小鼠胚胎干细胞饲养层制备条件的研究

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于分离克隆胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞).方法:取妊娠13.5～14.5d的胎鼠,采用组织消化法结合组织块培养法分离、培养小鼠成纤维细胞;MTT法测定细胞生长曲线,结合倒置显微镜观察筛选小鼠成纤维细胞饲养层的最佳种植密度;MTT法筛选丝裂霉素c作用的最佳浓度和时间.取妊娠3.5d的小鼠囊胚在经丝裂霉素C处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞生长情况.结果:组织消化法结合组织块培养法是分离培养小鼠成纤维细胞的较好的方法;1 × 105～2×105个/ml种植密度适于饲养层铺板;丝裂霉素c 10μg/ml作用3.5h或20μg/ml作用2.5h能抑制成纤维细胞增殖,细胞至少在7d内维持稳定的水平;妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成Es集落.结论:制备的胎鼠成纤维细胞饲养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长.     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的一些因素，以建立稳定的MEF培养体系。方法 取BALB／c小鼠胚胎分离成纤维细胞，利用体外培养体系，对MEF的生长形态，生长曲线及细胞周期进行观察，并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究。结果 13.5d胎龄鼠胚的MEF分离效果优于10.5d,18.5d胎龄鼠胚；MEF在体外为贴壁生长型细胞，第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下，0.25%胰酶消化MEF时间以3－5min为宜。结论 MEF在第3代增殖旺盛，最适宜作胚胎干细胞的饲养层。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制

目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系，用于分离和克隆胚胎干细胞研究。方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞，观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响，以及丝裂霉素C对细胞增殖的抑制作用；细胞增殖的数量用MTT法测定。结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12．5—14．5d；20℃-25℃时，用0．25％胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min；可在培养3—6d后进行传代。细胞冻存于-80℃3-4个月，复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg/10^5细胞，作用2-4h，可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d内不增殖也不死亡。结论 在合适条件下，小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养，并能多次传代和冻存；经丝裂霉素C处理后增殖受抑制，可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

 目的 为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hESc)体外培养系统,本实验欲用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts, hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法 利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞,纯化增殖细胞,采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc（HS181细胞株）接种在该饲养层上,连续传代至20代,倒置显微镜观察其形态学变化,测定其细胞碱性磷酸酶活性,类胚体形成实验及干细胞转录因子表达,严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice, SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。 结果 hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛,连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖,24h内能较好地保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代任能较好地保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子;悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体（Embryoid bodies, EB）结构, 可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达,证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞,说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示：将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论 hPFF可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。     

γ射线对ICR小鼠胚胎成纤维细胞的抑制作用研究

目的建立安全有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层体系,用于人胚胎干细胞的培养和研究。方法取ICR小鼠胚胎制备原代成纤维细胞,观察不同剂量的γ射线对成纤维细胞的抑制作用,用流式细胞仪分析MEF细胞周期的改变,用MTT测定细胞的数量。结果在30Gy剂量的γ射线条件下,能有效地抑制小鼠胚胎成纤维细胞的分裂,且不影响其活力。结论在合适剂量的Y射线照射下,能安全有效的抑制MEF的有丝分裂,为人胚胎干细胞的研究奠定基础。     

人胚胎干细胞饲养层培养体系的建立

目的建立人胚胎干细胞饲养层培养体系。方法以胎鼠和人胎儿为材料,以DMEM加15％FBS加0．1mM2ME为基础培养液,分别制备胎鼠和胎儿成纤维细胞饲养层。结果分别获得了传16代的胎鼠成纤维细胞和传7代的人胎儿成纤维细胞,建立了人胚胎干细胞饲养层的培养体系。结论胎鼠成纤维细胞和人胎儿成纤维细胞相比较,后者生长速度慢,且较易老化;胎鼠成纤维细胞饲养层更有利于人胚胎干细胞的生长;8～14d龄胎鼠最适宜制备人胚胎干细胞饲养层;在宣温条件下,以0．2％胰酶加0．04％EDTA为消化液处理原代胎鼠组织块时间以15～20min为宜。     

鸡胚胎干细胞饲养层培养体系的建立

采用孵化 8～ 1 2 d鸡胚 ,用胰酶消化 ,以含 1 0 % NBS的 DMEM溶液为培养液 ,分离获得鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,建立了培养鸡 ES细胞的饲养层细胞。经过 CEF酶活力法筛选 ,建立了 ES细胞的条件培养基 ,其组成配方为 1 0 % NBS、5 % FBS、 2 .5 %的鸡胚提取物 ,1× 1 0 6/ L m L IF,1 0μg/ L人 b FGF,40μg/ L伴白蛋白 ,0 .1 4mmolβ-ME的高糖DMEM。鸡类 ES细胞 (AKP阳性细胞 ,因未经遗传学和免疫组织化学鉴定 ,故称类 ES细胞 )在经丝裂霉素 -C处理的饲养层细胞上和条件培养基中可传至 9代仍保持良好的增殖能力和未分化状态。     

诱导性多潜能干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的制备小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts,MEFs）滋养层,用于诱导性多潜能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的体外培养。方法取13.5～15.5天胎龄的胎鼠,采用组织消化法分离原代培养成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线进行观察。采用10μg/ml丝裂霉素C预处理P2～P3代MEFs 2～3h制备出细胞滋养层,在该滋养层上进行iPSCs培养,观察iPSCs的集落生成情况,并行碱性磷酸酶细胞染色。结果 MEFs经丝裂霉素C预处理后细胞既不增殖,也不会死亡,仍保持分泌多种生长因子的能力。iPSCs在MEFs滋养层上生长良好,类似于胚胎干细胞一样能形成＂鸟巢＂状集落,并可维持iPSCs正常形态,抑制其分化而不影响活力,碱性磷酸酶染色阳性。结论利用诱导性多潜能干细胞滋养层方法制备的细胞滋养层,能有效支持iPSCs的生长,为进一步开展iPSCs的研究提供了理论依据和实验基础。     

体外培养获得稳定高效胚胎干细胞滋养层的实验研究

目的筛选并优化获得稳定的胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）滋养层细胞的来源及其体外培养的最佳条件,为胚胎干细胞体外存活提供必要条件。方法分别取人工流产胎儿皮肤组织、昆明小鼠孕12.5、14.5、18.5d胚胎和新生鼠（P0）组织,分离培养原代胚胎成纤维细胞（embryonic fibroblasts,EFs）并传代制成滋养层。采用活细胞拒染法和免疫细胞化学染色等技术,观察并比较两种来源以及不同时相来源制备的滋养层细胞的功能状态差异。结果细胞活性状态：①人胚来源第1～5代成纤维细胞活性均好;但1～2代时杂细胞较多,此后可见深染色细胞逐渐增多。②E12.5d、E14.5d鼠胚来源的各代细胞均较同代E18.5d和P0来源的活性细胞数目高（P〈0.05）。以E14.5d第3～6代细胞最易培养存活。P0来源第6代与E14.5d来源同代细胞相比,深染变形细胞增多达30%。细胞分泌功能：①人胚来源第3～5代细胞I型胶原蛋白免疫阳性细胞数目少且染色较淡。②鼠胚来源的以E12.5d、E14.5d、E18.5d的第3～6代细胞免疫阳性细胞数目最多,且染色深;P0来源第6代细胞免疫阳性细胞染色深浅不一。结论采用人胚胎来源的成纤维细胞的活性尚可,但分泌功能稳定性欠佳。鼠胚E12.5～18.5d来源的第3～6代成纤维细胞,具有细胞活性强、分泌功能旺盛的特点,是作为胚胎干细胞赖以存活滋养层的最佳选择。     

小鼠成纤维细胞饲养层的制备及C57BL/6小鼠胚胎干细胞系的建立

目的：制备小鼠成纤维细胞饲养层并建立C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ESC）系,为进一步建立人ESC系提供依据。方法：取妊娠12.5~14.5 d的胎鼠,组织消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）;收集C57BL/6小鼠3.5 d的囊胚培养于小鼠制作的饲养层上;分离内细胞团(ICM),扩增传代40代以上。观察ESC集落的生长情况。采用碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫组织化学早期胚胎特异性表面抗原(SSEA-1)、八聚体结合转录因子4(OCT-4)染色和体内分化实验对ESC集落进行鉴定。结果：分离培养后得到的ESC可稳定传代至40代以上,且均呈集落样生长。经AKP、SSEA-1和OCT-4染色后ESC均呈红褐色阳性表达,接种于裸鼠均可形成畸胎瘤;HE染色,有3个胚层组织成分。结论：成功建立了C57BL/6小鼠ESC系。     

胚胎干细胞诱导的内皮细胞对自身向成骨细胞分化的影响

目的探讨由胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）诱导的内皮细胞（endothelial cells,Ec）与自体胚胎干细胞联合培养时对ESCs成骨作用的影响。方法提取小鼠的胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞,诱导胚胎干细胞生成Ec,培养细胞分为四组。A组：胚胎干细胞诱导组;B组：胚胎干细胞诱导组;C组：胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞（Ec）诱导组;D组：ESCs和诱导的EC联合培养诱导组。通过干细胞形态的观察、免疫荧光、细胞的增值、碱性磷酸酶以及骨钙素含量的测定从酶学、组织学及生化学等不同方面观测骨髓基质细胞对胚胎干细胞向成骨细胞诱导转化的影响。结果通过细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。D组ESCs和诱导的Ec联合培养组MTT检测结果各组细胞生长差异没有显著意义（p〉0.05）,骨钙素和碱性磷酸酶测定D组有明显差异高于其他3组（p〈0.05）。结论以胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞对胚胎干细胞的成骨有明显的促进作用。     

以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较

目的:比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化.方法:分离、培养3～4 mo hELF,观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化,以STO细胞和hELF作为饲养层培养人EG细胞,计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)和抗阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4).结果:经丝裂霉素C处理后hELF较STO细胞生存时间明显长,形态维持更好;以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞,集落形成率没有明显差异;两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异.结论:在培养人EG细胞时,hELF饲养层较STO细胞饲养层更有优势.     

小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液的蛋白质组学初步分析

目的：运用双向电泳、质谱技术对小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件培养液进行蛋白质组学分析,寻找其中可能具有抑制分化作用的蛋白因子。方法：用60Co γ-射线照射昆明白小鼠胚胎成纤维细胞,制成饲养层,置于ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒钠盐）培养液中培养24h,收集条件培养液。用冷冻干燥、凝胶过滤层析、冷丙酮沉淀的方法从条件培养液中提取蛋白质样品,经双向电泳和银染得到双向电泳图谱,用Image master elite 2.0软件进行图像分析。取蛋白点进行酶解,再用CapLC-ESI-Q-TOF质谱进行分析,使用Mascot软件在NCBInr数据库中进行搜索。结果：双向电泳得到（221±67）个蛋白点的银染图谱,初步分析鉴定13个蛋白点。结论：昆明白小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液中含有β-半乳糖苷结合蛋白、半胱氨酸富集的酸性分泌蛋白（SPARC）等成分。     

Nesprin-1对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的影响

目的探讨nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的作用。方法采用悬滴-悬浮-贴壁三步法,5-氮杂胞苷(5-aza)与丹参共同诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞,用Western blot与免疫荧光技术检测nesprin-1蛋白表达水平和在分化成熟过程中的改变。同时利用RNA干扰(RNAi)技术抑制nesprin-1蛋白的表达:Ⅰ组(RNA干扰目的序列AAAGCCAAGCACGCAACTA),Ⅱ组(RNA干扰目的序列GGGAACCAACAGTGAGATT),Ⅲ组(RNA干扰目的序列ACCAGGACATTGCGTACTA),对照组(使用无意义的ShRNA干扰序列),观察对胚胎干细胞分化的影响。结果 Nesprin-1各亚型在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中的表达水平有所变化。RNAi后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和对照组心肌细胞分化率分别为(17.78±1.92)%、(36.67±3.34)%、(44.42±5.08)%和(77.78±1.92)%,各干扰组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),且各干扰组分化后心肌组织分化成熟的蛋白标志肌球蛋白(myosin)的表达量减少。结论 Nesprin-1在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中发挥重要作用,不同分子大小的nesprin-1亚型在此分化过程中可能有着不同的功能。