广谱炎症趋化因子抑制先导物P1肽的活性及功能分析

目的初步探讨广谱趋化因子抑制先导物P1肽的活性及功能,为过度炎症反应的负调控提供理论基础。方法 MTT法检测P1肽的细胞毒性后,选择合适的浓度,应用液相芯片技术、钙流实验、RT-PCR和ELISA等方法对P1肽的活性和作用特点进行分析。结果 CXC类的IL-8、IP-10以及CC类的MCP-1、MIP-1β炎症趋化因子的产生量在P1肽的作用下有明显下降,且这两类趋化因子mRNA的表达量均有明显下降,进一步的实验显示P1肽不通过TTP途径降解mRNA;同时较之LPS炎症模型组,P1肽作用下的细胞炎症因子TNF-α的分泌水平有明显下降。结论合成后的P1肽具有良好的生物学活性;P1肽的作用靶点可能存在于炎症因子产生的上游信号通路中,P1肽不仅能从趋化因子mRNA水平降低趋化因子的表达量,同时还可抑制TNF-α的产生,进而发挥炎症抑制作用。     

从噬菌体随机十五肽库中筛选类脂A模拟肽的研究

目的用具交叉保护性的针对类脂 A的单抗 (1B6 )筛选噬菌体十五肽库 ,旨在研究类脂 A的模拟肽。方法对噬菌体十五肽库进行亲合筛选 ,用噬菌体 EL ISA法鉴定阳性克隆。结果经 3轮筛选后 ,随机挑选 14个噬菌体克隆 ,做夹心EL ISA试验 ,其中 5个克隆显示较强的阳性结果。将上述 5个阳性克隆 DNA测序 ,序列均为 ACTCATTGGCATCAGTGGAGGCATCATCAGTTTCCTGCTCCTACT,相应的氨基酸序列为 THSHQWRHHQFPAPT。竞争性噬菌体 EL ISA的结果显示大肠杆菌 L PS和伤寒杆菌 L PS均可特异性抑制阳性噬菌体克隆与类脂 A抗体的结合。结论该噬菌体克隆展示肽具有 L PS表位的抗原性 ,且模拟了 L PS的共同部分类脂 A。     

噬菌体随机肽库筛选动脉粥样硬化相关多肽

目的 利用噬菌体展示技术筛选动脉粥样硬化疾病相关多肽,并验证所筛选的阳性噬菌体以及合成蛋白片段结合活性.方法 以动脉粥样硬化患者血清为靶分子,噬菌体12肽库亲和筛选与之结合的阳性噬菌体.经过3轮筛选,从滴度测定平板上随机挑取10个阳性克隆,ELISA鉴定其亲和性.提取阳性噬菌体单链DNA并测序得到12肽序列,通过生物信息学查找相似天然蛋白,合成24肽,最后鉴定其结合活性.结果 ELISA显示阳性噬菌体均与患者血清有较强的结合力,序列为GPRPPSAPNMPL,合成24肽也呈现出较高的结合活性.结论 噬菌体展示可以获得动脉粥样硬化相关多肽序列,为该病的免疫研究奠定了基础.     

利用噬菌体随机肽库筛选IL-5结合的相关多肽

目的：采用噬菌体随机肽库筛选人IL-5，以获得能高亲和力结合IL-5的相关多肽。方法：以重组人IL-5作为筛选分子，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选。经过三轮淘筛后，经夹心ELISA、竞争ELISA法进一步鉴定噬菌体克隆与IL-5的亲和力，对阳性克隆进行了扩增和DNA测序，据此推导结合随机多肽的氨基酸序列。结果：经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL-5呈高亲和力结合。通过测序和序列比较分析，发现CX1-2AS为相对保守的结合表位。结论：研究表明通过噬菌体肽库能够筛选到IL-5结合的相关多肽，为进一步研究IL-5结合表位及抑制剂奠定了基础。     

噬菌体随机肽库中乳腺癌肿瘤标志物的筛选

目的:利用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的肿瘤标志物。方法:以混合乳腺癌患者血清IgG作为筛选分子,对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选;3轮淘选后,应用常规ELISA鉴定噬菌体单克隆;阳性克隆经测序后,选择与乳腺癌血清结合活性最高的多个噬菌体的共有小肽序列来人工合成其相应的寡核苷酸序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,经诱导表达及纯化GST-小肽融合蛋白后,应用常规ELISA检测20例乳腺癌患者和20例正常人与GST-小肽的结合反应。结果:3轮筛选没有明显的富集现象,但获得38个可与乳腺癌患者血清反应,而不与正常人血清反应的阳性克隆。经扩大乳腺癌患者血清样本例数进一步检测后对8个结合活性始终较高的阳性克隆进行测序发现部分克隆序列相同;将其中结合活性最高的小肽序列P15与GST蛋白进行融合表达,并分别检测其与20例乳腺癌患者和正常人血清的结合反应,结果提示患者血清与GST-P15的反应明显高于正常人,差异有统计学意义(P0.01)。结论:筛选到的小肽P15可以特异结合乳腺癌患者血清中的抗体。该小肽为进一步寻找乳腺癌患者体内相应的肿瘤抗原奠定了一定的基础。     

用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫免疫原的模拟短肽

目的　从噬菌体随机 12肽库免疫筛选出大鼠对血吸虫天然抗性的模拟靶表位 ,探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。方法　用粗提大鼠血清IgG作固相配体筛选噬菌体 12肽库 ,按吸附 洗脱 扩增的淘洗过程进行 3轮筛选 ;随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性 ,并对其中的 2个克隆进行测序 ;用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,分别在 0、1、3周进行 ,第 5周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴 ,4 5d后剖杀冲虫 ,计虫数及肝卵数。结果　经 3轮筛选 ,特异性结合噬菌体富集增加了 2 0 0多倍 ,随机挑取 2 0个噬菌体克隆经ELISA鉴定 ,有 19个克隆能与大鼠血清呈特异性反应。自动测序仪测序的 2个克隆的序列与GenBank的已知序列无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 33.6 % ,减卵率为 5 9.8%。结论　利用噬菌体展示技术可获得天然抗血吸虫抗性的短肽 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫     

从噬菌体随机肽库筛选CD137结合肽

目的应用噬菌体随机七肽库筛选与人CD137特异结合的肽序列。方法以重组人CD137作为筛选分子，对噬菌体展示随机七肽库进行亲和淘选。经过5轮淘选后，共随机挑选23个噬菌斑并对其进行了扩增和测序，据此推导随机多肽的氨基酸序列。经夹心ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与CD137的结合力。^3H-TdR法检测了噬菌体展示多肽对抗CD137Ab刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应影响。结果5轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。通过对阳性克隆的测序和序列比较分析，得到RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF的相似序列和与CD137L具有同源SRS序列的SRSRVRY、HRRPSRS肽序列，ELISA结果显示这5个克隆都有良好的与CD137的结合力。RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF和SRSRVRY4个噬菌体展示肽均能在体外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴细胞增殖反应。结论通过对噬菌体随机肽库的淘选，得到与CD137结合的相关多肽，为进一步研究CD137与配体结合的特异性位点及其拮抗性多肽药物设计提供了实验依据和结构基础。     

利用体内噬菌体展示技术筛选及鉴定肺癌特异性结合肽

目的利用体内噬菌体展示技术筛选并鉴定与肺癌特异性结合的多肽。方法用肺癌细胞A549接种裸鼠复制荷瘤动物模型,将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min后取肿瘤组织中结合的噬菌体,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA初步鉴定噬菌体克隆对肺癌细胞的亲和力、特异性。将阳性噬菌体克隆扩增、测序获得外源多肽氨基酸序列,化学方法合成多肽,鉴定多肽对肺癌细胞和组织的亲和力、特异性。结果ELISA结果显示,随机挑选的20个噬菌体单克隆中,1个对A549具有很强亲和力。测序获得多肽,命名为zp2。化学合成多肽zp2。竞争抑制、细胞免疫荧光和组织免疫荧光实验结果表明多肽zp2与肺癌细胞A549及肺癌组织特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术筛选出与肺癌细胞A549特异性结合的多肽,为肺癌诊断及治疗药物的研制奠定基础。     

从噬菌体构象型7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽

目的 :从噬菌体构象型 7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽。方法 :用重组人BLyS筛选噬菌体构象型 7肽库 ,用间接ELISA、竞争ELISA和细胞增殖活性试验鉴定噬菌体克隆。结果 :经过 3轮亲和筛选 ,噬菌体的回收率增加 ,阳性克隆得到富集。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制BLyS刺激细胞增殖的活性。结论 :获得了噬菌体呈现的能够抑制BLyS的两个短肽。     

用噬菌体表面展示技术筛选与肝癌细胞系结合的抗体模拟肽

目的:从噬菌体展示肽库中,筛选可与肝癌细胞特异性结合的抗体模拟肽。方法:通过生物淘选使噬菌体富集。利用ELISA法,鉴定噬菌体单克隆原种的亲和性,并进行统计学分析。通过竞争ELISA,分析筛选所得抗体模拟肽的结合位点,并进一步分析抗体模拟肽的序列组成。结果:随着淘选次数的增加,出现噬菌体的富集。ELISA的结果显示,相对于正常肝细胞,筛选所得环状7肽对肝癌细胞系SMMC7721和BEL7402均有良好的结合活性(P<0.05),且与SMMC7721细胞的结合活性明显优于与BEL7402细胞的亲和性(P<0.05)。在α=0.01的水平上,7肽单克隆噬菌体原种可明显与scFv竞争结合SMMC7721细胞(0.005相似文献   

利用噬菌体肽库筛选抗黏附的活性多肽

目的 :筛选抗内皮细胞与单核细胞黏附的活性多肽。方法 :①以氧化型低密度脂蛋白 (ox LDL ,10 0mg/L)损伤的内皮细胞作为筛选的“靶”细胞 ,从XCX15肽文库 (X代表随机氨基酸 ,C为半胱氨酸 ,X15代表编码随机 15肽 )中 ,筛选能与受损内皮细胞特异性结合的多肽。②用ELISA法鉴定部分阳性克隆 ,经DNA序列测定确定其插入的氨基酸序列。③以计数法检测特异性噬菌体多肽对内皮细胞与单核细胞黏附率的影响。结果 :①从挑选鉴定的 14个克隆中 ,得到 6个阳性克隆 ,测序结果有两个克隆的外源多肽序列相同 ,4个克隆的外源多肽中含有亮氨酸 亮氨酸重复序列。②两个序列相同的克隆的噬菌体多肽 ,能明显降低内皮细胞与单核细胞的黏附率(分别降低 17.0 %和 17.6 % ,P <0 .0 1,n =4 )。结论 :从XCX15肽文库中 ,初步鉴定出 1个具有较明显地抗内皮细胞与单核细胞黏附作用的活性多肽     

噬菌体表达短肽模拟脂多糖类脂A表位的研究

目的：得到拟类脂Ａ的六肽。方法：用抗类脂Ａ的单克隆抗体筛选噬菌体随机六肽库,经四轮筛选后进行ＥＬＩＳＡ检测,用得到的１５个阳性克隆分别免疫小鼠,并将使小鼠产生抗ＬＰＳ抗体的１０个克隆进行测序,将保守序列进行肽合成。结果：得到保守序列为Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ,即ＫＦＳＳＲＸ。固相合成此小肽可与其１Ｂ６抗体结合,且此结合可被ＬＰＳ抑制。结论：此六肽可模拟脂多糖或类脂Ａ表位。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗呼吸道合胞病毒多肽的实验研究

目的：采用完整的呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV)颗粒筛选噬菌体肽库，以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽，方法：Hep-2细胞培养RSV，采用蔗糖密度梯度（30％、45％、60％）和超滤离心纯化病毒，病毒用生物素标记后，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选，经过3轮淘筛后，ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与RSV的亲和力，通过TCID50检测其抗病毒复制能力，选取与RSV具有高亲和力的阳性克隆进行DNA测序，据此推导多肽的氨基酸序列，结果：经鉴定得到13个阳性噬菌体克隆能与RSV呈高亲和力结合，其中3个克隆体外能明显抑制RSV的复制，使TCID50由10^－8．1SFU／ml分别降至10^-4.1、10^-4.3、10^3.8SFU/ml。DNA测序发现各个克隆之间缺乏明显的同源序列，但普遍含有较多的脯氨酸，结论：通过噬菌体肽库能筛筛选到抗病毒作用的阳性克隆，为进一步开发高效RSV的诊断和治疗试剂奠定基础。     

从噬菌体随机肽库中筛选拮抗IL-5的抑制多肽

目的　通过噬菌体随机肽库筛选与白细胞介素 5 (IL 5 )高亲和力结合的相关多肽 ,观察这些多肽是否能够抑制IL 5的生物功能。方法　以重组人IL 5作为筛选分子 ,应用M13噬菌体PⅢ呈现随机 7肽库进行筛选 ,经ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与IL 5的亲和力。阳性噬菌体克隆呈现多肽和人工合成多肽对IL 5介导的嗜酸细胞 (Eos)存活的影响。结果　经过 3轮淘筛后 ,经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL 5呈高亲和力结合 ,其中 3个具有抑制IL 5介导的Eos存活延长作用。选择抑制作用最强的呈现多肽进行人工合成 ,发现其中一个合成多肽能够诱导Eos凋亡 ,抑制IL 5介导的存活延长作用 ,但作用强度不如噬菌体呈现多肽。结论　通过噬菌体肽库能够筛选到抑制IL 5功能的相关多肽 ,为进一步研究抗IL 5的分子药物奠定了基础。     

利用噬菌体肽库筛选IL-2Rα模拟表位肽的研究

目的 筛选IL-2Rα模拟表位肽,为研制高效、特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础.方法 应用离子交换层析法从小鼠腹水中纯化抗人IL-2Rα单克隆抗体5G1,细胞ELISA方法检测其特异性.用5G1单抗筛选噬菌体环七肽库,并对噬菌体克隆进行抗原性鉴定.根据阳性克隆的DNA序列合成环肽并鉴定其生物活性.结果 经5轮筛选、鉴定,获得5个与5G1有较强结合特性的噬菌体阳性克隆.DNA测序并推导氨基酸序列,得到Lys-X-{X}-Lys-Gly保守序列.依此序列合成环七肽CP,小鼠淋巴细胞增殖试验证实其有免疫抑制活性.结论 环肽CP为IL-2Rα模拟表位肽,可作为IL-2Rα的拮抗剂发挥免疫抑制效应.     

HIV-1gp41核心结构模拟位的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定HIV-1 gp4l核心表位。方法：用识别HIV-1 gp41的构象特异性单克隆抗体NC-1筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、NC-1特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆，DNA序列分析阳性克隆。结果：经3轮筛选，随机挑取24个噬菌体克隆，ELISA鉴定表明有lO个克隆可与NC-1结合，DNA序列分析并推导氨基酸序列，共5种序列：HDVHHRWVYLLS、ITVNEWLYTSEQ、HGRSHGMFKPKR、MGPIARPHWHLN、DMYRSPRPKPDT。其中gp41N肽和C肽所形成的复合物可特异性阻断表达HDVHHRWVYLLS，VNEWLYTSEQ和MGPIARPHWHLN的克隆与NC-1的结合。结论：所得序列HDVHHRWVYLLS，VNEWLYTSEQ及MGPIARPHWHLN模拟HIV-1 gp41六螺旋束核心表位。     

交叉保护性抗LPS多克隆抗体的制备与LPS多表位模拟肽的筛选

目的 获得具交叉保护性的抗细菌脂多糖(LPS)多克隆抗体与模拟LPS多表位的噬菌体展示环肽克隆。方法制备具交叉反应性的兔抗鼠伤寒沙门菌抗血清，鉴定抗血清对大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击小鼠的交叉保护性。以亲和纯化的多克隆抗体为靶，亲和筛选噬菌体随机环七肽库。双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆。结果兔抗血清能与多种来源的LPS反应，对用大肠杆菌和铜绿假单胞菌攻击的小鼠有显著的保护性。用亲和层析纯化的多克隆抗体为靶分子进行3轮筛选，随机挑选46个克隆，其中20个克隆显示与多抗结合。鼠伤寒沙门菌LPS可抑制阳性噬菌体克隆与多抗结合，所有克隆的IC50(达到50％抑制率的LPS浓度)为125ng/ml。挑选其中10个克隆测序并推导氨基酸序列，其中5个克隆具X-QFYP-X-A保守序列；3个克隆具LFTFAHY序列；2个克隆具YQYYPAA序列，所有序列非极性氨基酸含量平均值为80．0％。结论获得能与多种LPS反应且具交叉保护作用的兔多克隆抗体，筛选得到可模拟鼠伤寒沙门菌LPS多表位噬菌体展示环七肽。     

应用噬菌体展示肽库筛选生殖支原体黏附蛋白的模拟表位

目的 利用纯化的兔抗重组生殖支原体黏附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb)从噬菌体展示随机12肽库筛选MgPa的模拟表位.方法 用纯化的兔抗rMgPa的pAb对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆进行DNA测序与分析,并用MIMOX对噬菌体克隆所展示的肽序列进行生物信息学分析.用ELISA、竞争性结合试验和Western blot检测噬菌体与pAb结合的特异性.结果 4轮生物淘洗后特异性噬菌体克隆得到了明显的富集.依据氨基酸组成的不同,74个噬菌体克隆所展示的肽序列可大致分为3组.经对肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析,结果表明这3组的核心序列分别为:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P、A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA、竞争性结合试验和Western blot方法检测的结果表明噬菌体能与pAb发生特异性结合,说明其可能是MgPa的模拟表位.结论 成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为研制基于Mg抗原表位的诊断试剂与多肽疫苗奠定了一定的实验基础.