. 方法 通过黏附培养分离纯化MSCs,并采用免疫组化DAB显色法鉴定;荧光显微镜检测uPA的转染效率;Western blotting检测uPA在MSCs中的表达;MTT法检测病毒对MSCs增殖的影响. 结果 分选培养的MSCs呈典型的间充质干细胞生长形态,细胞表面标记物CD29和CD90阳性,CD34和CD45阴性;随着病毒感染滴度增高,绿色荧光蛋白(GFP) 的表达率亦呈增高趋势.当感染复数(MOI)＝80且病毒转导72 h后,GFP阳性细胞数占细胞总数的比例达(94.0±1.5)%,可稳定表达7 d以上,且对MSCs的增殖无明显影响.结论 MSCs是一种理想的基因过表达载体,稳定分泌uPA蛋白,可用于肝纤维化的研究.     

腺病毒介导人uPA感染大鼠间充质干细胞的体外研究

目的体外分选与鉴定大鼠骨髓间充质于细胞（MSCs）,并用腺病毒介导的人尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）体外感染原代MSCs,观察病毒的转导效率及对MSCs增殖的影响。方法通过黏附培养分离纯化MSCs,并采用免疫组化DAB显色法鉴定;荧光显微镜检测uPA的转染效率;Western blotting检测uPA在MSCs中的表达;MTT法检测病毒对MSCs增殖的影响。结果分选培养的MSCs呈典型的间充质干细胞生长形态,细胞表面标记物CD29和CD90阳性,CD34和CD45阴性;随着病毒感染滴度增高,绿色荧光蛋白（GFP）的表达率亦呈增高趋势。当感染复数（MOI）=80且病毒转导72h后,GFP阳性细胞数占细胞总数的比例达（94．0&#177;1．5）％,可稳定表达7d以上,且对MSCs的增殖无明显影响。结论MSCs是一种理想的基因过表达载体,稳定分泌uPA蛋白,可用于肝纤维化的研究。     

膜表达热休克蛋白70真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞的转染

目的构建普遍适合性的膜表达热休克蛋白70(HSP70)的真核表达载体,修饰并建立HSP 70表达并结合在细胞膜表面的肿瘤细胞.方法RT-PCR法从人胚肾中获取HSP 70的cDNA,扩增成带酶切位点的目的基因.选择载体pDisplay,将目的基因插入载体多克隆酶位点中.DNA测序证实后,以脂质体转染的方法,将载体转染到黑色素瘤细胞.用G418抗性筛选获得阳性克隆.结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确;目的基因的上游带信号肽序列,下游带跨膜序列.RT-PCR产物电泳、Westem Blotting、激光共聚焦显微镜和流式细胞术证实大量HSP 70表达并结合在转染的黑色素瘤细胞膜表面.结论成功地构建了膜表达HSP 70的真核表达载体;转染到黑色素瘤细胞后,细胞膜表面表达丰富的HSP70.转染细胞可以进一步制备新型瘤苗.     

HSP70对严重烧伤大鼠保护作用的实验研究

目的寻找对严重烧伤早期缺血缺氧性损伤的可行性保护途径.方法构建含HSP70的重组腺病毒载体,股静脉注射该腺病毒载体48 h后,检测大鼠严重烧伤后6 h其血清中内毒素及LDH、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子水平.结果未转染组大鼠严重烧伤后6 h血清中内毒素及检测的细胞因子水平较正常对照组明显升高.静脉注射含HSP70重组腺病毒组大鼠严重烧伤后血清中上述指标的检测水平与未转染组比较明显降低,但仍显著高于正常对照组.结论静脉注射含HSP70重组腺病毒可减轻严重烧伤后大鼠的缺血缺氧性损伤,但不能完全阻断该损伤.     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾脏转染的实验研究

目的:使用FasL重组慢病毒载体通过大鼠肾动脉转染SD大鼠肾脏,观察转染后目的基因表达,为进一步进行移植实验奠定基础。方法:SD大鼠30只随机均分为实验组和对照组,实验组大鼠经肾动脉注入10 ng FasL重组慢病毒载体,对照组注入10 ng空白慢病毒载体,于转染后第3、7、15、25、40天分别采集标本,HE和IHC染色,观察组织形态、测定灰度值,并进行统计学分析。结果:各时段HE染色未见细胞形态改变及炎细胞浸润。IHC染色示转染后表达高峰出现于转染后第15天组。15天组与空白对照组差异有统计学意义(P0.05)。结论:大鼠FasL基因重组慢病毒载体成功转染大鼠肾脏并表达目的基因。     

FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人FoxM1 shRNA重组慢病毒载体,并构建筛选FoxM1敲低的人前列腺癌稳定细胞
株,检测FoxM1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人FoxM1基因的shRNA靶序列,构建到
pHBLV-U6-ZsGreen-Puro 慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观
察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞FoxM1 mRNA水平,经嘌呤霉素
筛选建立FoxM1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中FoxM1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,
流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对FoxM1
shRNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素
抗性筛选建立了FoxM1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中FoxM1蛋白表达明
显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示FoxM1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表
明FoxM1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了FoxM1 shRNA慢病毒载体,建立了FoxM1敲低稳定前列腺
癌细胞株,抑制细胞内FoxM1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。
     

壳聚糖纳米粒作为基因治疗载体的研究进展

壳聚糖是自然界存在的唯一的碱性多糖, 具有许多独特的理化特性和生物学功能如良好的生物相容性、可生物降解、表面带有阳离子、低毒等。因此，用壳聚糖制备的纳米粒作为非病毒基因递送载体，具有良好的发展前景。