激光捕获显微切割联合基因芯片在肿瘤差异表达基因研究中的应用

 目的 为激光捕获显微切割（LCM）联合基因芯片在肿瘤差异表达基因研究中应用摸索可行的技术方法。方法 采用 LCM 技术分别自原发性膀胱移行癌患者手术切除的癌组织和癌旁正常组织冻存标本获取细胞，提取 RNA，用 Agilent 2100 Bioanalyzer 芯片分析系统进行 RNA 完整度（RIN）检测。取总 RNA 100 ng 进行线性扩增和荧光标记，获得 aRNA 探针。取等量的癌组织探针与癌旁正常组织探针，与 Agilent 人全基因组寡核苷酸基因表达谱芯片杂交。通过自身比较实验分析芯片的假阳性基因数，计算假阳性率（FPR）。通过数据分析寻找癌组织与癌旁正常组织差异表达基因。 结果 LCM 所获微量 RNA 的 RIN 都在 8.0 以上，表明LCM 后 RNA 完整度较高。100 ng RNA 经过线性扩增与荧光标记，获 aRNA 产量约 16 µg，片段大小 0.5 ~ 2.5 kb。芯片自身比较实验结果良好，FPR < 1%，验证了实验系统的可靠性。相对于癌旁正常组织，癌组织发生表达上调的基因有 286 条，下调的基因 112 条。 结论 以 LCM 技术获得的细胞提取 RNA 用于制备基因芯片探针，获得了可信的芯片杂交结果，为肿瘤基因差异表达研究提供了可行的技术方法。     

胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的制备和初步应用(英文)

目的：研究胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的构建及其在检测胰腺癌基因表达谱方面的应用。方法：有目的地筛选胰腺癌相关基因，采用合成后点样的方法将合成的寡核苷酸探针点于同型双功能偶联剂（APS-PDC）包被的基片上，制成寡核苷酸基因芯片。Trizol法抽提组织总RNA，并用Qiagen Rneasy kit 进一步纯化。在cDNA第1链合成过程中，通过反转录酶将CyDye标记核苷酸直接渗入到cDNA中制备荧光探针，其中用Cy3-dCTP标记胰腺癌组织，Cy5-dCTP标记正常胰腺组织。将荧光标记探针定量后与芯片杂交16-18 h。用Agilent 扫描仪进行扫描，Imagene3.0软件（Biodiscovery,Inc.）图像分析，计算2种荧光Cy3 与Cy5信号强度的比值。挑选差异基因CDC25B和TUSC3进行荧光定量PUR（Sybrgreen方法）验证，以B-actin基因为内参照基因，PCR产物的定量方法采用比较Ct法。结果：芯片杂交扫描图像信号清晰，具有较低的整体背景和较高的信噪比，各阳性质控点信号均匀一致，阴性质控点和空白点信号低。与正常组织相比，胰腺癌组织中差异表达基因24条，占全部基因的25.5%，其中上调基因17条（占18.1%），下调基因7条（占7.4%）。荧光定量PCR验证，CDC25B和TUSC3基因在胰腺癌中的表达分别为上调和下调，其表达趋势与芯片实验的结果一致。结论：制备的胰腺癌相关基因芯片，可同时、并行检测多种胰腺癌相关基因的表达改变，具有一定的特异性和灵敏性。胰腺癌组织与正常胰腺组织相比，基因表达谱具有明显的差异，为进一步研究胰腺癌的发病机理和早期诊断提供了有用的信息。     

肠型胃癌不同发展阶段基因表达谱分析

目的研究肠型胃癌不同发展阶段基因表达谱的改变。方法应用基因芯片技术对3例肠型胃癌不同发展阶段基因表达特征进行检测分析。基因芯片包括576个cDNA克隆，其中包括506个靶克隆，51个是本课题组前期工作经消减杂交得到的克隆，另外455个克隆则根据它们在肿瘤中的作用而选取。应用Cluster和TreeView软件进行聚类分析，研究各种基因与胃癌发生发展不同阶段的关系。结果经基因芯片技术分析得到了181个差异表达基因，至少在胃癌发生发展的一个阶段其Cy5：Cy3的比值大于2或者小于0．5。其中48个基因上调，133个基因下调。聚类分析将差异表达基因分成了5个特征性的组，反映了不同阶段的基因表达特征。同时发现一些重要的差异表达基因，SEC23IP、LIPF、EST（BQ291520）、SLC5A1、PG、CXCR4、DICER1、SH3GL2以及IGF2R等。结论认识并发现了胃癌差异基因表达特征以及一些重要基因，对肠型胃癌发生发展及转移的进一步研究将具有重要作用。     

mRNA差异显示技术对环境诱发系统性红斑狼疮基因表达谱改变的研究

目的 比较环境因素诱发系统性红斑狼疮患者(SLE)与健康人外周血单个核细胞基因表达水平的差异.方法 选择5例无家族发病案例的SLE患者与5例健康人外周血单个核细胞,提取总RNA进行扩增、Cy3染色后,与Agilcnt 4X44K人全基因组芯片杂交,筛选差异表达基因进行基因实体(GO)分析和信息通路(pathway)分析.以qRT-PCR验证芯片结果.结果 5例SLE患者共同有2435个相对于健康人的差异基因表达(判断值=2.0).GO分析结果表明,生物过程中差异表达基因占32.08%(512/1596),其他比例较高的有细胞过程、生物调控、细胞代谢等;分子功能中差异表达基因占34.09%(544/1596),其较高比例依次为结合、催化活性、传感活性和转录调节活性;细胞组分方面差异表达基因33.83%(540/1596),主要涉及细胞与细胞部分两方面,其次为细胞器.Pathway分析显示免疫系统信号及B细胞受体通道中各有12个基因的表达发生了差异性改变,而T细胞受体、表皮生长因子受体1、IL-12介导的信号等通道均有10个基因表达明显差异.分析发现SLE患者在炎性反应与自身免疫相关基因方面有45个基因发生明显改变,其中11个上调,34个下调;细胞外基质和黏附分子方面有5个相关基因改变其中5个上调,1个下凋.qRT-PCR结果与芯片结果比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 5例无家族发病案例的SLE患者与健康人外周血单个核细胞基因表达水平存在明显的差异.     

Analysis of differentially expressed genes in early- and late-stage APPsw-transgenic and normal mice using cDNA microarray

The complexity of Alzheimer's disease (AD) has made it difficult to examine its underlying mechanism. A gene microarray offers a solution to the complexity through a parallel analysis of most of the genes expressed in the brains from AD-transgenic mice. In our previous study, a total of 52 differentially expressed genes were identified in 18-month-old APPsw-transgenic mice compared to age-matched normal mice. We extended our work to better understand the relevant gene profiles from both early- and late-stage transgenic and normal mice. To accomplish this, cDNA microarray was used with the large-scale screening of the brain mRNA from transgenic and normal mice of 1 and 18 months of age. We identified a total of 48 genes, 6 up-regulated and 42 down-regulated, differentially expressed with a significant degree of induction and reduction in the brains from moderate 18-month-old transgenic mice compared to 1-month-old transgenic mice. In parallel, a total of 40 differentially expressed genes, 6 up-regulated and 34 down-regulated, were also found in the brains from moderate 18-month-old normal mice compared to 1-month-old normal mice. Thus, differentially expressed genes upon APPsw overexpression and the aging process are useful targets through which investigators can choose genes of particular interest. In the future, it will be necessary to study the function of differentially expressed genes, which are targets for developing drugs, using pharmacoproteomics.     

联合应用激光捕获显微切割与基因芯片技术筛选肝细胞癌差异表达基因

目的 联合应用激光捕获显微切割与基因芯片技术构建纯化肝细胞癌(HCC)组织和正常肝组织基因表达谱,筛选HCC发病相关基因.方法 4例HCC标本先行激光捕获显微切割,分别获取纯化肝癌细胞和正常肝细胞各4对样本.提取微量RNA,经线性扩增后再与全基因组基因芯片杂交,筛选差异表达基因.结果 4对样本间纯化肝癌细胞与正常肝细胞共同差异表达的基因有1361条,上调基因607条,下调基因754条.前10位显著上调和下调的差异表达基因(共20条)中,5条为HCC已知差异表达基因(信号比值为23.2529、27.372 9、0.014 8、0.019 7、0.019 8);11条表达变化与其他肿瘤研究报道一致(信号比值为32.694 9、28.480 9、23.703 0、21.342 3、19.109 3、17.291 9、0.009 8、0.012 5、0.015 8、0.016 1、0.016 5);4条为在HCC和(或)其他肿瘤中均无报道过的差异表达基因(信号比值为24.676 1、22.072 2、0.009 7、0.019 1).结论 联合应用激光捕获显微切割与基因芯片技术,可准确、高效地筛选出HCC差异表达基因.     

应用基因芯片筛选人肝癌、肝硬化及正常肝组织中差异表达的基因

目的探讨肝细胞癌、肝硬化及正常肝组织中差异表达的基因并对其进行生物学信息分析。方法用Trizol一步法提取肝癌组织、肝硬化组织及正常肝组织的总RNA。并纯化mRNA,反转录合成荧光分子(Cy3/cy5)标记的cDNA探针,与含有4096个基因的芯片杂交;用Gene Pix Pro3.0图像分析软件分析肝硬化组织与正常肝组织,肝癌组织与正常肝组织的基因表达情况。结果与肝癌关系密切的基因有141条,许多与细胞周期和信号转导方面有关,如MCM7、YWHAH等。其中23条与在肝硬化组织中的表达趋势相同。与正常肝组织比较,有2条基因在癌组织中下调而在肝硬化组织中上调,均属于金属硫蛋白基因家族成员。结论在肝癌的发生、发展中,抑癌基因的失活、代谢相关酶类基因活性的异常及促使细胞进入增殖周期的相关基因的活化等因素发挥了重要的作用。系统的研究这些基因将有望发现新的早期诊断指标,为建立个体化治疗方案和预后评估系统提供帮助。     

Differential gene expression profiling of aggressive and nonaggressive follicular carcinomas

The classification of follicular thyroid neoplasms requires surgical resection for histologic evaluation of malignancy. Because variable clinical behavior exists, genomic expression profiling may lead to the identification of novel markers that facilitate better biologic classification. We performed for the first time gene expression analysis on clinically aggressive and nonaggressive follicular carcinomas (FCs) from patients for whom long-term follow-up data were available. We examined matched fresh-frozen tissue from 15 histopathologically diagnosed follicular carcinomas (7 patients with documented distant metastasis and/or death from disease and 8 patients without recurrence). For categorical comparison, we analyzed 4 follicular adenomas (FAs). The biologic control comprised 11 normal thyroid tissue specimens. High-quality RNA was extracted from the tissues, labeled, and hybridized to an Affymetrix (Santa Clara, CA) oligonucleotide microarray (HG-U133A). With the exceptions of 1 follicular adenoma and 1 follicular carcinoma, unsupervised hierarchical cluster analysis revealed 2 distinct groups--one containing normal thyroid tissue and follicular adenomas and another containing follicular carcinomas. We identified 421 genes that were differentially expressed between histologically normal thyroid tissues and all follicular neoplasms (P < 0.01; fold-change >2), 94 genes that distinguished follicular carcinomas from follicular adenomas (including PBP and CKS2), and 4 genes that distinguished aggressive follicular carcinomas from nonaggressive follicular carcinomas (NID2, TM7SF2, TRIM2, and GLTSCR2). Comparative genomic groupings identified differentially expressed genes that may lead to better classification of follicular thyroid neoplasms. Such genes may be used in future prospective validation studies to establish clinically useful and complementary diagnostic markers.     

应用基因芯片技术对Graves病免疫相关基因的研究

应用基因芯片技术研究Graves病 (GD )和正常成人甲状腺组织免疫相关基因的差异表达。分别用Cy5和Cy3两种不同的荧光染料通过逆转录反应将GD组和对照组甲状腺组织的mRNA分别标记成探针 ,并与载有一组靶基因的基因表达谱芯片进行杂交。通过扫描荧光强度 ,计算机软件分析 ,寻找两组差异表达基因。GD组和正常对照组之间共筛选出 80条差异表达基因 ,其中表达增加的基因有 31条 (2 0倍以上 ) ,表达降低的基因有 4 9条 (0 5倍以下 )。基因表达谱芯片筛选GD与正常成人甲状腺组织差异表达基因具有样品用量少、高速度、高敏感、高通量等特性。通过筛选所得差异基因提示GD的发病涉及细胞因子、受体信号转导等多个方面 ,为进一步阐明GD的发病机制提供新线索。     

力生长因子E肽与应力刺激对成骨细胞基因表达的影响

目的应用基因芯片技术分析在力生长因子E肽(MGF-Ct24E)和应力作用下成骨细胞基因表达的差异。方法体外培养原代成骨细胞,分别对细胞施加周期性拉伸刺激(应变12%,频率0.5 Hz)和MGF-Ct24E(50 mg/L)直接作用,基因芯片技术分析力学刺激和MGF-Ct24E作用对原代成骨细胞基因表达谱的影响,并用定量PCR验证基因芯片实验结果。结果与对照组相比,力学加载组共发现差异表达基因1 866个,其中上调基因1 113个,下调基因753个;MGF-Ct24E处理组共发现差异表达基因1 178个,其中上调基因796个,下调基因382个。GO分析发现两者的差异基因表达谱具有一致性,并且差异表达基因主要涉及细胞增殖与分化调节、细胞对应力刺激的响应和力学转导通路等。定量PCR实验结果验证的差异表达基因与芯片实验结果一致。结论基因表达谱分析显示应力刺激和MGF-Ct24E作用对成骨细胞的基因表达具有类似的调控效应,为后续使用MGF-Ct24E治疗骨修复以弥补应力刺激不足的研究提供了新的思路。     

An evaluation of linear RNA amplification in cDNA microarray gene expression analysis

DNA microarray is becoming a common tool across a broad range of disciplines, particularly in the basic and clinical biomedical sciences. However, the limitation of this technology is the requirement for relatively large amount of RNA for labeling and hybridization. T7-based linear amplification technique can overcome this limitation and enables consumption of very low amount of samples. In this study, we utilized a low RNA input fluorescent linear amplification kit from Agilent to amplify 0.2mug total RNA and compared the gene expression profiles generated from amplified aRNA and total RNA. Our results demonstrated that nanograms total RNA can be amplified reproducibly with this protocol and can generate gene expression profiles comparable with unamplified total RNA. Furthermore, quantitative real-time PCR measurements of a set of 10 genes showed good correlation with amplified aRNA arrays.     

寡聚核苷酸微阵列技术应用于脉动流剪应力作用下人体动脉平滑肌细胞基因差异表达的研究

采用本实验室自行设计和研制的 Flow Cham ber血液流动剪切装置 ,从细胞生物力学的角度 ,采用寡聚核苷酸微阵列技术 ,探讨人体脐动脉平滑肌细胞 (VSMC)在脉动流剪应力作用下的基因差异性表达 ,以及相关基因表达的调控 ;比较脉动流和定常流两种剪应力作用下 VSMC基因表达的差异。通过提取细胞总 RNA ,逆转录合成单链 c DNA,双链 c DNA,体外转录合成生物素标记的 c DNA与基因进行芯片杂交 ,经抗体的检测标记荧光染料Cy3,用基因芯片扫描仪进行基因芯片的图像扫描。结果发现 ,与对照组比较 ,经脉动流剪应力作用后 ,血管平滑肌细胞有 1330个基因出现差异表达 ;经定常流剪应力作用后 ,与对照组比较 ,有 2 6 76个基因出现差异表达 ;比较定常流和脉动流两组的血管平滑肌细胞基因 ,有 2 2 97个基因存在表达差异。实验表明 ,近生理状态的脉动流与定常流两种剪应力 ,对体外培养的人体血管平滑肌细胞的基因表达 ,在数量、范围和调控水平上有着很大的差异。提示在生理或病理情况下 ,血液流体力学的变化 ,可诱导血管平滑肌细胞基因在 m RNA表达水平出现不同的应力响应。     

Lovastatin对肝癌HepG2细胞作用后基因差异表达的初步研究

目的： 用cDNA芯片观察lovastatin作用前后HepG2细胞的差异表达基因。 方法： 20 μmol/L的lovastatin作用于HepG2细胞18 h，各提取实验组与对照组细胞总RNA，用cDNA直接标记法制备探针，进行杂交，杂交信号经扫描后，用软件分析基因表达情况。应用RT-PCR验证部分差异表达基因。 结果： Lovastatin作用后表达上调的基因有30个，表达下调的基因有11个，涉及信号转导、肿瘤免疫、细胞周期等方面，RT-PCR结果符合基因芯片结果。 结论： 用基因芯片筛选出的lovastatin作用后的肝癌细胞差异表达基因为深入研究他汀类药物的抗肿瘤机制提供重要的理论依据。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞基因表达谱的研究

目的 分析慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞差异表达基因，探索慢性乙型肝炎形成的分子机制。方法 应用含14000条人体cDNA的微阵列芯片和来自外周血单个核细胞的标记cDNA，分析了10例慢性乙型肝炎患者和10例健康人基因表达谱。通过应用GenePix 4000B扫描仪和ImaGene3．0分析软件比较cy5标记的慢性乙型肝炎来源cDNA与Cy3标记的健康人来源cDNA的杂交结果，获得个体基因的相对表达比值。结果 在分析的14000条基因中，差异表达的基因有92条，占0．66％。其中51条基因表达水平显著上调，41条基因表达水平显著下调。这些差异表达的基因主要为细胞信号转导，细胞周期和代谢，凋亡及炎症相关类基因。结论 在乙型肝炎病毒致慢性乙型肝炎过程中，涉及到了众多基因的差异表达，为进一步阐明慢性乙型肝炎形成的分子机制提供基础。     

去卵巢和雌激素替代治疗对心肌细胞基因表达谱的影响

目的：本实验通过高通量的cDNA微阵列技术，研究去卵巢和雌激素替代治疗对心肌细胞基因表达谱的影响，寻找雌激素的靶基因。方法:用 1 400 个基因构建的cDNA微阵列检测假手术组（Ⅰ）、去卵巢组（Ⅱ，去势组）和雌激素替代治疗组（Ⅲ，替代组）3组SD雌鼠心肌组织的基因表达差异,随机选2个基因用半定量RT-PCR验证检测结果。结果:假手术组和去势组共检出心肌差异表达的基因177个，其中去卵巢导致上调的基因91个，下调的基因86个；去势组和替代组共检出心肌差异表达的基因164个，其中雌激素替代治疗后导致上调的基因113个，下调的基因54个。Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅱ比较，相同的差异表达基因54个，雌激素明显影响心肌膜通道和载体（18个）、细胞受体（9个）、信号转导相关基因（7个）和细胞代谢（6个）的mRNA水平。而大部分基因（45个）是在去势组表达下调，在雌激素替代组表达上调。RT-PCR实验证实了cDNA微阵列结果 。结论：长期雌激素替代治疗明显影响心肌细胞膜通道和载体、信号转导、细胞受体和细胞代谢等相关基因的表达。长期雌激素替代治疗可通过增加Na+,K+-ATPase和Na+/H+交换蛋白的基因表达，稳定心肌细胞内Na+和K+的浓度。雌激素还可抑制多巴胺受体基因的表达，预防心肌肥大、充血性心衰等心脏疾病的发生。