柯萨奇B组病毒逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

根据柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）基因组５’非编码区核苷酸序列，选用了一对组特异性吸收物，用于逆转聚合酶链反应检测ＣＢＶ－ＲＮＡ，结果显示该法可检出ＣＢＶ１～６型ＲＮＡ，灵敏度为１０ＰＦＵ不能检出其他病毒ＲＮＡ，采用的碘化钠－异硫氰酸胍－氯仿法提取ＣＢＶ－ＲＮＡ与传统的蛋白酶Ｋ－酚－氯仿法及异硫氰酸胍－酚－氯仿法比较，具有快速，简便，稳定，可靠的特点，应用该法检测ＣＢＶ－５感染鼠外周血ＲＮＡ，第３ｄ即为     

热变性法处理HCVRNA模板直接扩增

采用低浓度２－巯基乙醇作为裂解剂，配合高热变性处理血清等标本中丙型肝炎病毒核酸（ＨＣＶＲＮＡ）模板，将裂解上清直接逆转录，使ＨＣＶＲＮＡ转变为ｃＤＮＡ，再行套式多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增．５８份抗－ＨＣＶ阳性血清标本中，可检出３２份（５５．２％）ＨＣＶＲＮＡ，虽与常规的酸胍酚抽提方法所检出相当（即３０份被检出ＨＣＶＲＮＡ阳性，５１．７％），由于这种直接法省去了用酚及氯仿抽提和醇类沉淀等步骤，具有明显的实用价值。     

异硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取组织中的RNA

为寻找一种简便、低消耗、提取高质量ＲＮＡ的方法。基于异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法，省去变性液Ｄ－二次溶解ＲＮＡ提取组织中的ＲＮＡ。结果：从２００多例肿瘤组织中提取出高质量的ＲＮＡ，所需费用与购试剂盒相比节约了７５％。结果提示：异硫氰酸胍－氯仿一步法是一种简便、经济、适合大量样本的ＲＮＡ提取方法。     

血清丙肝病毒RNA二种提取方法的比较

２４例抗－ＨＣＶ阳性的血清标本，同时以硫氰胍半字符热酚变性方法和蛋白酶ＫＩ肖化法裂解提取丙肝病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ），并应用反转录半字符多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和套式多聚酶链反应（Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ）检测ＨＣＶＲＮＡ。结果表明，硫氰胍半字符热酚法明显优于蛋白酶Ｋ消化法。前者处理标本的阳性检出率为５８．３％，后者处理标本的阳性检出率为３３．３％（Ｐ＜０．０５）；前者操作步骤简便，在试剂的保存等方面优于后者，故前者更适于临床ＨＣＶＲＮＡ的检测     

肝细胞癌患者GB病毒C感染状况及其相关性研究

为了解ＧＢ病毒Ｃ（ＧＢＶ－Ｃ）感染与肝细胞癌（下称肝癌）之间可能的相关性,采用一步法逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对１２４例肝癌患者进行了ＧＢＶ－Ｃ ＲＮＡ检测。结果：ＧＢＶ－Ｃ ＲＮＡ总检出率高达２６．６％（３３／１２４）,３３例ＧＢＶ－Ｃ ＲＮＡ检出阳性者中,９０．９％合并有ＨＢＶ、ＨＣＶ感染;３３例非Ｂ非Ｃ型肝癌中,ＧＢＶ－Ｃ ＲＮＡ检出率为９．１％（３／３３）。３３例ＧＢＶ－Ｃ感染阳性     

差示逆转录—聚合酶链反应技术定量检测柯萨奇B组？…

目的建立对患者体内病毒水平进行客观定量检测的方法。方法采用差示逆转录－聚合酶链反应，共同扩增柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＶＢ）目的基因和参照模板Ｍｍｙｏｇｅｎｅ，建立一种检测ＣＶＢ复制水平的定量方法，并对苦瓜素外抗ＣＶＢ３感染疗效进行初步评价。结果该方法成功检测到ＣＶＢ３ＲＮＡ水平，且若瓜素处理组ＣＶＢ３ＲＮＡ水平明显低于对照组。结论该方法具有简便，快速、可靠，重复性好等优点，同时检测多份样本，非常适合于大     

HBV和HCV感染与原发性肝细胞癌发生的相关性研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，检测２０例肝细胞癌患者肝组织ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ。检测发现８０％的ＨＣＣ癌组织中可检出ＨＢＶ－ＤＮＡ的存在，２５％的病例可以查到ＨＣＶ－ＲＮＡ；所有ＨＢＶ和ＨＣＶ阳性病例均为原发性肝细胞癌，而继发性肝细胞病例未能检出二种病毒核酸序列。本研究揭示我国引起ＨＣＣ发生的肝炎病毒以ＨＢＶ为主，ＨＣＶ也可能起到一定作用。     

应用聚合酶链反应进一步探讨原发性肝癌与HBV,HCV感染的关系

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测原发性肝癌（ＰＨＣ）及肝硬化（ＬＣ）患者血中ＨＢＶ－ＤＮＡ及ＨＣＶ－ＲＮＡ，同时检测血中乙肝５项标志及抗－ＨＣＶ。结果５６例ＰＨＣ中，ＨＢＶ５项标志阳性者４３例（７６．７８％），ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者４２例（７５．００％），两种方法联合应用阳性率为４９例（８７．５％）；其中３４例检测ＨＣＡ－ＲＮＡ阳性者８例（２３．５３％）。６２例ＬＣ中，ＨＢＶ５项标志阳性者３５例（５６．４５％），ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者３８例（６１．２９％），二者联合应用阳性数为４５例（７２．５８％），其中３４例检测ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性数为９例（２３．６８％）。ＰＨＣ组ＨＢＶ感染率显著高于ＬＣ组（Ｐ＜０．０５），ＨＣＶ感染率两组差异无显著性（Ｐ＜０．０５）。并对ＨＢＶ、ＨＣＶ感染与ＬＣ、ＰＨＣ的发生发展作进一步讨论。     

RIBA在慢性丙型病毒性肝炎中的应用价值

采用含ＨＣＶ三种抗原（Ｃ２２，Ｃ３３Ｃ，Ｃ１９０）的重级免疫印迹试验（ＲＩＢＡ）检测了７１例抗－ＨＣＶ阳性一（ＲＩＡ－２法）的慢性非甲非乙型肝炎患者血清并与ＨＣＶＲＮＡ结果进行比较。ＲＩＢＡ阳性５６例，可疑８例，对应ＨＣＶＲＮＡ检出率分别为９４．６４％（５３／５６）和３７．５％（３／８），ＲＩＢＡ阴性的７例均未检出ＨＣＶＲＮＡ。ＨＣＶＲＮＡ阳性病例中ＲＩＢＡ多为阳性，可疑仅占５．３６％（３／５６０     

逆转录巢式多聚酶链反应对输血后肝炎HCV核酸检测及临床意义

本文采用逆转录巢式多聚酶链反应等方法，对４９例输血后肝炎患者同时检测ＨＣＶ ＲＮＡ，ＨＢＶ ＤＮＡ及其有关血清学标志，结果显示：ＨＣＶ与ＨＢＶ感染率分别为８１．６％，３４．６％，其中双重感染者占２２．４％。抗－ＨＣＶ与ＨＣＶ ＲＮＡ符合率为７９．４％，抗－ＨＣＶ阴性患者中，４０％可检出ＨＣＶ ＲＮＡ，表明检测抗－ＨＣＶ对诊断排除ＨＣＶ感染有一定意义，但抗－ＨＣＶ阴性并不能排除ＨＣＶ感染。     

RT-PCR半定量法检测人脐静脉内皮细胞t-PA和PAI-1 mRNA表达

目的 建立一种敏感的检测组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）及其抑制剂（ＰＡＩ－１）基因表达的方法。方法 用异硫氰酶胍一步法提取细胞总ＲＮＡ。用单管ＲＴ＿ＰＣＲ法逆转录－扩增ｔ－ＰＡ、ＰＡＩ－１和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ，扩增产物经电泳分离后，用凝胶图像分析仪照相和扫描分析，测定各条带分子量和光密度值。结果 ＰＣＲ产物均与预期长度相吻合，且ＰＣＲ产一与扩增初始模板量之间存在良好的     

HCV体外感染正常成人肝细胞的研究

目的 为进一步研究丙型肝炎免疫发病机制，临床治疗和疫苗研制提供最接近自然感染状态的理想细胞模型。方法 体外二步灌流法分离正常成人肝细胞并维持培养1月以上，丙型肝炎患者血清感染上述肝细胞并用免疫组化和逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR法）检测被感染肝细胞HCV抗原表达及HCVRNA。结果 正常成人肝细胞可在体外存活1月以上，加丙肝患者血清4-36d后免疫组化法可检测到肝细胞内HCVNS3、NS5抗原表达，感染后2-36d，RT-PCR法可在感染肝细胞培养上清和细胞悬液中间断检测出HCVRNA。结论 正常成人肝细胞可在体外存活1月余并被HCV感染者血清感染。     

柯萨奇病毒B_3致病模型的建立

目的 :建立柯萨奇病毒 (CV)B3 的实验动物模型 ,以期为抗病毒药物筛选提供工具。方法 :雄性BALB/C鼠腹腔注射CVB3 后 ,观察小鼠发病症状 ,并在不同时间处死小鼠 ,取小鼠心、脾、肝、肾等组织进行病毒分离、病毒核酸检测、心肌组织病理检查。结果 :感染后第 3d小鼠即出现症状 ,第 5d在小鼠的心脏、脾脏、肾脏均可分离出感染性病毒 ,其滴度分别为 :10 4 .7,10 3.3 ,10 3.2 TCID50 / 0 .1ml,同时小鼠心、脾、肾、等组织及血清中CVB RNA检测为阳性 ,心肌组织出现典型炎性改变。结论 :雄性BALB/C鼠感染CVB3 后可引起病毒性心肌炎发生     

用RT-PCR技术检测石蜡包埋组织中的肠道病毒RNA

目的:应用逆转录PCR技术(RT-PCR)在石蜡包埋的心肌组织切片中检测肠道病毒(柯萨奇病毒B3,CVB3)RNA.方法:用Trizol法从石蜡包埋的心肌组织切片中提取CVB3RNA,用适当的引物合成cDNA第一链,从中取出适量进行聚合酶链反应(PCR).PCR结果用琼脂糖凝胶电泳检测并将PCR产物做核苷酸序列分析.阳性对照采用CVB3感染的人羊膜细胞.结果:用RT-PCR技术可扩增出一条约500 bp(540 bp)的核苷酸片段,测序结果表明是CVB3的一个片段.结论:RT-PCR技术应用于长期保存的石蜡包埋的组织切片进行肠道病毒的检测可获得较满意结果,可将RT-PCR技术用于回顾性研究.     

3种核酸提取方法检测甲型H1N1流感病毒的比较

目的选择常见的3种核酸提取方法,比较其对低拷贝数甲型H1N1流感病毒核酸检测的敏感性差异,为实验室应用和结果的评价提供依据。方法对已确定阳性的甲型H1N1流感病毒标本,作10^-1～10^-4系列稀释,选用Promega公司全自动核酸提取仪及配套试剂盒、QIAGEN公司Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒3种核酸提取方法提取上述标本核酸模板,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（荧光RT—PCR）对其进行评价。结果在对不同拷贝数流感病毒的检测中,3种核酸提取方法以Promega公司全自动核酸提取仪提取效率最高,以此提取效率作为100％,则QIAGEN Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒的平均提取效率依次为83．27％、55．70％。经方差分析,3种方法之间存在显著性差异（P〈0．05）。结论各试剂之间提取核酸的效率存在显著差异,建议根据实际情况采用合适的核酸提取试剂和方法。     

组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞

目的 探讨防止血管吻合口血栓栓塞的新方法,了解组织型纤溶酶原激活物基因疗法防止吻合口血栓栓塞的效果。方法 （1）将含有t-PA基因的重组质粒pAdCMVt-PA与缺陷型腺病毒大框架pJM17共转染病毒包装细胞293细胞,获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒AdCMVt-PA。（2）实验动物随机分为对照组和治疗组,均用11－0尼龙缝线行大鼠颈总动脉原位端端吻合,治疗组吻合口注射AdCMVt-PA溶液,对照组注射AdCMV(不含t-PA的空载体）,提取吻合口组织的总RNA行RT－PCR,应用发色底物法检测吻合口组织的纤溶酶活力。结果 治疗组RT－PCR在2．0kb前面有一条带,对照组则没有,治疗组术后第2,3,5,7和14日均可检测到纤溶酶活力,但第3日活力最高,对照组未检测到纤维溶酶活力,结论 克隆入 病毒载体的p-PA基因可在吻合口组织中表达出有生物学活性的t-PA,可能有效地抑制吻合口血栓形成,提高吻合口通畅率。     

聚合酶链反应技术诊断中枢神经系统肠道病毒感染

目的：探讨肠道病毒（ＥＶ）在中枢神经系统感染中的致病情况,建立一种检测ＥＶ感染的方法。方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和病毒分离技术检测４０种ＥＶ标准毒株和４６例无菌性脑膜炎、脑炎病人脑脊液（ＣＳＦ）标本。     

白细胞中血管紧张素原mRNA的定量分析

目的：检测白细胞中血管紧张素原（ＡＧＴ）ｍＲＮＡ的量。方法：提取总ＲＮＡ,进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交;应用ＲＴ－ＰＣＲ技术联合印迹杂交和同位素掺入法对微量ｍＲＮＡ检测。结果：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交显示肝细胞血管紧张素原ｍＲＮＡ有明显的杂交带,而白细胞无杂交信号。将ＲＴ－ＰＣＲ技术同印迹杂交或同位素掺入法联合应用能提高血管紧张素原微量ｍＲＮＡ检测灵敏度。结论：白细胞的ＡＧＴｍＲＮＡ量低于肝细胞;ＲＴ－ＰＣＲ联合印迹杂交或同位素掺入法是微量ｍＲＮＡ定量分析的有效方法。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。