构建PSMA shRNA慢病毒载体转染293T细胞后PSMA mRNA和蛋白的表达变化

目的：利用基因工程技术筛选获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP中前列腺癌特异性膜抗原 (PSMA) 表达的shRNA序列，并构建慢病毒载体。观察转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA和蛋白表达的影响。方法：〖HTSS〗根据PSMA基因信息，设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列，组建shRNA对应的4对互补的单链DNA，包括siRNA的正义链和反义链；正义链序列按5向3顺序依次为：酶切位点（BamHⅠ）、干扰序列（19 bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19 bp）、终止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoRⅠ）。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA vector中，转染前列腺癌细胞后，通过real-time PCR检测对PSMA mRNA表达，通过Western blotting检测PSMA蛋白的表达。结果：〖HTSS〗设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好，目的序列位于PSMA（NM_004476）的1207到1226，茎环序列为5-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAA TTCAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3。其对前列腺癌细胞株中PSMA mRNA表达的抑制率为60%，对PSMA蛋白表达的抑制率为86%。转染细胞后，细胞可以稳定低表达PSMA。结论：〖HTSS〗成功获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP PSMA表达的shRNA序列，并构建慢病毒载体，pSIH-PSMA-siRNA2转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA 表达的抑制率为60%，对PSMA蛋白表达的抑制率达86%。为后期研究PSMA在前列腺癌发病中的作用机制以及免疫导向治疗等提供了实验基础。     

RNAi沉默PSMA基因对前列腺癌LNCaP细胞生物学行为的影响

目的：构建LNCaP细胞PSMA基因的shRNA真核表达载体，探讨其对LNCaP细胞中PSMA基因表达的干扰作用。方法:针对PSMA mRNA序列设计合成3对编码shRNA的寡核苷酸链，退火形成双链，连接入含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的pSilencer 2.1-U6-neo真核表达载体，双酶切及测序鉴定。使用脂质体转染的方法将重组质粒导入LNCaP细胞，G418筛选后RT-PCR、Western blotting检测其对PSMA基因干扰作用，并观察对LNCaP细胞生物学行为的影响。结果:经酶切及测序鉴定，成功构建shRNA真核表达载体p-shRNA1,2,3转染LNCaP后，对细胞PSMA mRNA表达抑制率分别为33.15%、9.26%、41.97%，Western blotting结果显示对PSMA蛋白表达的抑制率分别为26.26%、6.47%、40.69%。选择抑制效率较高的p-shRNA3进行体外生长及侵袭力实验，发现干扰后对LNCaP细胞侵袭力增强, 但是对细胞生长影响不大。结论:成功构建了人PSMA基因的RNAi的真核表达载体，并在LNCaP细胞中有效地发挥了对PSMA基因表达的干扰作用，初步发现PSMA在前列腺癌的侵袭中起负向调节作用，为进一步研究PSMA的生物学功能，探索前列腺癌的发病机制奠定一定的实验基础。     

PSMA对JNK/SAPK通路的激活及对前列腺癌细胞凋亡的调控*

 目的：探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)是否通过c-Jun氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)通路对前列腺癌细胞凋亡进行调控。方法：利用前期研究中建立的高效阻断PSMA表达的shRNA慢病毒载体,阻断前列腺癌细胞中PSMA的表达作为实验的干扰组;同时利用构建的PSMA载体转染前列腺癌细胞,促进前列腺癌细胞中PSMA的表达作为阳性实验组;不做任何处理的细胞株作为空白组;加入JNK/SAPK抑制剂SP600125作为阴性对照。Western blotting及免疫细胞化学方法观察各组细胞p-JNK/SAPK的表达量,CCK-8法检测细胞生长情况、流式细胞术检测细胞周期及凋亡。结果：Western blotting及细胞免疫化学提示抑制PSMA表达后,p-JNK/SAPK表达水平下降;增强PSMA表达后p-JNK/SAPK表达水平上升;在SP600125作用下,3组细胞p-JNK/SAPK均处于较低水平,且彼此无明显差异。CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期提示PSMA表达受抑制后细胞增殖能力下降,细胞S期百分比减少;增加PSMA表达,细胞增殖能力增强,S期百分比增加;在SP600125作用下,3组细胞增殖和S期百分比均处于低水平,无明显差异。在抑制PSMA表达组中,前列腺癌细胞的凋亡率明显升高;而在增强PSMA表达组,细胞凋亡率明显降低;加入SP600125后,细胞凋亡率均低于常规培养组。结论：PSMA通过上调JNK/SAPK信号通路对前列腺癌细胞的增殖、细胞周期及凋亡产生影响,但JNK/SAPK并不是唯一通路。     

干扰Arf6抑制人前列腺癌细胞系DU145增殖、迁移及侵袭

目的观察干扰二磷酸腺苷核糖基化因子6(Arf6)对人前列腺癌细胞系DU145增殖、迁移及侵袭的影响,并初步探讨其调控机制。方法脂质体转染法将靶向Arf6的特异性siRNA序列、无效序列转染至DU145细胞,分别设为干扰组和NC组,不做处理为空白组。蛋白免疫印迹(Western blot)检测siRNA干扰效率;MTT法检测细胞增殖;划痕试验及Transwell试验检测细胞迁移及侵袭;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot检测Arf6、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)mRNA及蛋白表达、磷酸化MEK(pMEK)、pERK蛋白表达。结果靶向Arf6的特异性siRNA序列干扰活性为62.67%±4.38%。干扰组不同时刻细胞增殖均显著低于空白组和NC组(P0.05);干扰组细胞迁移率、穿膜细胞数均显著低于空白组及NC组(P0.05);干扰组Arf6、Rac1 mRNA及蛋白相对表达量、pMEK/MEK、pERK/ERK蛋白比值显著低于空白组及NC组(P0.05)。结论干扰Arf6可抑制人前列腺癌细胞系DU145增殖、迁移及侵袭能力,可能与下调pMEK、pERK、Rac1蛋白表达,抑制MEK/ERK信号通路有关。     

沉默URG11基因对前列腺癌LNCaP细胞增殖、迁移与侵袭的影响

 目的: 观察上调基因11(up-regulated gene 11,URG11)在前列腺癌细胞系中的表达及降低URG11表达对人前列腺癌LNCaP细胞增殖和侵袭能力的影响。方法: 用real-time PCR和Western blot检测前列腺癌细胞系和正常前列腺上皮细胞系中URG11 mRNA和蛋白水平;设计针对URG11基因的siRNA靶序列,转染LNCaP细胞,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,MTS测定LNCaP细胞增殖能力,划痕和侵袭实验评价LNCaP细胞迁移及侵袭能力。结果: 在LNCaP、DU145、PC3前列腺癌细胞系和RWPE-1正常前列腺上皮细胞系中URG11 mRNA和蛋白表达水平存在显著差异,在前列腺癌细胞中URG11 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与对照组相比,转染URG11 siRNA的LNCaP细胞增殖停滞在G₁/S期并诱导前列腺癌细胞凋亡,转染组的细胞凋亡率为8.79%±0.12%,而且LNCaP肿瘤细胞的迁移及侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论: URG11在前列腺癌系中高表达。通过RNAi沉默URG11基因能明显抑制LNCaP细胞增殖和侵袭能力,并诱导细胞凋亡。     

Ifi204基因表达对大鼠血管外膜成纤维细胞凋亡和迁移的影响

目的探讨ifi204基因过表达与沉默对大鼠血管外膜成纤维细胞(VAF)凋亡和迁移的影响。方法原代培养大鼠VAF,利用携带ifi204基因的慢病毒颗粒或空载体慢病毒颗粒感染VAF,分别作为实验组(ifi204 lv组)和阴性对照组(blank lv组)。用ifi204基因小干扰RNA瞬时干预VAF使其沉默(ifi204 siRNA组)、空白小干扰RNA作为阴性对照组(control siRNA组),未经处理的VAF作为空白对照组(negative组)。流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞划痕法和Transwell法测定细胞迁移情况,用real-time PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白表达。结果与blank lv组、control siRNA组、ifi204 siRNA组和negative组相比,ifi204 lv组的P204、P53 mRNA和蛋白表达及细胞凋亡率明显上调(P0.05),细胞迁移速度降低(P0.05)。转染ifi204 siRNA可抑制P204、P53的mRNA和蛋白表达(P0.05),提高细胞活力,抑制细胞凋亡(P0.05),加快细胞迁移速度(P0.05)。结论 ifi204基因表达对大鼠VAF细胞凋亡和迁移的影响可能与激活P53表达有关。     

胡桃醌通过调节Wnt/β-catenin/Snail通路抑制前列腺癌细胞上皮-间充质转化

目的:探讨胡桃醌对人前列腺癌细胞上皮-间充质转化的抑制作用及其机制。方法:培养人前列腺癌LNCaP细胞,实验设置对照组(无胡桃醌)、12. 5μmol/L胡桃醌组和25μmol/L胡桃醌组,后2组用胡桃醌作用LNCaP细胞24 h。采用Transwell实验检测细胞侵袭能力; Western blot实验检测上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β-连环蛋白(β-catenin)和Snail的蛋白表达水平;使用LiC l和胡桃醌联合作用LNCaP细胞后,Western blot实验检测Snail和E-cadherin的蛋白表达。结果:Transwell实验结果表明,与对照组相比,胡桃醌作用LNCaP细胞后侵袭能力下降(P 0. 01)。Western blot的结果表明,胡桃醌作用LNCaP细胞后E-cadherin的蛋白表达升高,vimentin和Snail及细胞核中β-catenin蛋白的表达降低(P 0. 01)。与胡桃醌组比较,胡桃醌与LiC l联合作用LNCaP细胞后Snail蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低(P 0. 01)。结论:胡桃醌可能通过抑制Wnt/β-catenin/Snail信号通路而抑制LNCaP细胞上皮-间充质转化。     

PSMA基因沉默的前列腺癌细胞中肿瘤转移相关基因表达的芯片分析

目的: 探讨前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)在前列腺癌转移过程中的作用通路。方法: 针对PSMA mRNA序列设计合成siRNA序列,脂质体转染LNCaP细胞特异性下调PSMA基因的表达,通过肿瘤转移基因芯片分析84个肿瘤转移相关基因的表达差异。结果: 成功设计了siRNA序列并制备最佳干扰效果的干扰样,mRNA干扰效果达到75%以上,蛋白水平干扰效果达68%以上。通过基因芯片检测发现在下调PSMA基因表达后,有CDH6、CXCL12等10个基因发生了显著上调,而CCL7、MDM2等4个基因发生显著下调表达。结论: 初步发现PSMA参与前列腺癌转移信号通路的调节,为进一步研究PSMA的生物学功能,探索前列腺癌的转移机制奠定了基础。     

下调CENP-W对人脑胶质瘤U87细胞的影响

目的:研究下调着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)的表达水平对人脑胶质瘤U87细胞的影响。方法:采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人脑胶质瘤U87细胞CENP-W的表达,采用RT-qPCR和Western blot法评价siRNA的干扰效果,采用MTT法、BrdU实验和平板集落形成实验测定细胞的增殖,Transwell小室检测细胞侵袭力的变化,划痕实验检测细胞迁移能力的变化,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:MTT实验、平板集落形成实验和BrdU实验显示转染siRNA的实验组U87细胞的增殖能力、集落形成能力较空白对照组及阴性对照组明显降低;Transwell实验和划痕实验显示实验组细胞的迁移、侵袭能力较空白对照组及阴性对照组明显减弱;流式细胞术分析表明实验组细胞的细胞周期被阻滞在G_0/G_1期;实验组细胞凋亡比例较对照组增多(P0.05)。结论:下调CENP-W的表达可抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进细胞的凋亡,提示CENP-W有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

Survivin-siRNA对前列腺癌PC-3M细胞增殖的抑制作用

目的：探讨survivin-siRNA对前列腺癌细胞株PC-3M的增殖抑制作用。 方法:构建两个针对survivin siRNA表达载体，与脂质体和空质粒两个对照组一起分别转染前列腺癌PC-3M细胞后，利用半定量RT-PCR和Western blotting分别检测细胞survivin mRNA及蛋白表达水平，MTT法测定细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。 结果:转染72 h后，两个实验组细胞的survivin mRNA水平是脂质体组的48%±6% (n=3)和30%±5%(n=3)，蛋白表达水平是脂质体组的38%±4%（n=3）和36%±4%（n=3）。MTT检测实验组细胞的生长速度分别是脂质体组的44.20%±2.08%(n=3)和39.20%±1.93%（n=3），流式细胞术发现实验组G1期细胞比例明显高于两个对照组，而G2期和S期细胞比例减少，细胞出现凋亡。 结论:利用survivin-siRNA可明显抑制前列腺癌PC-3M细胞的增殖，细胞受阻于G1期, 诱导细胞凋亡，为进一步进行动物体内研究奠定了基础。     

The Proinflammatory Cytokine, IL-6, and its Interference with bFGF Signaling and PSMA in Prostate Cancer Cells

The aim of the present work was to study the expression of the proinflammatory cytokine, interleukin-6 (IL-6), mediated by bFGF signaling and its possible crosstalk with prostate-specific membrane antigen (PSMA) in LNCaP and PC3-PSMA prostate cancer cell lines. PC3 cells stably transfected with PSMA gene were used for restoring PSMA expression. LNCaP and PC3-PSMA cells were exposed to 10 ng/mL of basic fibroblast growth factor (bFGF). IL-6 production was measured by ELISA assay, and levels of PSMA expression were assessed by flow cytometry. AKT, ERK1/2, and p38 phosphorylation were detected by Western blot. bFGF enhances IL-6 production in LNCaP and PC3-PSMA prostate cancer cells. The effect of bFGF on stimulating IL-6 secretion was greater in LNCaP than in PC3-PSMA cells. In the presence of bFGF, PSMA expression was activated after 4 days of treatment in LNCaP and PC3-PSMA cells. This activation was not maintained after long term of treatment in both metastatic cell lines. Solely MAPKs pathways (ERK1/2 and p38) were activated after bFGF stimulation in both metastatic cell lines, whereas AKT did not show any activation. The interference of the proinflammatory cytokine, IL-6, with bFGF signaling and PSMA, should be of high clinical relevance in the treatment of metastatic prostate cancer. In developing novel therapeutic modalities targeting IL-6, significant attention should be given to PSMA and its inactivation to fight against prostate cancer.     

新型前列腺特异膜抗原剪接变异体的发现及临床意义初步探讨

目的:探讨前列腺特异膜抗原（PSMA）及其与前列腺癌发生、发展的关系，寻求更为特异的前列腺癌诊断和治疗的靶点。 方法:采用RT-PCR和DNA测序技术，克隆PSMA基因新的剪接变异体，并根据其序列信息，设计特异性引物，检测其在不同病变前列腺组织及不同组织来源肿瘤细胞中的表达。 结果:发现了一种新的PSMA剪接变异体，其在前列腺癌、前列腺增生及正常前列腺组织中的表达率分别为92.6％、78.8％及10.0％，且特异表达于前列腺癌LNCaP细胞株，而在前列腺癌PC3细胞株、膀胱癌、肾癌、肝癌细胞株中均不表达。 结论:发现了一种新型PSMA剪接变异体（定名为PSMA5），并证实该变异体与前列腺癌及前列腺增生有明显相关性，为研究前列腺癌的发生机制和寻求前列腺癌特异性诊治靶点提供了新的线索。     

慢病毒介导的RNA干扰通过下调白细胞介素6抑制损伤后 星形胶质细胞中波形蛋白的表达

目的：探讨用慢病毒介导的RNAi方法抑制白细胞介素6（ IL-6）,观察其对损伤后星形胶质细胞中波形蛋 白（ Vim）表达的影响。方法：选取3 日龄SD大鼠的大脑皮质,体外培养星形胶质细胞,分为载体组和病毒组, 2 组均制备细胞划伤模型,采用qRT-PCR 检测Vim mRNA的表达,免疫印迹检测Vim蛋白表达,用免疫荧光检测 Vim的定位,MTT检测划伤模型中星形胶质细胞增殖率,免疫荧光检测GFAP用于观察划伤模型中星形胶质细胞 活性。结果：划伤细胞2 d 后,病毒组的Vim mRNA和蛋白表达量较载体组明显下降。Vim主要在星形胶质细胞 胞质中表达。病毒组中星形胶质细胞增殖情况和活性低于载体组。结论：用慢病毒介导的RNAi方法抑制炎症因 子IL-6,可以下调反应性胶质化细胞中Vim的表达,影响星形胶质细胞胶质化反应,可能抑制胶质瘢痕形成,对 神经细胞的再生具有积极作用。     

Co-administration of a DNA vaccine encoding the prostate specific membrane antigen and CpG oligodeoxynucleotides suppresses tumor growth

BACKGROUND: Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a well characterized prostate-specific tumor associated antigen. Its expression is elevated in prostate carcinoma, particularly in metastatic and recurrent lesions. These observations suggest that PSMA can be used as immune target to induce tumor cell-specific recognition by the host and, consequently tumor rejection. We utilized a DNA-based vaccine to specifically enhance PSMA expression. An immune modulator, such as CpG oligodeoxynucleotides which promote Th1-type immune responses was combined to increase the efficacy of tumor recognition and elimination. METHODS: A eukaryotic expression plasmid pCDNA3.1-PSMA encoding full-length PSMA was constructed. C57BL/6 mice were immunized with endotoxin-free pCDNA3.1-PSMA alone or in combination with CpG oligodeoxynucleotides by intramuscular injection. After 4 immunizations, PSMA specific antibodies and cytotoxic T lymphocyte reactivity were measured. Immunized C57BL/6 mice were also challenged subcutaneously with B16 cells transfected with PSMA to evaluate suppression of tumor growth. RESULTS: Vaccine-specific cytotoxic T lymphocytes reactive with B16 cells expressing PSMA could be induced with this treatment schedule. Immune protection was observed in vaccinated mice as indicated by increased tumor growth in the control group (100%) compared with the groups vaccinated with DNA alone (66.7%) or DNA plus CpG oligodeoxynucleotides (50%) respectively. Average tumor volume was smaller in vaccinated groups and tumor-free survival time was prolonged by the vaccination. CONCLUSION: The current findings suggest that specific anti-tumor immune response can be induced by DNA vaccines expressing PSMA. In addition, the suppression of in vivo growth of tumor cells expressing PSMA was augmented by CpG oligodeoxynucleotides. This strategy may provide a new venue for the treatment of carcinoma of prostate after failure of standard therapy.     

Correlation between PSMA and VEGF expression as markers for LNCaP tumor angiogenesis

Our aim is the identification and correlation of changes in tumor-associated protein expression which results from therapy. LNCaP tumors, excised from nude mice treated either by orchiectomy or with the chemotherapeutic agent paclitaxel, were evaluated for the expression of proteins and receptors associated with growth, differentiation, and angiogenesis using immunohistologic procedures. Compared to untreated control tumors, both treatments reduced the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), prostate-specific membrane antigen (PSMA), prostate-specific antigen (PSA), androgen receptor (AR), and epidermal growth factor receptor (EGFR). The effect of paclitaxel treatment on AR expression was the most significant (P = .005). Of particular interest was identifying a significant correlation (P < .000801) between PSMA and VEGF expression regardless of treatment modality. These altered expressions suggest that PSMA may also be a marker for angiogenesis and could represent a target for deliverable agents recognizing either prostatic tumors or endothelial development. Cell surface PSMA would then present a unique target for treatment of patients early in their development of prostatic metastases.