腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对体外活化肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对体外培养的大鼠活化肝星状细胞(HSCs)增殖和凋亡的影响及其信号转导机制。方法:体外培养活化HSCs,以腺病毒为载体将靶向PTEN的shRNA干扰重组体转染至体外活化的大鼠HSCs;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSCs增殖;末端转移酶标记技术(TUNEL)及流式细胞术测定HSCs凋亡;Western blotting方法检测PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达情况;实时荧光定量PCR方法检测PTEN、Akt及ERK1 mRNA表达情况。结果:(1)靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒成功感染体外活化HSCs,并在一定范围内呈时间依赖性地促进HSCs增殖,腺病毒感染HSCs后72 h,HSCs凋亡率显著下降(P<0.05);(2)Bax表达降低,Bcl-2表达增加(P<0.05);(3)p-Akt和p-ERK1/2蛋白表达显著增加(P<0.05);而Akt蛋白及其mRNA、ERK1蛋白及其mRNA表达均无显著改变(P>0.05)。结论:RNA干扰下调PTEN基因表达可能通过Bcl-2/Bax途径促进体外活化HSCs增殖并抑制其凋亡,此外,RNA干扰下调PTEN基因表达促进p-Akt和p-ERK1/2表达增多,提示PTEN可能通过影响PI3K/Akt和ERK1/2信号通路而在调控HSCs增殖和凋亡中发挥重要作用。     

Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞在体外对肝星状细胞TGF-β1信号传导的影响

目的:探讨Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞(Smad7-EGFP-BMSCs)在体外抑制肝纤维化的机制。方法:分离、纯化大鼠BMSCs并经Smad7基因腺病毒质粒(Ad-Smad7-EGFP)转染建立Smad7-EGFP-BMSCs。实验将大鼠肝星状细胞HSC-T6分为A组、B组、C组和D组,分别与Smad7-EGFP-BMSCs、BMSCs、Smad7质粒及PBS进行共同培养72 h,采用ELISA测定培养液中Smad7和TGF-β1的表达,采用Western印迹法和RT-PCR法测定细胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA的表达,采用流式细胞术测定细胞凋亡情况。结果:(1)ELISA结果显示,B组、C组和D组培养液TGF-β1蛋白水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1蛋白水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较B组和C组显著升高(P0.01);(2)Western印迹法和PCR结果显示,B组、C组和D组TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白和mRNA表达水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著升高(P0.01);(3)流式细胞仪检测结果显示,B组、C组和D组HSC-T6细胞凋亡率较A组显著升高(P0.01),而D组细胞凋亡率较B组和C组显著升高(P0.01)。结论:Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞可通过作用肝星状细胞TGF-β1信号转导通路以及促进星状细胞凋亡而具有抗肝纤维化的作用。     

辛二酰苯胺异羟肟酸诱导大鼠原代肝星状细胞凋亡

目的:通过研究辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)凋亡及相关蛋白表达的影响,探讨SAHA诱导HSCs凋亡的作用机制。方法:采用Opti Prep梯度离心法分离大鼠原代HSCs;通过实时细胞分析技术检测SAHA对HSCs增殖的影响;倒置显微镜观察不同浓度SAHA处理HSCs后的形态变化;荧光显微镜及流式细胞术Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率;Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的蛋白表达;免疫共沉淀法检测GRP78蛋白与HDAC6蛋白是否形成复合物。结果:成功分离的HSCs连续培养14 d,HSCs逐渐由静止状态变为激活状态。SAHA可显著抑制HSCs增殖,且呈剂量时间依赖性(P0.05);SAHA对HSCs的促凋亡作用具有时间依赖性(P0.05)。SAHA处理HSCs后,α-SMA、Ⅰ型胶原、HDAC6和TIMP1的蛋白表达水平明显降低(P0.05),GRP78的蛋白表达水平明显升高(P0.05)。与激活型的HSCs相比,SAHA处理后的HSCs中免疫共沉淀下的蛋白复合物中GRP78与总的乙酰化赖氨酸蛋白显著增多,而HDAC6蛋白显著降低,同时证明GRP78与HDAC6形成复合物。结论:SAHA抗肝纤维化的机制可能是,SAHA下调HDAC6蛋白表达水平,上调乙酰化GRP78蛋白表达水平,诱导HSCs内质网应激,促进肝星状细胞凋亡,从而起到抗肝纤维化的作用。     

沉默长链非编码RNA CCAT2对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响

目的探讨靶向沉默长链非编码RNA肠癌相关转录子2(lncRNA CCAT2)对人骨肉瘤细胞MG-63增殖与凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测骨肉瘤MG63细胞与人成骨hFOB1.19细胞中lncRNA CCAT2表达水平;转染小干扰RNA沉默MG63细胞中lncRNA CCAT2的表达,qPCR方法验证沉默效率。沉默MG63细胞中lncRNA CCAT2表达后,MTT方法检测MG63细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测MG63细胞的凋亡率,Western blot方法检测MG63细胞p53及Bcl-2蛋白的表达变化。结果lncRNA CCAT2在骨肉瘤MG63细胞中的表达显著高于人成骨hFOB1.19细胞(P<0.01);转染小干扰RNA能够显著降低MG63细胞中lncRNA CCAT2的表达水平(P<0.01)。沉默lncRNA CCAT2后,MG63细胞的增殖能力显著降低,凋亡率显著上升,Bcl-2蛋白表达显著降低p53蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论靶向沉默lncRNA CCAT2能够抑制人骨肉瘤细胞MG-63的增殖并诱导凋亡。     

沉默miR-21对子宫内膜癌顺铂耐药细胞株Ishikawa/DDP的影响

目的:观察沉默miR-21对子宫内膜癌顺铂耐药细胞株Ishikawa/DDP的影响.方法:以Lipofectamine 2000介导miR-21抑制剂转染Ishikawa/DDP细胞株,同时设置阴性组和耐药组.采用反转录PCR检测miR-21、多药耐药基因MDR1、促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2的表达.采用蛋白印迹法检测多药耐药蛋白P-gp、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.采用噻唑蓝比色法检测细胞对顺铂的敏感性.采用流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:与耐药组和阴性组比较,抑制剂组miR-21,MDR1和Bcl-2 mRNA表达显著下调(P＜0.0l),而Bax mRAN表达显著上调(P＜0.00l);抑制剂组P-gp和Bcl-2蛋白表达显著低下调(p＜0.05),而Bax蛋白表达显著上调(P＜0.001).与耐药组和阴性组比较,顺铂对抑制剂组的IC50值显著(P＜0.001);顺铂对抑制剂组细胞的诱导凋亡率显著增加(P＜0.00l).结论:沉默miR-21可显著提高Ishikawa/DDP细胞株对顺铂的敏感性,并促进细胞凋亡,其具体机制可能与下调MDR1,P-gp和Bcl-2表达,以及上调Bax表达有关.     

慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化

目的:构建携带线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因的慢病毒载体,并探讨Mfn2过表达对大鼠肝星状细胞活化的抑制作用及其减少肝纤维化相关因子生成的机制。方法:构建含Mfn2的慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP,转染肝星状细胞;荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达及转染效率;RT-qPCR和Western blot法检测转染后细胞中Mfn2的mRNA和蛋白表达水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、α-SMA、TGF-β1、Smad2和Smad3的水平;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白水平。结果:与各对照组相比,慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染后,细胞促凋亡蛋白表达增多,TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad和p-Smad3的蛋白水平均降低,纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平降低(P0.01)。结论:转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP在体外可有效抑制肝星状细胞活化,并可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝纤维化相关因子的生成。     

STAT3siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3表达和细胞生物学行为的影响

目的:观察经RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌细胞A549生长和凋亡的影响。方法:设计并经化学合成了针对STAT3基因不同位点的3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列(STAT3siRNA1、STAT3siRNA2、STAT3siRNA3),在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人肺腺癌细胞株A549,采用RT-PCR法检测STAT3mRNA表达变化,筛选出抑制作用最强的STAT3-siRNA。免疫印迹法检测细胞STAT3、Cyclin D1、BAX、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达。AM-BLUE法测定A549细胞体外增殖情况。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:经RNA干扰能有效降低A549细胞STAT3mRNA表达水平(P0.05),转染STAT3siRNA后,A549细胞STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低(P0.05),而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高(P0.05)。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关(r=0.854,0.910,P0.05);与BAX蛋白表达呈负相关性(r=-0.848,P0.05);与Caspase-9蛋白表达呈无相关性(r=-0.787,P0.05)。RNA干扰法沉默STAT3基因表达后,A549细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论:STAT3siRNA可有效抑制A549细胞STAT3表达,抑制A549细胞生长并促进其凋亡。     

MIF通过调控ERK/MAPK及TGF-β1/Smads通路影响瘢痕成纤维细胞活力和凋亡

目的:探究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是否通过调控细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路及转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads通路影响瘢痕成纤维细胞的活力和凋亡。方法:收集郑州大学附属儿童医院烧伤整形科与河南省胸科医院胸外科手术切除的6例瘢痕疙瘩组织和对应正常皮肤组织,RT-qPCR和Western blot检测组织中MIF的mRNA和蛋白水平。瘢痕疙瘩组织利用组织块培养法提取成纤维细胞,实验分为对照组、空载体组、MIF过表达组、siRNA阴性对照(NC)组和MIF干扰组。除对照组外,其余各组用Lipofectamine~(TM)2000分别转染p-EGFP-N1、p-EGFP-N1-MIF、siRNA NC和MIF siRNA(均4μg),置于37℃、CO_2培养箱中转染6 h,更换为含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。继续培养12、24、48、72和96 h,MTT法检测细胞活力;培养48 h,RT-qPCR和Western blot检测细胞中MIF的mRNA和蛋白水平,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)、p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)蛋白水平。结果:与正常皮肤组织相比,瘢痕疙瘩组织中MIF的mRNA和蛋白水平升高(P0.05)。转染12 h,与对照组、空载体组和阴性对照组相比,MIF过表达组细胞活力升高(P0.05);处理24、48、72和96 h,与对照组、空载体组和阴性对照组相比,MIF过表达组细胞活力升高(P0.05),MIF干扰组细胞活力降低(P0.05);随着处理时间的延长,MIF过表达组细胞活力逐渐升高(P0.05),MIF干扰组细胞活力逐渐降低(P0.05)。转染48 h,与对照组、空载体组和阴性对照组相比,MIF过表达组细胞中MIF的mRNA和蛋白水平及Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK蛋白水平升高(P0.05),细胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3和Smad7蛋白水平降低(P0.05);MIF干扰组细胞中MIF的mRNA和蛋白水平及Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、pERK和p-p38 MAPK蛋白水平降低(P0.05),细胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3和Smad7蛋白水平升高(P0.05)。结论:MIF在瘢痕疙瘩组织中高表达,沉默MIF可抑制病理性瘢痕ERK/MAPK及TGF-β1/Smad2/3通路中相关因子的表达,进而促进细胞凋亡,抑制成纤维细胞过度生长,而过表达后的作用相反。     

沉默Apaf-1 基因对氧糖剥夺/ 复氧复糖PC12 细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默Apaf-1基因对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路的影响。方法:PC12细胞随机分为3组:正常组(Control)、模型组(Model)、Apaf-1基因沉默组(Apaf-1-siRNA)。正常组于CO2培养箱内正常培养,其余2组给予氧糖剥夺2 h、复氧复糖24 h处理,Apaf-1-siRNA组于造模前将化学合成的siRNA通过脂质体转染于PC12细胞靶向沉默Apaf-1基因。用荧光标记的siRNA检测Apaf-1转染效率,Western blot检测转染后PC12细胞Apaf-1蛋白表达,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡指数,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光染色检测Bax/Bcl-2比值,Western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达。结果:Apaf-1-siRNA可有效沉默PC12细胞Apaf-1蛋白表达(P<0.05)。与Control组相比,Model组细胞存活率明显降低(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05),线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达显著升高(P<0.05);与Model组相比,Apaf-1-siRNA组细胞存活率显著升高(P<0.05),细胞凋亡指数和凋亡率显著降低(P<0.05),Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05),Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论:靶向沉默Apaf-1基因可有效降低氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表达,抑制细胞凋亡,提高细胞存活率。     

miR-137对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭与凋亡的影响及可能机制

目的探讨miR-137对喉癌Hep-2细胞增殖及迁移能力的影响及可能机制。方法采用miR-137模拟物转染喉癌Hep-2细胞,实验分为空白对照组组(未进行转染)、miR-137阴性对照组(转染无关序列)、miR-137模拟物转染组(进行miR-137模拟物转染)。real-time PCR法验证转染效率,采用CCK8法检测miR-137对喉癌Hep-2细胞增殖的影响,采用Transwell实验检测转染后Hep-2细胞的侵袭能力变化,采用流式细胞术检测miR-137对Hep-2细胞凋亡的影响;Western blot检测转染后Hep-2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3以及侵袭相关蛋白T细胞因子-4(TCF-4)蛋白表达的变化。结果与空白对照组或阴性对照组相比,miR-137模拟物转染组Hep-2细胞miR-137的表达水平显著高于对照组(P0.01),喉癌Hep-2细胞的增殖与侵袭能力显著降低,细胞凋亡率明显升高,凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低,而Bax与caspase-3蛋白表达升高,侵袭相关蛋白TCF-4表达降低。结论过表达miR-137抑制Hep-2细胞增殖与侵袭、诱导细胞凋亡,与上调Bax、caspase-3蛋白表达和下调Bcl-2、TCF-4表达相关。     

人着色性干皮病D组基因对白细胞介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的: 探讨人着色性干皮病D组基因(XPD)对白细胞介素-6(IL-6)促进人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响。方法: 用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空质粒pEGFP-N2稳定转染VSMCs,然后给予1×10⁵ U/L IL-6孵育48 h。实验分为6组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)IL-6组;(5)IL-6 + pEGFP-N2组;(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wt-P53)表达量的变化。结果: 在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(P<0.05),并能抑制IL-6促进VSMCs增殖的作用(P<0.05);流式细胞仪结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了细胞G₀/G₁期增加(P<0.05)、S期减少(P<0.05)、凋亡率增加(P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs G₀/G₁期减少、S期增加、凋亡率降低的作用(P<0.01);RT-PCR和Western blotting检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(P<0.05或P<0.01),同时Bcl-2表达降低,Bax和wt-P53表达增高(P<0.05或P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs的Bcl-2表达增高、Bax和wt-P53表达降低的作用(P<0.05或P<0.01)。结论: XPD能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMCs增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。     

下调miR-21 抑制PI3K / AKT 信号通路对白血病细胞增殖凋亡的影响

目的:探讨miR-21 对白血病K562 细胞增殖凋亡的影响及对PI3K/ AKT 信号通路的调控作用。方法:将K562 细胞分为对照组、miR-21 NC 组和miR-21 干扰组,对照组不做处理,后两组采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000 转染miR-21 inhibitor 和miR-21 negative control。转染48 h 后,利用实时荧光定量(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-21 mRNA 的表达情况,采用MTT 比色法检测miR-21 对细胞增殖率的影响,流式细胞仪检测miR-21 对细胞周期和凋亡率的影响,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测miR-21 对各组细胞中PI3K/ AKT 信号通路相关蛋白PI3K、AKT 和p-AKT 表达的影响。结果:miR-21 干扰组中细胞的miR-21 mRNA 表达水平和细胞的存活率较对照组和miR-21 NC 组均明显降低;与对照组和miR-21 NC 组比较,流式细胞仪检测miR-3 干扰组中G0/ G1 期所占细胞比例明显升高,S 期细胞所占比例明显下降,细胞的凋亡率明显升高。Western blot 检测p-AKT 的表达水平较对照组和miR-21 NC 组明显下降,但PI3K 和AKT 蛋白的表达水平变化不大。结论:下调miR-21 能够抑制白血病K562 细胞的增殖,促进其凋亡,其作用机制可以与抑制PI3K/ AKT 信号通路有关。     

RNA干扰MEX3A基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制MEX3A基因表达对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响。 方法 应用GV115载体构建针对MEX3A基因的shRNA慢病毒载体,转染包装细胞293T产生慢病毒颗粒,收集并滴度测定后转染5637膀胱癌细胞,实验组转染MEX3A-shRNA慢病毒,对照组转染阴性对照慢病毒;实时定量PCR（Real-time PCR）检测MEX3A基因敲减效率;慢病毒转染3 d后,使用Celigo连续细胞计数5d检测细胞生长;慢病毒转染5d后,进行膜联蛋白V（Annexin V）染色并用流式细胞术检测细胞凋亡。 结果 成功构建MEX3A-shRNA慢病毒载体以及稳定抑制MEX3A表达的细胞株,MEX3A基因敲减效率达到74%;Celigo细胞计数检测显示,与对照组相比,实验组5637细胞的增殖速率受到显著抑制;流式细胞术检测显示,实验组发生凋亡的5637细胞显著增加。 结论 MEX3A基因促进膀胱癌细胞的增殖,抑制膀胱癌细胞的凋亡。     

miR-132 靶向调控Ezrin 抑制卵巢癌细胞增殖、促进凋亡的实验研究

目的:探讨微小核糖核酸分子(miRNA)-132 在卵巢癌中生物学作用和作用靶点。方法:收集22 例卵巢癌及癌旁非肿瘤组织标本,RT-PCR 检测miR-132 表达量;RT-PCR 检测人正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞系中miR-132 表达量;选择miR-132 表达量最高或最低的卵巢癌细胞株,分别转染阴性对照质粒(NC)和miR-132 mimic 质粒,RT-PCR 检测转染后miR-132 表达量;CCK-8 法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot 检测Ezrin 蛋白表达。结果:卵巢癌组织中miR-132 表达量显著低于癌旁非肿瘤组织,而卵巢癌细胞系中miR-132 表达量显著低于正常卵巢上皮细胞,差异均有统计学意义(P<0.05);选择卵巢癌细胞株中miR-132 表达量最低卵巢癌SKOV3 细胞株进行基因转染,与转染阴性对照质粒相比,转染miR-132 mimic 质粒后miR-132 表达量显著上升,细胞增殖显著降低,细胞凋亡显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05);Western blot 结果显示,上调miR-132 表达后,卵巢癌SKOV3 细胞株中Ezrin 蛋白表达显著上升(P<0.05)。结论:在卵巢癌中,miR-132 可能作为一种抑癌基因通过靶向调控Ezrin 抑制卵巢癌细胞增殖、促进凋亡。     

微管不稳定蛋白stathmin基因沉默影响鼻咽癌5-8F细胞系增殖与凋亡

目的: 构建微管不稳定蛋白stathmin基因siRNA质粒表达载体,探讨stathmin沉默对鼻咽癌5-8F细胞的增殖和凋亡作用。方法: 合成的stathmin基因特异性干扰片段单链退火形成双链后,亚克隆于siRNA质粒表达载体 pGenesil-1.1,质粒经鉴定后,采用脂质体将其转入鼻咽癌5-8F细胞;Western blotting检测stathmin表达;MTT实验分析细胞增殖;流式细胞术分析细胞凋亡。结果: Stathmin沉默组5-8F细胞的抑制率为(53.01±1.12)%,与试剂对照组 和阴性对照组 比较,差异显著(P<0.05)。Stathmin沉默组5-8F细胞的凋亡率为(8.75±0.67)%,与试剂对照组 和阴性对照组 比较,差异显著(P<0.05)。结论: Stathmin沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖,诱导鼻咽癌5-8F细胞凋亡。     

SiRNA沉默Sox-9基因调控骨骺干细胞的增殖及凋亡

背景：目前有研究表明,很多细胞生长因子可促进骨骺干细胞的增殖和分化,并且这种调控作用与Sox-9有密切的关系。 目的：观察小分子干扰RNA沉默Sox-9基因及对大鼠骨骺干细胞增殖、凋亡的影响。 方法：采用酶消化法分离、免疫磁珠法纯化及免疫组织化学SABC法鉴定得到大鼠骨骺干细胞,首先进行预转染Sox-9 siRNA,判断转染效率,实验分2组：对照组常规培养,实验组采用Sox-9 siRNA转染。 结果与结论：实验成功分离、纯化了原代骨骺干细胞,生长状态稳定、贴壁牢固,光学显微镜下细胞多呈梭形。免疫组织化学染色和免疫荧光鉴定显示,Sox-9 siRNA转染的大鼠骨骺干细胞可稳定表达相对特异性标志物成纤维细胞生长因子受体3。RT-PCR,MTT,流式细胞仪检测检结果提示,与对照组相比,实验组Sox-9 mRNA表达及细胞存活率降低(P < 0.05),凋亡率增加(P < 0.05)。结果证实,siRNA沉默Sox-9基因可调控大鼠骨骺干细胞的增殖和凋亡。     

TPX2对人肺癌细胞增殖、凋亡及cleavedcaspase-3表达的影响

目的 探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)对人肺癌细胞增殖、凋亡及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)表达影响。方法 培养人肺癌细胞A549,分为Control组(不进行细胞转染)、siRNA-NC组(细胞转染TPX2 siRNA control)、TPX2 siRNA组(细胞转染TPX2 siRNA),采用实时荧光定量PCR (qPCR)和Western blot检测TPX2 siRNA的转染效果。取转染后各组细胞,采用噻唑蓝检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测cleaved caspase-3蛋白表达情况。结果 TPX2 siRNA组中,TPX2 mRNA、蛋白水平和细胞光密度(OD)值均明显低于Control组和siRNA-NC组,细胞凋亡率、细胞中cleaved caspase-3蛋白表达水平均明显高于Control组和siRNA-NC组,差异均有统计学意义(P值均<0.05);而siRNA-NC组中,TPX2 mRNA、蛋白水平及细胞OD值、细胞凋亡率、细胞中cleaved caspase-3与Control组比较,差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。结论TPX2 siRNA能够干扰人肺癌细胞A549中TPX2的表达。下调TPX2的表达能够抑制人肺癌细胞A549增殖,促进caspase-3活化,促进人肺癌细胞A549的凋亡。     

let-7f对骨髓间充质干细胞增殖的影响

背景：microRNA let-7f和炎性因子白细胞介素6对骨髓间充质干细胞的具体作用及两者之间是否存在联系尚不可知。 目的：分析let-7f及白细胞介素6表达水平对骨髓间充质干细胞增殖的影响及两者的关系。 方法：①构建let-7f过表达及抑制慢病毒载体,分别转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,实验分为4个组：转染上调组(转染LV-rno-let-7f-up)、转染下调组(转染LV-rno-let-7f-down)、阴性转染组(转染空病毒)、未转染组(不进行病毒转染)。 qRT-PCR检测各组细胞let-7f表达水平。MTT法、流式细胞术和ELISA等方法检测不同let-7f表达水平下细胞增殖情况及白细胞介素6表达水平,qRT-PCR及Western blot检测各组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平。②预测let-7f潜在的靶基因,构建野生型/突变型白细胞介素6 3’UTR报告基因载体,分别与let-7f/let-7f inhibitor共转染293T细胞系,测定荧光素酶活性。 结果与结论：let-7f转染上调组较未转染组及阴性转染组细胞增殖能力及克隆能力明显增强,G1期细胞数明显减少,S期明显增多,凋亡减少(P < 0.05);转染下调组结果与其相反。let-7f转染上调组细胞培养液中的白细胞介素6表达水平低于未转染组及阴性转染组(P < 0.05);转染下调组细胞培养液中的白细胞介素6则明显升高(P < 0.05);Western blot、定量PCR显示let-7f转染上调组Cyclin D1蛋白及mRNA表达上调(P < 0.05);转染下调组表达均下调(P < 0.05);未转染组与阴性转染组所有结果无明显差异(P > 0.05)。野生型白细胞介素6 3’UTR报告基因载体与let-7f共转染细胞的荧光素酶活性显著减低(P < 0.05)。结果表明上调let-7f表达水平可显著促进骨髓间充质干细胞增殖活性及克隆形成能力,减少凋亡,而下调let-7f表达水平则出现抑制作用。白细胞介素6过表达可抑制骨髓间充质干细胞增殖,考虑白细胞介素6是let-7f的靶基因,let-7f可能通过抑制白细胞介素6表达而促进细胞增殖。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程      

miR-137对肾癌GRC-1细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究miR-137对肾癌GRC-1细胞增殖与凋亡的影响.方法 采用miR-137模拟物转染至肾癌GRC-1细胞,实验分为未转染组(未进行miR-137模拟物转染)、miR-137对照组(转染随机序列)、miR-137转染组(进行miR-137模拟物转染).荧光定量PCR检测各组转染后48h细胞中miR-137表达水平,应用噻唑蓝细胞增殖试验(MTT)、流式细胞检测技术与免疫荧光评价miR-137对肾癌GRC-1细胞增殖和凋亡的影响.结果 转染miR-137模拟物48h后,荧光定量PCR检测发现未转染组、miR-137对照组及miR-137转染组GRC-1细胞中miR-137的相对表达量依次为(24.43±2.03)％、(26.57±2.55)％、和(73.30±3.29)％,差异有统计学意义(P＜0.05).MTT细胞增殖实验与流式细胞仪检测结果显示,与未转染组、miR-137对照组相比,miR-137转染组转染48h后肾癌GRC-1细胞的增殖率显著降低,凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),而未转染组、miR-137对照组肾癌GRC-1细胞的增殖率、凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.02).结论 miR-137可明显抑制肾癌GRC-1细胞增殖和促进其凋亡,故有望成为肾癌基因治疗的新靶点.     

RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.