人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的 构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.方法 提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2.将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21 (DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法).结果 成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2.结论 克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达.     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

GP73 融合蛋白原核表达及纯化

目的：原核表达并纯化高尔基体糖蛋白-73（GolgiProtein73,GP73）。方法以人肝癌细胞系HepG2总RNA为模板,经RT-PCR扩增GP73基因,克隆至原核表达载体pET-21a（＋）-TRX中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。His-tag磁珠纯化重组蛋白GP73,SDS-PAGE鉴定。结果克隆目的基因的序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）-TRX-GP73经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD,与预期相符。结论本实验成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了GP73重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人胎盘TRAIL基因的克隆和大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA，利用RT－PCR技术扩增了可溶性TRAIL（凋亡素配体2）基因片段。序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同。将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c( )上，构建表达质粒pET-28c( )TRAIL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得表达菌株BL－pET-28c( )TRAIL。表达菌经1mmol/L的IPTG诱导表达4h后，产生大量的重组人TRAIL蛋白，SDS－PAGE扫描计算机灰度分析表明，表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40％ 以上。     

东亚钳蝎BmK αIV基因的克隆、可溶性表达与纯化

目的通过pSYPU-1b原核表达载体表达东亚钳蝎BmKαIV并纯化。方法利用PCR技术从蝎尾cDNA中扩增BmKαIV基因,构建表达载体pSYPU-1b-rBmKαIV。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达。通过金属离子螯合亲和色谱和阳离子交换柱色谱法对重组蛋白进行分离纯化。结果成功克隆BmKαIV基因,SDS-PAGE显示重组蛋白以可溶性形式表达,通过两步色谱方法获得了含量质量分数为95%以上的样品。结论 BmKαIV通过pSYPU-1b载体实现可溶性表达并被纯化。     

蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

人胎盘TRAIL基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了可溶性TRAIL(凋亡素配体2)基因片段.序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同.将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c(+)上,构建表达质粒pET-28c(+)TRAIL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得表达菌株BL-pET-28c(+)TRAIL.表达菌经1 mmol/L的IPTG诱导表达4h后,产生大量的重组人TRAIL蛋白,SDS-PAGE扫描计算机灰度分析表明,表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40%以上.     

胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌.方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E-coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-TCMPK和pET28a(+)表达载体.连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定.用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析.结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6～0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显.结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础.     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及原核表达

目的构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（＋）-CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端氨基酸序列并据此设计引物,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增细胞毒素基因序列（CTXcDNA）。将CTXcDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（＋）中,双酶切图谱、PCR和DNA测序鉴定,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物,GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX;Western-blotting鉴定。结果成功合成CTXcDNA,并构建原核表达质粒pET42α（＋）/GST-CTX,在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的28.9%,Western-blotting证实纯化蛋白为重组CTX融合蛋白（rCTX）。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得rCTX具有眼镜蛇毒CTX的抗原性。