骨桥蛋白对大鼠小肠隐窝上皮细胞生物学性状的影响

 目的  观察骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对大鼠小肠隐窝上皮细胞(intestinal epithelial cells-6,IEC-6)分化、增殖、迁移等生物学性状的影响。方法  分别采用相差显微镜、细胞贴壁率检测、噻唑蓝比色法、划痕实验、Western blot和ELISA法,观察不同浓度OPN对IEC-6细胞增殖、分化和迁移能力的影响,并从鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)表达变化和炎性反应角度,探讨其可能的作用机制。结果  经不同浓度的OPN处理后,IEC-6细胞形态、贴壁率和增殖率均未见明显变化。OPN能促进IEC 6细胞的移行功能,且OPN浓度越高细胞迁移速度越快。与低浓度或高浓度OPN相比,适当浓度的OPN能促进IEC-6细胞内ODC1蛋白表达(0.1 μg/mL和1.0 μg/mL OPN)和细胞内炎性反应(0.05 μg/mL OPN)。结论  OPN能促进IEC-6细胞的移行功能,从而促进损伤黏膜早期修复,其机制可能与特定浓度的OPN能促进细胞内ODC1蛋白的表达和损伤IEC-6细胞的炎性反应有关。     

小肠隐窝细胞株药理实验方法的建立

目的：建立小肠隐窝细胞株（IEC-6）药理实验方法。方法：观察细胞接种密度、α-二氟甲基鸟氨酸（DFMO）和胃泌素对IEC-6细胞增殖及细胞鸟氨酸脱羧酶（ODC）的影响。结果：较高接种密度（〉0.5×10^4细胞/孔）组,接种后第2天,细胞生长抑制,尤其是密度增加到4×104细胞/孔时,第2~3天,OD值逐渐增加,第4天明显增加,第5天达高峰,此后OD值开始下降。而低密度（0.2×10^4细胞/孔）接种后第4天,细胞生长出现抑制,此后其生长与其他密度相似。加入DFMO后1~3天,完全抑制了细胞增殖,此后与空白组一样,细胞逐渐生长。DFMO还明显抑制IEC-6细胞分化和移行,以及ODC活性和腐胺含量,与空白组比较具有显著性差异（P〈0.01）。IEC-6细胞在胃泌素250μg·L^-1作用后第一天,开始增殖,第3天达高峰。胃泌素500μg·L^-1作用后第1~2天,细胞开始增殖,第3天以后,细胞增殖下降。胃泌素明显促进细胞分化和移行。与空白组比较,胃泌素250μg·L^-1分别使ODC m RNA水平,ODC活性,腐胺含量增加1.09倍（P〈0.05）,1.71倍（P〈0.01）和5.30倍（P〈0.01）。同样,胃泌素500μg·L^-1可使以上3项指标分别升高1.16倍（P〈0.05）,1.63倍（P〈0.05）和4.41倍（P〈0.01）。但胃泌素两个剂量组之间无显著性差异。结论：IEC-6细胞是进行胃肠粘膜修复药理实验的合适细胞模型。     

党参对应激性溃疡和细胞迁移及多胺的影响

[目的]探讨益气健脾中药党参对胃肠黏膜损伤修复的药效机理及物质基础.[方法]在水浸束缚应激性溃疡大鼠模型上观察党参水提液对胃肠黏膜损伤修复的作用;在小肠上皮细胞(IEC-6)上观察党参糖提取物对细胞迁移和多胺含量的影响.采用划痕法复制细胞迁移模型,柱前衍生—高效液相色谱法检测多胺含量.[结果]党参水提液能减轻应激性溃疡大鼠胃黏膜损伤,减轻病理损害,提高胃黏膜多胺(精脒)含量.党参糖提取物能促进IEC-6细胞迁移,逆转由二氟甲基鸟氨酸(DFMO)或4-氨基吡啶(4-AP)所致的细胞迁移抑制,并提高细胞迁移过程中细胞内多胺(精脒)含量;同时,可逆转由DFMO所致的多胺(精脒)含量降低.[结论]党参的胃肠黏膜损伤修复作用机制可能与其促进上皮细胞迁移,作用于多胺调控信号通路有关.     

N-乙酰半胱氨酸对辐照引起的大鼠肠隐窝上皮细胞损伤的减轻作用

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对辐照引起的肠隐窝上皮细胞IEC-6的损伤的防护作用及可能机制。方法将IEC-6细胞分为3组:正常组(无辐照),辐照组(6 Gy辐照)和NAC治疗组(6 Gy辐照+NAC 10 mg/mL)。IEC-6细胞辐射损伤模型采用总剂量为6 Gy的钴-60照射,用DCFH-DA测定细胞内的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力,用Annexin V-FITC和碘化丙啶进行细胞凋亡的检测,同时用Hoechst 33342进行细胞凋亡的检测,同时进一步检测IEC-6细胞的增殖能力。结果 NAC减少了辐照引起的ROS和MDA的过量产生以及SOD的过度消耗,同时流式细胞仪和核染色的结果显示,NAC抑制了辐照引起的细胞凋亡和增殖活力的下降。结论 NAC可以减轻辐照引起的IEC-6细胞的损伤。     

The therapeutic efficacy of N-acetylcysteine on γ-radiation-induced intestinal epithelial cell damage in rats.

目的 研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对辐照引起的肠隐窝上皮细胞IEC-6的损伤的防护作用及可能机制.方法 将IEC-6细胞分为3组:正常组(无辐照),辐照组(6 Gy辐照)和NAC治疗组(6 Gy辐照+NAC 10 mg/mL).IEC-6细胞辐射损伤模型采用总剂量为6 Gy的钴-60照射,用DCFH-DA测定细胞内的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力,用Annexin V-FITC和碘化丙啶进行细胞凋亡的检测,同时用Hoechst 33342进行细胞凋亡的检测,同时进一步检测IEC-6细胞的增殖能力.结果 NAC减少了辐照引起的ROS和MDA的过量产生以及SOD的过度消耗,同时流式细胞仪和核染色的结果显示,NAC抑制了辐照引起的细胞凋亡和增殖活力的下降.结论 NAC可以减轻辐照引起的IEC-6细胞的损伤.     

牛奶消化前后外泌体的变化及其对细胞增殖的影响

目的 探究超速离心法获取牛奶外泌体的最适离心力,探讨牛奶外泌体在体外消化模型中的稳定性及消化后的牛奶外泌体对大鼠肠隐窝上皮细胞IEC-6增殖的影响。方法 用体外消化模型消化牛奶,不同离心力超速离心分离牛奶外泌体,用Western印迹法、动态光散射、扫描电镜对消化前后获取的外泌体进行表征,CCK8实验分析外泌体对细胞增殖的影响。结果 牛奶消化后外泌体蛋白浓度明显降低,外泌体标记蛋白CD63和CD9在消化前后的分离产物中均为阳性。消化后的外泌体粒径大于未消化组,且粒径随离心力的升高而降低。扫描电镜下观察,消化前后的牛奶外泌体形态差别不大。用50μg/mL外泌体培养IEC-6细胞,结果显示牛奶消化前后的外泌体均对IEC-6细胞的增殖有促进作用,消化后离心(130000×g)获得的外泌体对细胞增殖的促进作用较为明显。结论 130000×g是获取牛奶外泌体的最适离心力。牛奶消化前后的外泌体在标记蛋白、形态上相似,表明牛奶中的外泌体能耐受体外消化模型的消化,牛奶消化后的外泌体仍能促进IEC-6细胞的增殖。     

隐丹参酮对乳腺癌MD A-MB-231细胞自噬和侵袭迁移的影响

目的：：研究隐丹参酮对乳腺癌 MDA-MB-231细胞自噬、增殖和侵袭迁移的作用,初步探讨其抗肿瘤的作用机制。方法：用不同浓度隐丹参酮处理 MDA-MB-231细胞24,48和72 h,MTT 法检测细胞活性,计算24 h 半数抑制浓度(IC50);20μmol/L隐丹参酮处理细胞24 h,吖啶橙染色检测细胞酸性自噬囊泡;Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ(微管相关蛋白1轻链3)及Beclin 1的表达;Transwell小室观察细胞侵袭力;划痕实验检测细胞迁移力。结果：隐丹参酮呈时间-浓度依赖性抑制 MDA-MB-231细胞增殖(P<0.05);与未加药组相比,隐丹参酮处理组细胞酸性自噬囊泡增多,Beclin 1蛋白表达增多且 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值增高(P<0.05);transwll小室及划痕实验发现,经隐丹参酮处理的 MDA-MB-231细胞穿膜数及迁移数均较未加药组少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：隐丹参酮可诱导乳腺癌 MDA-MB-231细胞自噬,从而抑制其增殖和侵袭迁移的潜能。     

黄芩苷对脂多糖诱导的肠道上皮细胞凋亡及迁移能力的影响

【目的】探讨黄芩苷对脂多糖（LPS）诱导的IEC-6细胞凋亡及迁移能力的影响。【方法】以LPS诱导IEC-6细胞建立细胞损伤模型,采用四甲基偶唑盐（MTT）法和酶联免疫吸附（ELISA）法试剂盒分别检测LPS对IEC-6增殖及分泌炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的影响;应用Hoechst 33258染色和流式细胞术观察和分析黄芩苷低、中、高剂量组（剂量分别为2.5、5.0、10.0μg／mL）对LPS诱导的IEC-6细胞核凋亡形态学改变及凋亡率的影响;应用细胞划痕实验检测黄芩苷对LPS诱导的IEC-6细胞迁移能力的影响。【结果】与对照组比较,1.0μg/mL LPS组IEC-6细胞生存率显著降低, TNF-α、 IL-6分泌量及细胞凋亡率显著增加,细胞迁移能力显著下降（均P<0.05）;与模型组比较,黄芩苷低、中、高剂量组凋亡细胞均不同程度减少,高剂量组细胞凋亡率显著降低（P<0.05）,细胞迁移显著提高（均P<0.01）。【结论】黄芩苷可抑制LPS诱导的肠道上皮细胞的凋亡,并能提高其迁移能力。     

Rho鸟苷三磷酸酶调节细胞迁移中细胞骨架结构的研究进展

细胞迁移是胃肠黏膜损伤修复的重要步骤,胃肠黏膜损伤修复是益气健脾中药的作用机理之一.细胞迁移与细胞骨架的动态变化密切相关.Rho鸟苷三磷酸酶(Rho GTPases)对细胞骨架动态变化的调节有重要作用.通过综述细胞迁移中细胞骨架(微管、肌动蛋白丝、中间丝状体)所发生的动态变化和Rho GTPases调控细胞骨架的分子机制,以期为益气健脾中药治疗脾胃病的分子机理研究提供新思路,也为中医药胃黏膜保护机制研究提供参考.     

EGF 对前列腺细胞中鸟氨酸脱羧酶基因表达的调控

目的 :探讨EGF诱导前列腺增殖的分子机理。方法 :以MTT法测定不同浓度表皮生长因子(EGF)对前列腺癌细胞PC 3的促增殖作用 ;以最适浓度EGF(5 0ng/ml)刺激该细胞 ,分别于 0、1、3、6、12、2 4h提取总RNA ,用斑点杂交法分析测定各组细胞中ODCmRNA丰度 ;用免疫组化及流式细胞术两种方法检测EGF刺激细胞后ODC蛋白表达量的变化。结果 :①EGF能促进PC 3细胞的增殖 ,而且随着EGF浓度的升高 ,细胞增殖活性增加 ;②斑点杂交显示 ,EGF刺激细胞后 3h ,ODCmRNA开始明显升高 ,12h达高峰 (约为 0h的 3.6 6倍 ) ,至 2 4h时有所降低 ;③免疫组化及流式细胞术检测显示 ,EGF刺激细胞 3d后ODC蛋白阳性细胞表达率明显升高。结论 :EGF诱导ODC基因表达可能是其促进前列腺细胞增殖的分子机制之一     

健脾益气固摄法治疗肾移植术后腹水外渗的初步临床观察

[目的]研究健脾益气固摄法治疗肾移植术后腹水外渗的临床疗效及不良反应。[方法]将14例行肾移植术5 d后肾周引流液仍持续增多的患者,采用随机数字表法按1:1随机分为治疗组及对照组,每组各7例。治疗组除补充白蛋白外, 并予健脾固摄中药(太子参、黄芪、茯苓、白术、淮山、扁豆、神曲、牡蛎)进行治疗,每天两剂,疗程1周;对照组仅予补充白蛋白治疗。以每天引流液量、引流液持续时间和血浆白蛋白、总蛋白含量作为临床疗效评价指标,以急性排斥发生率、肝肾功能指标、环孢素A(CsA)血浓度谷值作为不良反应评价指标。[结果]治疗组的每天引流液量、引流液持续时间与对照组相比明显减少,差异具有非常显著性意义(P<0.01),而两组血浆白蛋白、总蛋白含量无显著性差异(P> 0.05)。两组的急性排斥发生率、肝肾功能指标、CsA血浓度谷值均无显著性差异(P>0.05)。[结论]健脾益气固摄法能有效地减少每天引流液量及缩短引流液持续时间,且无肝肾功能损害及增加急性排斥发生率等不良反应。     

补中法、升阳法、补中升阳法对脾气虚模型补气健脾作用的研究

目的:观察补中法、升阳法、补中升阳法对脾气虚模型的补气健脾作用,研究风药与补气健脾药配伍的增效作用.方法:健康Wistar大鼠随机分组,即对照组、脾气虚证模型组、治疗组(包括补中组、升阳组、补中升阳组),观察各组模型的一般情况.测定其血清D-木糖吸收率、红细胞计数、血红蛋白、血清总蛋白、血清白蛋白的量,并观察其含量变化.结果:经补中方、补中升阳方治疗后一般情况与造模组相比有显著统计学意义(P<0.01);各组大鼠血清D-木糖吸收率检测值的变化:补中组、补中升阳组能使指标有明显改善,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01),且补中升阳组的作用优于单纯的补中组(P<0.05);红细胞计数、血红蛋白、血浆总蛋白、血浆白蛋白含量均有不同程度的上升;补中组、补中升阳组能使指标有明显改善,与造模组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:①补中法、补中升阳法对脾气虚证大鼠的消化系统功能的减弱,以及血常规、血生化改变有一定的改善作用,其中一部分指标补中升阳法优于补中法,升阳法对此无明显作用.②风药与补气药配伍,具有一定的增效补气健脾的作用.     

基于斑马鱼模型的26种常见骨伤科中药材的毒性筛选

目的?利用斑马鱼毒性模型评价26种常见伤科中药材的安全性。方法?将受精后1d（1dpf）的健康斑马鱼胚胎置于不同浓度药味水煎液中,观察记录给药后1~5d的死亡情况,显微检视3dpf或以后斑马鱼幼鱼的形态,同时设置0.4%DMSO溶媒对照组。用SPSS16.0计算不同药味水煎液在6dpf的鱼半数致死浓度LC₅₀。结果?13种药味（续断、知母、乳香加没药、补骨脂、独活、牛膝、制何首乌、蛇床子、木香、土鳖虫、淫羊藿和五加皮）水煎液致斑马幼鱼脏器形态明显改变,毒性主要表现为卵黄囊肿大、变形、变黑,心包水肿、出血等,且它们的鱼LC₅₀值较低（16.9~689.7μg/mL）。其余13种药味（鹿衔草、千年健、苏木、巴戟天、龟甲、骨碎补、丹参、狗脊、桑寄生、鸡血藤、熟地黄、女贞子、杜仲）,未见鱼脏器毒性,且致鱼死亡浓度高（在2000μg/mL以上）,较安全。结论?用斑马鱼模型成功的筛选了26种常见骨伤科中药的毒性,为骨伤科中药临床合理应用提供参考。斑马鱼模型具有简单、高效、实时动态的优势,使中药在体毒性规模化筛选成为可能。      

不同浓度腐胺对人皮肤成纤维细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的探讨不同浓度腐胺对人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts,HSF）增殖、迁移、凋亡的影响。方法将体外HSF
分为腐胺组和对照组,以含腐胺浓度分别为0.5、1、5、10、50、100、500、1000 μg/ml完全培养基培养细胞设为腐胺组,不添加腐胺
设为对照组。经对照组及不同浓度腐胺组处理的HSF培养24 h后,再以四唑化合物电子耦联显色法（MTS法）测定细胞增殖能
力（用吸光度值表示）,Transwell迁移实验测定细胞的迁移能力,流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM）Annexin V/PI标记法测
定细胞凋亡率。结果（1）细胞增殖能力（MTS）测定结果显示,0.5、1、5、10 μg/ml 腐胺组HSF的吸光度值较对照组升高（P<
0.01）,并且1 μg/ml时达峰值（0.754±0.024）;500、1000 μg/ml腐胺组HSF吸光度值较对照组降低（P<0.01）;50、100 μg/ml腐胺
组HSF的吸光度值与对照组无明显差异（P>0.05）;（2）Transwell迁移实验结果显示,1 μg/ml腐胺组穿过微孔膜的细胞数目较对
照组显著增加（P<0.01）,且达到峰值309±21;50 μg/ml及以上浓度腐胺组HSF穿过微孔膜的数目较对照组减少（P<0.05）;0.5、
5、10 μg/ml腐胺组HSF穿过微孔膜的细胞数目与对照组比较无明显差异（P>0.05）;（3）流式细胞凋亡结果显示,0.5、1、5、10 μg/ml
腐胺组HSF凋亡率较对照组显著降低（P<0.05）,而且在1 μg/ml时细胞凋亡率达最低值（11.10±0.79）%;100 μg/ml及以上浓度
腐胺组细胞凋亡率较对照组显著升高（P<0.01）,而且随着浓度增加凋亡率逐渐升高;50 μg/ml腐胺组与对照组比较细胞凋亡率
无明显差异（P>0.05）。结论微量腐胺可维持细胞正常的迁移能力,显著提高HSF的细胞增殖能力,而较高浓度的腐胺能显著
抑制HSF迁移与增殖,并诱导细胞发生凋亡,提示不同浓度的腐胺会对创面愈合起到完全不同的作用。
     

基于疾病中医证候分类的中药药效评价研究思路和方法

中药的临床应用建立在辨证的基础上,因此其药效评价也应该建立在中医证候分类的基础之上。通过药效学实验阐明中药治疗疾病的药效作用特点及其机制,揭示中药作用机制的科学内涵,是中药现代化和国际化的必然要求,也是探索药物作用靶点,指导临床合理用药的关键所在。如何利用成熟疾病动物模型,并明确其证候特征,是中药药效评价载体研究的关键问题。随着生物医学的发展,通过研究疾病动物模型的生物学指标有可能分析得出该疾病动物模型的证候特性。利用以方测证方法,建立针对该疾病常见证候类型且临床验证有效的中药干预疾病动物模型,并将治疗有效的动物作为体现相应证候特征的动物模型,通过探寻其现代生物学基础,确立相应的中医证候特征相关指标,从而明确疾病动物模型的证候特征,是建立适合辨证论治中药药效评价动物模型的重要途径。建立基于中医证候分类的中药药效评价研究方法,将有助于从中医理论出发提高我国中药研发水平。     

天津地区近10年慢性充血性心力衰竭中医用药情况分析*

[目的]研究天津地区近10年来治疗慢性充血性心力衰竭(简称心衰)中医中药规律。[方法]近10年来天津地区中医药治疗心衰临床研究方面文献资料的回顾性总结,从中医药治疗心衰总体用药规律、组方用药规律和辨证用药规律等3个方面加以分析。[结果]1)总体用药规律:用药类别由高到低依次为补虚药、活血化瘀药、利水渗湿药;常用中药依次为丹参、黄芪、茯苓等。2)组方用药规律:用药类别由高到低也同样为补虚药、活血化瘀药、利水渗湿药;常用中药依次为茯苓、党参、当归等。3)常见中医证型和药物依次是:气虚血瘀型:当归、白芍、川芎、桃仁、红花、黄芪、人参等;阳虚水泛型:茯苓、白芍、生姜、白术、附子、人参。[结论]近10年天津地区中医心衰主要从瘀、虚、湿辨证论治。     

吲哚胺2, 3-双加氧酶1对急性放射性肠道损伤的保护作用

目的：探讨吲哚胺2, 3-双加氧酶1（IDO1）对急性放射性肠道损伤的作用。方法：使用TCGA和GTEX数据集中结肠癌、直肠癌组织和正常对照组织的测序结果,分析IDO1基因在肠癌组织及正常肠道组织中的表达情况。使用CRISPR/Cas9技术敲除鼠正常肠上皮IEC-6细胞中IDO1基因的部分第2、3外显子序列,建立鼠IEC-6的IDO1 KO（IDO1-/-）细胞系,并给予两个细胞系（野生型和IDO1-/-）放射处理。C57BL/6野生型小鼠和IDO1基因敲除（IDO1-/-）小鼠也给予腹部X射线照射以建立细胞和动物急性放射性肠道损伤模型。使用蛋白质印记法（Western blot）检测野生型和IDO1-/-的IEC-6细胞及小鼠肠道组织中上皮紧密连接蛋白在放射前、后的蛋白表达水平。结果：Western blot证实IDO1在鼠IEC-6细胞、肠道组织中均有表达。对TCGA和GTEX数据集分析后也同样看到IDO1基因在结肠癌、直肠癌、正常肠道组织中均有表达,但癌组织中IDO1水平较正常肠道组织高（P ＜0.05）。体内外的放射照射后,IDO1、Claudin 1、Occludin、ZO-1等出现明显变化：与放射前比,放射后的细胞和小鼠组织中的IDO1的表达水平升高（P ＜0.05）,而紧密连接蛋白Claudin 1、Occludin、ZO-1则下降（P ＜0.05）;与野生型IEC-6细胞和小鼠相比,在IDO1-/- IEC-6细胞和小鼠肠组织中,Claudin 1、Occludin、ZO-1 下降更显著（P ＜0.05）。结论：IDO1在急性放射性肠道损伤中起保护作用,其保护作用可能是通过保护肠上皮细胞间紧密连接功能而实现的。     

应用数据挖掘技术筛选的抗癌中药对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移的影响

【目的】基于数据挖掘技术筛选具有较明显抑制三阴性乳腺癌作用的中药。【方法】收集近15年关于乳腺癌中医治疗的有效文献,采用频次和聚类分析确定高频中药,制备其含药血清,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和Transwell小室侵袭、迁移实验,分别观察各高频中药含药血清作用三阴性乳腺癌细胞(MDB-MB-231)12、24 h后细胞增殖、迁移和侵袭能力变化。【结果】筛选出的高频使用中药为川芎、蒲公英、白花蛇舌草、天花粉、牛膝。这5种中药的含药血清对MDB-MB-231细胞的增殖能力均具有不同程度的抑制作用,其中蒲公英、白花蛇舌草、牛膝对MDB-MB-231细胞迁移能力具有较强的抑制作用,蒲公英、川芎、白花蛇舌草对MDB-MB-231细胞侵袭能力具有明显抑制作用。【结论】运用数据挖掘技术得到的高频中药川芎、蒲公英、白花蛇舌草、天花粉、牛膝等具有明显的抑制三阴性乳腺癌作用。