钙敏感受体在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的:观察钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠肺动脉平滑肌细胞。应用Western blotting技术及免疫荧光染色分析CaSR蛋白在肺动脉平滑肌的表达;采用激光共聚焦扫描技术检测不同处理因素对细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,应用MTT法分析不同处理因素对细胞存活率的影响。结果:大鼠肺动脉平滑肌细胞有CaSR蛋白表达。缺氧能够增加CaSR和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞存活率及[Ca2+]i(与对照组比较,P0.05)。GdCl3(CaSR激动剂)能够增强缺氧的上述作用,NPS2390(CaSR抑制剂)则能够减弱缺氧的作用。结论:缺氧诱导的CaSR表达增加参与了缺氧性肺动脉平滑肌细胞增殖。     

低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖及其作用机制初探

目的和方法：实验采用ＰＤＧＦ生物活性检测法，流式细胞术，「＾３Ｈ」－ＴｄＲ掺入以及细胞免疫线化等方法探讨了低氧状态下，血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）及其受体与肺动产滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）增殖间的相互关系。结果：低氧可以增强ＰＤＧＦ的活性，上调ＰＧＦ受体促进ＰＡＳＭＣ增殖以ＰＤＧＦ作为刺激嘲一步促进低氧的促增殖作用。结论：低氧状态下，ＰＡＳＭＣ的ＰＤＧＦ及其受体进一步活化，从而增强了ＰＤＧＦ自分泌、旁     

活性氧和ERK1/2信号通路在缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡中的作用

目的：研究缺氧状态下大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）内活性氧（ROS）水平的变化,ROS对细胞外信号调节激酶（ERK）1/2蛋白表达的影响以及ROS和ERK1/2在PASMCs增殖和凋亡关系失衡中的作用。方法: 原代培养正常大鼠PASMCs,选用第2-3代用于实验。分别在常氧及缺氧条件下用ROS清除剂tiron、ERK1/2抑制剂PD98059进行分组干预。通过NBT还原法和DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS,免疫荧光法检测磷酸化- ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达,MTT比色法和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的免疫细胞化学法检测细胞增殖,原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果: (1)缺氧组细胞内ROS水平明显高于对照组（P<0.01）;(2)缺氧组的增殖活性与对照组相比显著增高（P<0.01）,而凋亡率显著降低（P<0.01）,使用tiron后能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖（P<0.05）,而凋亡率却明显升高（P<0.01）;(3)缺氧组p-ERK1/2蛋白表达显著高于对照组（P<0.01）,使用tiron后缺氧诱导的p-ERK1/2表达被显著抑制（P<0.01）;(4)使用PD98059也能明显抑制缺氧诱导的细胞增殖（P<0.05）,而凋亡率也明显升高（P<0.01）,缺氧下同时使用PD98059和tiron与单用tiron相比,对细胞增殖和凋亡的影响均无明显差异（P>0.05）。结论: 缺氧时PASMCs中生成增多的ROS通过活化下游ERK1/2信号通路,促进PASMCs增殖并抑制凋亡,从而在缺氧性肺动脉重建过程中发挥重要作用。     

低氧诱导因子1在低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的: 探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡的影响,以及HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS蛋白表达变化在其中的作用与意义。方法: 体外培养大鼠PASMC，设计常氧组、低氧组及ADM、L-NAME、PD98059干预组，用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定细胞增殖反应，用流式细胞仪检测细胞凋亡，用Western blotting法检测HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS的蛋白表达。结果: （1）低氧24 h组的A值明显高于常氧组(P<0.01)，而PD98059及ADM干预组明显低于低氧组(P<0.01)， L-NAME干预组明显高于低氧组和常氧组(P<0.01)。（2）免疫组化表明，低氧24 h组呈阳性表达(P<0.01)。PD98059、ADM抑制了PCNA的表达(P<0.01)， L-NAME促进了PCNA的表达(P<0.01)。（3）各组在低氧培养24 h后，凋亡指数差异无显著(均P＞0.05)。（4）Western blotting表明常氧组少量HIF-1α、iNOS、 P-ERK1/2表达，低氧4 h后均表达增高(P<0.01),8 h仍维持在高峰(P<0.01)，而HIF-1α、P-ERK1/2在低氧24 h后表达下调。L-NAME促进了HIF-1α表达(P<0.01),PD98059部分抑制了HIF-1α、iNOS及P-ERK1/2表达(P<0.01)；ADM部分抑制了HIF-1α表达，促进iNOS表达(P<0.01)。结论: 低氧能促进肺动脉平滑肌细胞增殖，对细胞的凋亡无影响；HIF-1在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖中起重要作用。     

牛痘相关激酶1在小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及机制

目的：探讨牛痘相关激酶1(vaccinia-related kinase 1, VRK1)在小鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs）增殖及迁移中的作用及机制。方法：培养小鼠肺动脉平滑肌细胞系,细胞传至第3代至第5代细胞进行后续实验。在低氧条件下检测不同低氧时间干预后PASMC中VRK1蛋白水平的变化。为探究VRK1在低氧所致PASMCs增殖和迁移中的作用,通过携带Vrk1特异短发夹RNA(Vrk1 short hairpin RNA,sh Vrk1)或相关阴性对照RNA(shCon)的慢病毒转染PASMCs,将转染后的PASMCs分别进行常氧、低氧处理,Western blot检测VRK1和β-catenin蛋白水平变化,采用Ki-67细胞免疫荧光染色法检测PASMCs的增殖活性,划痕实验检测PASMCs的迁移能力。加入40μmol/L SKL2001恢复β-catenin活性后再次检测上述指标。结果：与常氧组相比,低氧处理24 h和36 h后PASMCs中VRK1蛋白表达水平升高（P<0.01）。常氧培...     

血小板源生长因子在低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

运用流式细胞仪及细胞原位杂交方法测定低氧对培养的新生牛肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）生长的影响，并探讨血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）在其中的作用，结果表明：培养的ＰＡＳＭＣ的低氧１２ｈ时，由Ｇ０／Ｇ１期进入Ｓ斯的细胞数明显增多，为对照组的１５７．７％（Ｐ〈０．０５）；ＰＤＧＦ可进一步促进低氧状态下ＰＡＳＭＣ的增殖，Ｓ期细胞为对照组的２４２．３％（Ｐ〈０．０１），原位杂交结果显示：低氧（１２ｈ）条件下     

钙敏感受体通过PI3K信号通路介导缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

目的:探讨钙敏感受体(CaSR)在缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖中的信号转导途径。方法:Ⅱ型胶原酶消化法提取、培养大鼠PASMCs。通过缺氧培养箱内(93%N₂、2%O₂、5%CO₂)培养24h的方法复制细胞缺氧模型。应用Western blotting分析不同处理情况下细胞周期素D1(cyclin D1)及磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)在PASMCs中的表达;采用流式细胞术检测不同处理因素对细胞增殖周期及增殖指数的影响,应用BrdU掺入法分析不同处理因素对细胞DNA合成的影响。结果:缺氧引起PASMCs的cyclin D1及p-Akt表达水平上调,增加BrdU掺入量、S期细胞数量和细胞增殖指数,GdCl₃能够放大缺氧的作用,但上述效应可以被LY294002抑制。结论:CaSR通过PI3K/Akt信号通路参与缺氧诱导的大鼠PASMCs增殖。     

缓激肽对TGF-β1诱导的猪肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

 目的：研究缓激肽（BK）对转化生长因子 β1（TGF-β1）诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响及其可能机制。方法：原代培养猪PASMCs,采用CCK-8法测定BK对TGF-β1诱导的PASMCs增殖能力的影响,同时应用Western blotting检测PASMCs PI3K、p-Akt和p-ERK1/2表达的变化。结果：TGF-β1呈剂量依赖性促进PASMCs增殖（P<005）,BK显著抑制了TGF-β1诱导的PASMCs增殖（P<005）,而BK 2型受体（B2R）抑制剂HOE-140可以显著抑制BK的效应（P<005）;Western blotting结果显示,BK抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖主要是通过阻断PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化而实现。结论：BK显著抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖,此作用可能与其抑制PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化有关。     

缺氧对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及其传递途径

本文观察了低氧对离体培养成年牛肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）＾３Ｈ－ＴｄＲ参入的影响，并用异搏定、Ｈ７、ＰＭＡ和ＥＧＦ进行干预实验，对ＭＳＣ增殖中信息传递途径作了初探。结果显示：（１）缺氧２４ｈ，ＰＡＳＭＣ＾３Ｈ－ＴｄＲ参入显著增高。（２）异搏定及Ｈ７显著降低低氧Ｈ－ＳＭＣ＾３Ｈ－ＴｄＲ参入，而ＰＭＡ及ＥＧＦ显著增加ＨＳＭＣ＾３ＨＴｄＲ参入。（３）Ｈ－ＳＭＣ对ＰＭＡ和ＥＧＦ反应强于常氧Ｎ－ＳＭＣ；     

肾性高血压大鼠与心脏α1肾上腺素能受体自身抗体的关系

目的:研究肾性高血压大鼠发病与心脏α₁肾上腺素能受体自身抗体的关系。方法:利用手术的方法建立肾性高血压大鼠模型,观察心脏α₁肾上腺素能受体自身抗体与肾性高血压发病的关系,同时对自身抗体生物活性进行分析。结果:在狭窄左肾动脉两周后,大鼠血浆中心脏α₁肾上腺素能受体自身抗体的阳性率和滴度与术前相比均明显升高,并且可持续到12周,以后逐渐下降|同时心脏α₁肾上腺素能受体自身抗体对培养的乳鼠心肌细胞的跳动具有激动剂样效应。结论:心脏α₁肾上腺素能受体自身抗体可能通过作用使外周血管阻力增加,从而促进肾性高血压大鼠心肌肥厚。     

活化激酶C受体1在切应力调控血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的 探讨活化激酶C受体1（receptor for actived C kinase 1, RACK1）在内皮细胞（endothelial cells, ECs）感受切应力刺激调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用及其机制。方法 应用平行平板流动腔系统,对联合培养的大鼠ECs和VSMCs施加1.5 Pa正常切应力（normal shear stress, NSS）和0.5 Pa低切应力（low shear stress,LowSS）,应用BrdU ELISA方法检测VSMCs增殖水平,对蛋白质组学研究发现的力学响应分子RACK1表达以及Akt磷酸化,应用Western blot技术进行检测。静态条件下,应用RNA干扰技术特异性抑制VSMCs的RACK1表达,检测其对细胞增殖和Akt磷酸化的作用。应用ECs与VSMCs隔开培养和联合培养模型,检测ECs对VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化水平的影响。结果 血管差异蛋白质组学的结果发现,与NSS组相比,RACK1在LowSS组血管组织的表达水平明显升高。细胞实验结果显示,LowSS诱导了与ECs联合培养的VSMCs增殖,上调VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化。静态条件下,特异性抑制VSMCs的RACK1表达后,VSMCs的增殖水平和Akt磷酸化水平均显著下降。与ECs联合培养VSMCs,其RACK1表达和Akt磷酸化水平较隔开培养组均上调。结论 VSMCs的RACK1表达受细胞接触与切应力的影响,并可能通过PI3K/Akt信号通路参与LowSS诱导的VSMCs增殖的调控。探讨VSMCs增殖功能变化及其力学生物学机制对于认识动脉粥样硬化等疾病发病机理和疾病防治有重要意义。     

L-精氨酸对高肺血流量大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

探讨L－精氨酸（L－Arginine,L-Arg）对高肺血流量所致肺动脉高压平滑肌细胞增殖与凋亡的干预作用。18只雄性SD大鼠随机分为对照组、分流组和分流＋L精氨酸（L－Arg）组。对分流组和分流＋L－Arg组大鼠行腹主动脉－下腔静脉分流术。观察术后11周大鼠肺动脉平均压（mPAP)和右心室肥厚的改变，采用免疫组织化学方法研究肺动脉平滑肌细胞PCNA和Fas的表达，并通过原位缺口末端标记方法（TUNEL）检测大鼠肺动脉平滑肌细胞的凋亡。结果表明分流组大鼠mPAP、右心室（RV）与左心室加室间隔（LV＋S）的比值，肺中、小型动脉平滑肌细胞增殖指数（PI），凋亡指数（AI），PI／AI比值明显高于对照组大鼠（P＜0．05），同时，分流后肺动脉平滑肌细胞Fas表达增高。然后，分流＋L－精氨酸组大鼠mPAP、RV／LV＋S明显低于分流组（P＜0．05及0．01）。并且L－Arg减少了肺中、小型动脉平滑肌细胞的增殖，促进了凋亡（P＜0．01），wviycL-Arg组大鼠PI／AI比值较分流组明显降低（P＜0．01），同时，L－Arg使分流大鼠肺平滑肌细胞Fas表达明显增强。以上结果提示，L－精氨酸通过抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖，促进其凋亡，从而对同肺血流量所致肺动脉高压的形成有重要的调节作用。     

蛋白激酶C在低氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

低氧肺动脉平滑肌细胞的增殖在肺血管重构、低氧性肺动脉高压的形成发展中有重要作用。蛋白激酶C(PKC)是细胞后信号通路之一 ,在低氧肺动脉平滑肌细胞增殖的多个环节中发挥作用。     

FHL1在香烟烟雾刺激的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移中的作用

 目的：研究FHL1 (four-and-a-half LIM domain 1)在香烟烟雾提取物（CSE）刺激的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖及迁移中的作用。方法：原代培养PASMCs,分别予CSE及FHL1 siRNA转染干预,分为6组：空白组、阴性转染组、FHL1 siRNA转染组、CSE组、CSE+阴性转染组和CSE+FHL1 siRNA转染组。Real-time PCR法检测FHL1 mRNA的表达,Western blotting法检测FHL1 蛋白,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell 法测定细胞迁移。结果：CSE刺激导致PASMCs增殖、迁移及FHL1蛋白表达增加 (P<0.01) ,但FHL1 mRNA的表达无明显改变（P＞0.05）。FHL1 siRNA转染PASMCs,可降低CSE所致的PASMCs增殖及迁移(P<0.01)。结论：CSE可促进PASMCs增殖与迁移以及FHL1蛋白的表达, 抑制FHL1蛋白的表达可减弱CSE对PASMCs增殖和迁移的作用。这些结果表明CSE促进PASMCs增殖和迁移与FHL1蛋白有关。     

常压缺氧性肺动脉高压大鼠肺组织肾上腺素能受体亚型数目的动态变化

我室以往工作表明间断常压缺氧1周大鼠肺β受体略升高,缺氧2周及4周减少,α_1受体则呈上升变化。本文在此基础上研究常压缺氧不同时间后大鼠肺肾上腺素能受体亚型的动态变化规律。结果表明缺氧1周肺β受体略升高,2及4周β受体减少,β_2受体的变化规律与总β受体相同,表现为先增后降的动态变化,而β_1受体在缺氧过程中呈上升变化。α_2受体缺氧后均呈上升变化。结果表明调节肺血管舒张的β_2受体减少,调节肺血管收缩的α体增加对肺动脉高压发生发展是起作用的,这种受体亚型的变化对选择更特异的α受体阻断剂及β受体激动剂进行防治有重要参考意义。     

晕动病易感性SNP对肾上腺素α2A受体基因表达调控的影响

目的:研究人肾上腺素α_2A受体基因-12 96位G/C多态性对DNA与蛋白质结合的影响。方法:以重组质粒为模板,扩增-12 96位为G或C的 390bp片段 (-1414--102 5)bp,分别与细胞核蛋白质结合,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,与地高辛 (Dig)标记的同源DNA片段杂交。另将Dig-dUTP标记的同一片段与经SDS-PAGE转印至膜上的细胞核蛋白质进行DNA-蛋白质结合反应,以抗Dig抗体检测结合反应信号。结果:EMSA结果显示,-12 96位为C的片段可与细胞核蛋白质结合,X光片上显示一条特异性结合带;为G时则无;人肾上腺素α_2A受体基因 (-1414--102 5)bp 390bpDNA片段与细胞核提取物杂交结果显示,在约15kU位置可见一蛋白质条带。结论:肾上腺素α_2A受体基因-1414--102 5bp之间可能存在一转录因子结合位点,-12 96位为C时,能与一特异性核蛋白结合,此蛋白质的相对分子量约为15kU。     

缝隙连接在TGF-β1 诱导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的: 探讨缝隙连接是否参与转化生长因子β₁(TGF-β₁)诱导的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养SHR胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组:对照组、TGF-β₁组、缝隙连接阻断剂18α-甘草次酸(18α-GA)组和TGF-β₁+18α-GA组。MTT法及流式细胞术检测细胞的增殖活性,免疫荧光技术观察细胞中缝隙连接蛋白(Cx)43和Cx40蛋白表达及定位,Western blotting法检测细胞中Cx43和Cx40蛋白表达, 染料示踪分子传递法(划痕标记染料传输法)检测细胞的缝隙连接功能。结果: (1)与对照组相比,TGF-β₁组MTT法测得A值及细胞周期S期比例增高 (P<0.05),细胞增殖活性增强。18α-GA组降低(P<0.05);与TGF-β₁组比,TGF-β₁+ 18α-GA组A值及S值比例均降低(P<0.05),细胞增殖活性减弱。(2)免疫荧光技术检测细胞中Cx43与Cx40蛋白表达呈阳性,两者共定位于胞浆。(3)与对照组相比,TGF-β₁组Cx43蛋白表达增强(P<0.05),Cx40表达无显著差异(P>0.05),18α-GA组Cx43和Cx40表达均减弱(P<0.05),与TGF-β₁组比,TGF-β₁+18α-GA组Cx43表达减弱(P<0.05),Cx40表达无显著差异(P>0.05)。(4)与对照组相比,TGF-β₁组缝隙连接功能明显增强(P<0.05);18α-GA组缝隙连接功能明显减弱(P<0.05);与TGF-β₁组比,TGF-β₁+18α-GA组缝隙连接功能显著降低(P<0.05)。结论: TGF-β₁主要通过上调SHR血管平滑肌细胞Cx43蛋白表达,引起缝隙连接通讯功能增强,从而促进了SHR血管平滑肌细胞的增殖,而Cx40蛋白表达可能不起主要作用。     

大黄素阻断SMAD2/3信号通路抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移

目的 探讨大黄素对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)增殖、迁移的影响。方法 体外培养HPASMC,取对数生长期的细胞,分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1联合大黄素处理组。采用CCK-8法检测HPASMC活性,Transwell^TM小室实验和划痕实验检测HPASMC迁移能力;免疫荧光实验检测骨桥蛋白(OPN)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,Western blot法检测HPASMC的OPN、PCNA的蛋白水平及SMAD家族成员2(SMAD2)和SMAD3的磷酸化水平。结果 与对照组相比,TGF-β1处理组的OPN、PCNA蛋白表达增加,HPASMC增殖和迁移能力增强,SMAD2、SMAD3的磷酸化增强。与TGF-β1组相比,TGF-β1联合大黄素处理组HPASMC的增殖和迁移能力降低,OPN、PCNA蛋白表达减少,SMAD2、SMAD3蛋白磷酸化明显降低。结论 大黄素可抑制HPASMC中TGF-β1上调OPN、PCNA蛋白的表达,抑制TGF-β1诱导的PASMC增殖和迁移,可能与抑制SMAD2/3信号通路有关。     

散打运动员β2肾上腺素能受体基因多态性研究

观察β2肾上腺素能受体(β2-AR)Arg16Gly的基因型和等位基因频率在我国散打运动员中的分布,探讨散打运动员与普通汉族人群关于该位点多态性的差异。应用等位基因特异性引物PCR技术,检测61名散打运动员和50名普通汉族人β2-AR Arg16Gly基因多态性。结果显示,AA基因型,A等位基因和G等位基因在散打运动员组与普通汉族人组之间的差异具有显著性(2=6.646,P=0.01,P<0.05;2=4.003,P=0.045,P<0.05;2=4.003,P=0.045,P<0.05),普通汉族人的AA基因型频率和A等位基因频率明显高于散打运动员的AA基因型频率和A等位基因频率。