实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

随着PCR(聚合酶链反应)技术的飞速发展,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、自动化和重复性好、定量准确、污染少等优点,成为分子生物学和其它领域的重要技术工具,并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断.本文就实时荧光定量PCR技术的主要原理、定量方法及目前在研究领域中主要的应用进行了概述.     

实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

实时荧光定量PCR(rea-l time fluorescent quantitative polymerase chain react ion,FQ-PCR)是是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。,它具有特异性强、PCR污染少、自动化程度高等特点。作者就实时荧光定量PCR技术的研究进展及目前肿瘤诊断、细胞因子分析及病毒感染的监测等方面进行了概述。     

荧光实时定量PCR的研究进展

生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。     

实时荧光定量PCR技术研究及其在医学领域的应用

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,FQ-PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本文综述了FQ-PCR技术的原理特点及其在医学领域中的应用和研究进展。     

实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR在肝炎尤其是乙型肝炎(乙肝)检测中的应用。方法:对450例急、慢性乙肝患者,采用经酶联免疫吸附试验检测血清,并按血清学标志分为三组,并对所用患者血清实时荧光定量PCR检测。结果:不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为95.95%、31.47%、52.20%,三组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:实时荧光栋梁PCR检测可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。但对于病毒非复制感染不能有效检测,不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。     

实时荧光定量PCR应用及实验条件优化

实时荧光定量PCR是在普通PCR基础上发展起来的新技术,在保持了PCR技术灵敏、快速、特异特点的基础上增加了定量的特点.在检测微小残留病变,肿瘤标志性基因及病毒负荷量等方面为临床医生判断病情,了解预后发挥着不可替代的作用.荧光定量PCR为科学发挥着巨大作用的同时,人们也不断对其实验条件进行优化,保证定量结果的准确.     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

实时荧光定量PCR技术理论研究及其在医学方面的应用

实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)是在传统PCR定性技术基础上发展起来的核定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

实时荧光定量PCR在念珠菌研究中的应用

念珠菌作为院内感染的常见机会性致病菌,实时荧光定量PCR技术已应用于念珠菌临床快速诊断、基因分型、耐药等研究。实时荧光定量PCR技术以灵敏、快速、安全、准确、高通量等特性,不仅在分子生物学领域作为常规的分析检测方法,而且在医院临床标本病原体的检测、遗传性疾病的诊断、检疫、法医学标本的鉴定等领域也逐步得到了广泛运用。     

新型HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒的应用

目的:观察新型HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒的临床应用价值。方法:采用荧光定量PCR检测法,用10份正常血清、10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证该试剂盒检测结果的重复性、特异性和灵敏度;并将该10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清结果与同时用传统方法所测结果进行配对检验。结果:10份正常血清标本均无假阳性HBV-DNA检测结果,特异性极好;灵敏度可达到103 IU/ml,重复性和准确性两者之间差异无显著性(t=1.15,P>0.05)。结论:该方法特异性和灵敏度高,方便、快捷,可替代传统试剂盒用于HBV的临床检测和科学研究。     

实时荧光定量PCR标准品的制备及应用

目的探讨并建立快速而准确用于实时荧光定量PCR标准品的方法.方法通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳,胶回收,T-A克隆,测序后,大量提取质粒,送公司定量.结果获得了预期希望的质粒.结论该方法能大量制备质粒标准品,在实验中取得较满意的效果.     

胃癌组织Twist基因的荧光实时定量PCR检测

目的探讨Twist基因在人胃癌组织、癌旁组织、胃癌转移灶组织中表达及临床意义。方法应用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板经逆转录合成cDNA，用实时荧光定量PCR的方法检测8例正常胃粘膜，27例胃癌原发灶，19例胃癌转移灶组织中Twist mRNA的表达情况并分析其与临床病理指标的关系。结果荧光实时定量PCR扩增结果显示，Twist基因在正常胃粘膜组织中表达量很低，而在原发性胃癌组、转移性胃癌组中均有较高的表达，原发性胃癌组织及腹膜转移组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织（P〈0．05）；Twist基因在淋巴转移组织中的表达与原发组中的表达差异显著（P〈0．05）。结论Twist基因在胃癌中过度表达可能促进胃癌的发生与发展，并与胃癌转移密切相关，又可能成为预测胃癌转移潜能的分子基础。     

实时荧光定量PCR技术诊断肺结核的meta分析

目的系统评价实时荧光定量PCR技术对肺结核的诊断价值并作meta分析。方法检索Pubmed,EMBASE,BIOSIS,Web of Science以及维普、万方、中国知网、中国医学生物文献数据库。按照Cochrane协作网推荐的诊断试验纳入标准筛选文献,纳入的文献采用QUADAS进行质量评价,用MetaDisc 1.4进行meta分析。结果符合标准的共有21个研究,各研究间存在异质性,但不存在阈值效应。合并后的诊断优势比为105.32,敏感度为0.64,特异度为0.96,阳性似然比为19.79,阴性似然比为0.31。SROC曲线的AUC面积为0.9816,Q＊指数为0.9402。结论荧光定量PCR技术检测结核分枝杆菌有着较高的敏感性和很强的特异性,可作为临床肺结核诊断的重要辅助手段,但并不能完全取代痰涂片检查。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值

目的: 探讨实时荧光定量PCR(F Q-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值。方法: 采用FQ-PCR方法检测196例患者血清中HBV-DNA。结果: 112例HBeAg(+)/HBeAb(-)标本中FQ-PCR均阳性,HBV-DNA拷贝数1.08×107/ml;68例HBeAg(-)/HBeAb(+)标本中,平均拷贝数6.12×105/ml,其阳性率为66.2%;16例HBeAg(-)/HBeAb(-)标本中,平均拷贝数为2.72×104/ml。结论: 实时FQ-PCR可以实现准确定量,是了解HBV在体内复制和判断疗效的有利手段。     

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

检测限是检测方法的重要性能指标,用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例,计算可知,一次抽样反应管的检测结果≥4时,才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知,1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368,结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996,而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997;而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。     

实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用及价值.方法:以我院确诊为结核病且未经治疗的患者392 例作为实验组,同时选取健康体检人群100 例作为对照组.分别对两组患者取静脉血,并对其血浆中结核分枝杆菌DNA 采用实时荧光定量PCR 法进行检测,同时对实验组患者进行痰涂片检查.结果:对照组患者实时荧光定量PCR 法检测全为阴性;实验组患者采用痰涂片检查,结果显示有80 例为阴性,其实时荧光定量PCR 法检测结果显示,痰涂片阳性的患者全为阳性,其阴性患者中有24 例为阳性,在对阳性患者抗痨治疗后有12 例患者转为阴性.实验组患者MTB DNA 为1.76×109 copies/mL.结论:本实验表明结核患者血浆中存在MTB DNA,采用实时荧光定量PCR 法可有效的对痰涂片阴性以及无痰患者进行诊断,有较好的利益价值.     

使用实时荧光定量PCR解析婴儿肠道双歧杆菌构建规律

目的 通过非培养的分子生物学方法检测婴儿早期肠道双歧杆菌的菌种组成及其数量变化,解析婴儿肠道双歧杆菌种群构建及菌种组成变化的规律及其可能的影响因素。方法 收集2013年3~4月16例正常足月新生儿第1次,第2、4、7、10、14、28天,3个月,6个月,1岁共10次粪便,使用实时荧光定量PCR和双歧杆菌属及种特异性引物对收集的粪便中的双歧杆菌属及人体肠道特有的8个双歧杆菌菌种进行定性及定量分析。结果 共收集婴儿粪便样品136份,双歧杆菌检出率为93.4%（127/136）,湿便中菌数为10 ⁵~10 ¹¹ CFU/g;第1次胎便双歧杆菌检出率为83.3%（湿便中菌数约为10 ⁵ CFU/g）;出生后14 d内双歧杆菌检出率及菌量在相对低的水平,被检出的双歧杆菌为1种或2种;出生28 d及以后双歧杆菌检出率增至100%,湿便中菌量增至10⁸ CFU/g以上;出生后28 d至6月龄多数婴儿、1岁时全部婴儿粪便中被检出双歧杆菌增至3种;双歧杆菌各菌种的检出率为B. breve (92.1%）、B. infantis（66.1%）、B. catenulatum（59.8%）、B. bifidum（25.2%）、B. longum（24.4%）、B. dentium（13.4%）、B. angulatum（5.5%）、B. adolescentis（1.6%）。结论 受试婴儿出生后到１岁其肠道双歧杆菌数量、菌种组成及其菌种多样性均随时间出现显著的变化,是受试婴儿肠道双歧杆菌种群构建的重要时期;同时发现受试婴儿双歧杆菌的菌种群构建整体上延迟、菌种组成上出现异常,推测是和受试婴儿的生产方式、喂养情况及其他各种环境因素密切相关。     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平

目的探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌乒,以表达的方法。方法以BB270femA基因表达为标准,建立实时荧光定量PCR方法,对实验菌株femA表达进行相对定量。结果建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好,熔解峰单一。随MIC变化,金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。     

实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BK病毒感染

目的:建立肾移植术后患者尿液和外周血BK病毒(BKV)感染负荷的实时荧光定量PCR检测方法,并初步探讨其临床应用价值.方法:构建含有BKV VP1蛋白保守区核苷酸序列片段的质粒作为外参照品,采用TaqMan荧光探针检测技术,建立定量检测BKV DNA方法;并对112例肾移植术后患者,40例正常体检者的尿液和外周血标本BKV含量进行检测.结果:本研究建立的BKV实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异度及重复性较好,定量PCR方法最低检测下限为8×102copy/ml,测量批内差异为0.54%～3.78%,批间差异为0.62%～4.58%.112例肾移植术后患者尿液和外周血BKV DNA的检测阳性率分别为27.7%和11.6%,BKV DNA阳性者尿液和外周血BKV中位数水平分别为8.2×104copy/ml和2.4×103copy/ml.40例正常人BKV尿液和外周血阳性率为2.5%和0%;与正常体检者相比,肾移植术后患者尿液及外周血BKVDNA阳性率及水平明显升高(P＜0.01).尿液BKV阳性率较外周血明显升高(P=0.02),但尿液和外周血中BKV含量无明显相关性.结论:实时荧光定量PCR检测肾移植患者术后BKV感染方法简便、可靠、准确,为进一步研究BKV感染与肾移植术后移植物丢失的关系奠定了基础.